Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
Under hjerte udvikling, dannelsen af myokardisk-specifikke strukturelle og funktionelle enheder, herunder sarkomerer, kontraktile myofibriller, interkalerede diske og costameres kræver koordineret samling af flere komponenter i tid og rum. Forstyrrelser i samlingen af disse komponenter medfører udviklingsmæssige hjertefejl. Immunfluorescensfarvning teknikker anvendes almindeligvis i dyrkede cardiomyocytter at probe myofibrillære modning, men denne ex vivo fremgangsmåde er begrænset af det omfang, hvori myocytter fuldt ud differentiere i kultur, mangel på normale in vivo mekaniske indgange, og fravær af endokardiale signaler. Anvendelse af immunofluorescensteknikker til studiet for at udvikle mus hjerte er ønskelig, men mere teknisk udfordrende, og metoder ofte mangler tilstrækkelig følsomhed og opløsning for at visualisere sarkomerer i de tidlige stadier af hjerte udvikling. Her beskriver vi en robust og reproducerbar metode til at co-immunofarvningsprocedure multiple proteiner eller til at co-visualisere et fluorescerende protein med immunfluorescensfarvning i embryonale mus hjerte og bruge denne metode til at analysere udviklingslandene myofibriller, interkalerede diske og costameres. Denne fremgangsmåde kan yderligere anvendes til at vurdere cardiomyocyte strukturelle ændringer som følge af mutationer, der fører til udviklingsmæssige hjertefejl.
Under udvikling, begynder hjerte sammentrækninger snart efter kardiomyocytter migrere til midterlinjen og danne den lineære hjerte rør 1,2. Den sarkomer er den grundlæggende kontraktile enhed i cardiomyocyte; dette velorganiseret cytoskeletal struktur indeholder actinfilamenter forankret til Z-disken ved sarcomerisk α-actinin (s-α-actinin) og myosin fibre forankret til M linje (figur 1). Som cardiomyocyte modnes, sarkomerer samles i serie til dannelse af myofibriller som strækker sig over cellen. Myofibriller er forankret til enderne af cardiomyocyte af det indlejrede disk, celle-celle-forbindelsesepitop struktur, der indeholder et overgangs- krydset med en delmængde af Z-disc elementer såsom S-α-actinin 3, adherens junction proteiner, såsom N-cadherin og β catenin, gap junction proteiner og desmosomer (figur 1) 4. Langs den langsgående membran, Z-diske af perifere myofibriller ogsåtillægger cellemembranen via costameres; disse specialiserede fokale adhæsioner give et anker mellem myofibrillære, plasmamembran og ekstracellulære matrix for at tilvejebringe yderligere strukturel støtte til cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidligt i hjertet udvikling, er kardiomyocytter arrangeret i finger-lignende fremskrivninger kendt som trabekler der stikker ind i det ventrikulære rum og indeholder relativt modne myofibriller 5. Som hjerte for udvikling skrider frem, de kardiomyocytter i sub-epikardial region formere til at danne den kompakte myokardiet, der omfatter de ventrikulære vægge, men sarkomer og myofibrillære samling er forsinket i forhold til trabekulær myocardium 5,6.
Vis alle modeller af sarkomer og myofibrillære samling kommer i høj grad fra immunofluorescens undersøgelser på dyrkede cardiomyocytter 7-10, som er ligetil, men mangler et tredimensionelt miljø, blodgennemstrømning og kontakter med andre hjerte-celles til stede in vivo. høj opløsning strukturelle undersøgelser under anvendelse af immunofluorescens i mus embryonale hjerte er teknisk udfordrende, og få undersøgelser har udforsket fremkomsten af interkalerede diske og costameres under mus hjerte-udvikling. Den adherens krydset protein β catenin synes at lokalisere til interkalerede diske ved embryonale dag (E) 17,5 11, N-cadherin lokaliseres til lineære strukturer, der kan repræsentere interkalerede diske ved E18.5 12 versus postnatal dag 0 13, og costameres er blevet påvist ved E18.5 14, men disse proteiner viser diffus og mere kontinuerlig membran fordeling på tidligere udviklingsmæssige tidspunkter 11-13.
Her beskriver vi en enkel og reproducerbar metode til immunfarvning og fluorescens mikroskopi af sektioneret muse embryonale hjerter, der giver mulighed for detaljeret analyse af myofibrillære og cardiomyocyte udvikling, herunder fremkomsten af intercalaTed diske så tidligt som E12.5 og vordende costameres ved E16.5. Denne protokol kan være nyttig til sondering af virkningerne af mutationer på sarkomer dannelse samt myofibrillære og cardiomyocyte modning.
Den optimale vævsfiksering teknik og fortynding skal bestemmes empirisk for hvert antistof. I vores hænder, snap-frysning er overlegen i forhold til PFA fiksering flere cardiomyocyte antigener, herunder s-α-actinin, β-catenin, β1-integrin, tropomyosin, Tallinn (ikke vist) og N-cadherin; i modsætning PFA fiksering giver overlegne resultater for fokal adhæsion kinase (ikke vist). De protein tværbindinger dannet af PFA kan maskere epitoper og begrænse antistofbinding; antigen hentning kan være påkrævet i sådanne tilfælde, og metoder til antigen hentning kan findes andre steder 20. PFA koncentration eller længden af fiksering kan reduceres for at reducere epitop maskering, med optimale betingelser empirisk for hvert antistof og ved hvert udviklingsstadium. Passende negative kontroller bør anvendes, når der kendetegner en ny antistof eller hjerte-mutant, herunder præimmunserum som det primære antistof kontrol og et "nej primært antistof" control. Anvendelse af knockout-mus er en ideel negativ kontrol men tidlig dødelighed forhindrer deres anvendelse til mange af de genprodukter undersøgt her.
Anvendelse af passende mængder til helt dykke eksperimentelle og kontrolglas i samme immunofluorescens blokering, antistof og vaskeopløsninger var vigtig, da var blid vuggende af dias under inkubation at sikre en ensartet eksponering af sektionerne til løsningerne. Denne fremgangsmåde minimeres teknisk variabilitet i farvning mellem afsnit og dias inden et eksperiment. Når omkostninger begrænser løsning volumen antistoffet Brug en Pap pen til at begrænse strømmen af løsninger ud over vævssnit og holde dias i et fugtigt kammer under lange inkubationer. Hvis et monoklonalt muse primært antistof – og dermed et anti-muse-sekundært antistof – der bruges, vil et andet blokerende trin til dækning endogene muse immunglobuliner være nødvendigt (trin 3.4) for at reducere ikke-specifik baggrund signal.
Passende mikroskopi og billedbehandling teknikker er afgørende for at opnå biologisk præcise oplysninger 21. Intensiteten histogram viser fordelingen af pixels ved hvert intensitetsniveau (0-65.535 niveauer for en 16-bit billede) for hver farve. Baggrund, kan lysstyrke og kontrast justeres ved at indstille en intensitet display område, der flankerer histogrammet peak; at foretage valide sammenligninger mellem forhold, skal de samme indstillinger mellem kontrol og eksperimentelle betingelser anvendes.
Denne protokol giver en pålidelig metode til at analysere cardiomyocyte modning og udvikling i det native embryonale mus hjerte. Mens immunfluorescens af cardiomyocyte-specifikke proteiner ofte bruges til at markere kardiomyocytter under udviklingen, få undersøgelser beskæftiger teknikker, der tillader høj opløsning analyse af myofibrillære struktur og fremkomsten af interkalerede diske og costameres 12-14,22,23. Denne teknik kan anvendes i vIvo vurdering af mutationer, der forårsager udviklingsmæssige hjertefejl, som et middel til at identificere ændringer i cardiomyocyte modning, der kan kaste lys over mekanismerne for strukturelle abnormiteter.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |