Abstract
أثناء نمو القلب، وتوليد وحدات عضلة القلب محددة الهيكلية والوظيفية بما في ذلك sarcomeres، اللييفات العضلية مقلص، وأقراص مقحم، وcostameres يتطلب التجمع المنسق لمكونات متعددة في الزمان والمكان. اضطراب في تجميع هذه المكونات يؤدي إلى عيوب القلب الخلقية. وتستخدم تقنيات تلطيخ مناعي عادة في العضلية مثقف للتحقيق النضج ميوفيبريل، ولكن هذا النهج خارج الحي محدودة من قبل إلى أي مدى سوف myocytes تفرق تماما في الثقافة، ونقص المدخلات الطبيعية في الجسم الحي الميكانيكية، وغياب العظة الشغافية. تطبيق تقنيات المناعي لدراسة وضع الماوس القلب هو مرغوب فيه ولكن أكثر تحديا من الناحية الفنية، وأساليب غالبا ما تفتقر حساسية كافية وقرار لتصور sarcomeres في المراحل الأولى من التنمية القلب. هنا، نحن تصف طريقة قوية وقابلة للتكرار للمشاركة في immunostain موالبروتينات ltiple أو للمشاركة في تصور بروتين فلوري مع تلوين مناعي في قلب الفأر الجنينية واستخدام هذه الطريقة لتحليل اللييفات العضلية النامية، أقراص مقحم، وcostameres. هذه الطريقة يمكن تطبيقها أيضا على تقييم التغيرات الهيكلية cardiomyocyte التي تسببها طفرات تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية.
Introduction
خلال التنمية، وانقباضات القلب تبدأ قريبا بعد العضلية تهاجر إلى خط الوسط وتشكل الخطي أنبوب القلب 1،2. وsarcomere من وحدة مقلص الأساسية داخل cardiomyocyte. هذا الهيكل هيكل الخلية درجة عالية من التنظيم يحتوي على خيوط الأكتين ترتكز على Z-القرص الساركومير α-actinin (S-α-actinin) والألياف ميوسين ترتكز على خط M (الشكل 1). كما نضوج cardiomyocyte، sarcomeres تجميع في سلسلة لتشكيل اللييفات العضلية التي تمتد عبر الخلية. ترتكز اللييفات العضلية إلى أقاصي cardiomyocyte بواسطة القرص مقحم، وهيكل موصلي خلية خلية التي تحتوي على مفترق الانتقالي مع مجموعة فرعية من عناصر Z-القرص مثل S-α-actinin 3، الملتصقة البروتينات مفرق مثل N-كادهيرين وكاتينين β، والبروتينات الفجوة مفترق طرق، وdesmosomes (الشكل 1) 4. على طول الغشاء الطولي، وZ أقراص من اللييفات العضلية المحيطية أيضانعلق على غشاء الخلية عبر costameres. توفر هذه الالتصاقات البؤرية المتخصصة مرساة بين ميوفيبريل، غشاء البلازما، والمصفوفة خارج الخلية لتوفير الدعم الهيكلي إضافية إلى cardiomyocyte (الشكل 1) 4. في التنمية القلب في وقت مبكر، ويتم ترتيب العضلية في التوقعات تشبه الإصبع المعروفة باسم الترابيق التي تبرز في الفضاء البطيني ويتضمن myofibrils ناضجة نسبيا 5. مع استمرار التطور القلب، والعضلية في منطقة جنوب النخابية تتكاثر لتشكيل عضلة القلب المدمجة التي تضم جدران البطين، ولكن يتم تأخير قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل بالمقارنة مع عضلة القلب تربيقي 5،6.
نماذج من قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل تأتي إلى حد كبير من الدراسات المناعي على العضلية مثقف 7-10، التي هي واضحة ولكنها تفتقر بيئة ثلاثية الأبعاد، وتدفق الدم، والاتصالات مع خلية أخرى في القلبحاضر في الجسم الحي. الدراسات البنيوية عالية الدقة باستخدام المناعي في قلب فأر الجنينية هي صعبة من الناحية الفنية، واستكشفت دراسات قليلة على ظهور أقراص مقحم وcostameres خلال الماوس تنمية القلب. البروتين الملتصقة تقاطع β كاتينين يبدو أن توطين على أقراص مقحم بعد يوم الجنينية (E) 17.5 11، N-كادهيرين يموضع إلى الهياكل الخطية التي قد تمثل أقراص مقحم من قبل E18.5 12 مقابل يوم بعد الولادة 0 13، كما تم الكشف عن costameres في E18.5 14، ولكن هذه البروتينات عرض توزيع غشاء منتشر وأكثر مستمر في وقت سابق النقاط الزمنية التنموية 11-13.
هنا، نحن تصف طريقة واضحة وقابلة للتكرار لالمناعية والمجهري مضان من الفأر مقطوع قلوب الجنينية التي تسمح لتحليل مفصل لميوفيبريل والتنمية cardiomyocyte، بما في ذلك ظهور intercalaتيد أقراص أقرب وقت E12.5 وcostameres الوليدة في E16.5. قد يكون هذا البروتوكول مفيد لبحث آثار الطفرات على تشكيل قسيم عضلي وكذلك ميوفيبريل وcardiomyocyte النضج.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام UCSF المؤسسي.
1. الحفظ بالتبريد والتثبيت من الجنينية الماوس قلوب.
1.1) أداة إضافية تجميد قلوب الجنينية
- ملء طبق بتري 3.5 سم و 7 ملم cryomolds مع الأمثل قطع درجة الحرارة (OCT) المتوسطة (انظر الجدول مواد). في غطاء الكيميائية، تبرد 2-methylbutane في النيتروجين السائل.
- الاستغناء 30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 10 سم بتري أطباق، 10 مل من برنامج تلفزيوني إلى 3.5 سم أطباق بتري، وإخضاع كافة أطباق بتري على الجليد. إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من 3.5 سم أطباق في الماوس حاملا.
- عزل الأجنة كما هو موضح سابقا 15، وأداء تشريح في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- لفترة وجيزة، الموت ببطء الأنثى الحامل باستخدام CO 2 الخدر وخلع عنق الرحم.
- إجراء شق في البطن، تشريح خارج الرحم عن طريق خفض السفن منظمة العمل العربيةنانوغرام انحناء الداخلي للرحم، ونقل الرحم إلى 10 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- قطع الرحم بين كل الجنين ونقل للفرد 3.5 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. عزل كل جنين كما هو موضح 15.
- فتح تجويف التامور باستخدام ملقط غرامة، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية عن طريق خفض في الشريان الأبهر، الوريد الأجوف السفلي، والأوردة الرئوية، ونقل إلى 3.5 سم بتري تحتوي على OCT الطبق.
- السماح قلب تتوازن في أكتوبر لعدة ثوان، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب.
- وضع بلطف القالب إلى سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane. والحرص على عدم السماح 2-methylbutane السائل للمس أكتوبر أو القلب. تجميد حتى أكتوبر صلبة بيضاء، ثم نقل القالب إلى دلو الثلج التي تحتوي على الثلج الجاف. الانتقال إلى الجنين المقبل.
- WRا ف ب cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning.
1.2) البديل: امتصاص العرق (PFA) تحديد، cryoprotecting، وأكتوبر تضمين قلوب الجنينية
- ملء الآبار من 12 بئر الأنسجة لوحة الثقافة مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X.
- تشريح خارج قلوب الجنينية كما هو موضح في 1.1.3. وضع كل القلب إلى تحتوي كذلك 4٪ PFA وإصلاح في 4 درجات CO / N.
- Cryoprotection: باستخدام ماصة نقل البلاستيك، وتتحرك كل قلب لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 1.5 مل من 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N ). نقل كل قلب إلى 1.5ml تحتوي على 1.5 مل أنبوب microcentrifuge من 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية مرة أخرى حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N).
- باستخدام ماصة نقل البلاستيك، ضع قلب cryoprotected في أكتوبر والسماح لها تتوازنلعدة دقائق لإزالة السكروز الزائد، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب.
- تجميد القلب في أكتوبر عن طريق وضع القالب في أي سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane أو الثلج الجاف.
- التفاف cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning.
2. Cryosectioning
- ضبط درجة الحرارة إلى -17 ناظم البرد درجة مئوية.
- مكان cryomolds في غرفة ناظم البرد وتتوازن إلى درجة حرارة لمدة 15-20 دقيقة.
- عكس cryomold واستخدام ضغط لطيف لطرد كتلة القلب من العفن. توجيه الجدار الأمامي من القلب إلى الجزء العلوي من كتلة الأنسجة مصبوب.
- وضع قطرة كبير من أكتوبر على تشاك، وجبل كتلة القلب على انخفاض أكتوبر لتجميد على تشاك. الحفاظ على التوجه مثل أن الجدار الأمامي للقلب هو أبعد من تشاك.
- تحميل تشاك والتي شنت انهكتلة الفن على حامل الكائن ناظم البرد. ضبط بحيث تكون زاوية من النصل هو 3-5 درجة بالنسبة للعينة.
- جمع 10 ميكرون أقسام على الشرائح المجهر التي تم علاجها قبل مع طلاء موجبة الشحنة (انظر الجدول مواد). السماح ليجف تماما قبل تخزينها في -80 ° C.
3. المناعي
- لأقسام الإضافية المجمدة، وإصلاح الأنسجة وpermeabilize في الأسيتون لمدة 10 دقيقة في غطاء الدخان في RT.
- لأقسام الإضافية المجمدة وPFA الثابتة، واحتضان في برنامج تلفزيوني-0.1٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة لإزالة أكتوبر وpermeabilize أقسام PFA الثابتة.
- كتلة لمدة 45 دقيقة في 1X عازلة تمنع، مخففة في برنامج تلفزيوني.
- إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية ولدت في الماوس، واحتضان في حمار أو الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) أحادي التكافؤ فاب شظية المخفف 1: 100 في برنامج تلفزيوني-0.1٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة في RT (انظر مناقشة).
- احتضان في الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخفف في 1X عازلة تمنع لمدة 2 ساعة على RT أوO / N عند 4 ° C (انظر جدول المواد / معدات التخفيفات محددة).
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT.
- احتضان في اليكسا الضد الثانوية فلور مترافق المخفف 1: 500 في عرقلة العازلة لمدة 2 ساعة على RT، محمية من الضوء.
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT، محمية من الضوء.
- اختياري: احتضان في هويشت صبغ المخفف 1: 2،000 في برنامج تلفزيوني في RT (محمية من الضوء) لتسمية نوى، ثم شطف مع برنامج تلفزيوني.
- ما بعد الإصلاح وصفت المقاطع في 1٪ PFA لمدة 1 دقيقة في RT.
- جبل الشرائح في مكافحة تتلاشى المتوسطة (مع دابي إن لم يكن وصفت نوى بالفعل) عن طريق وضع قطرتين من المتوسط على كل نهاية الشريحة ثم يغطى مع ساترة. ختم coverslips مع طلاء الأظافر. متجر محمية من الضوء في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة.
4. متحد البؤر التصوير وتحليل الصور
- بدوره على الأطوال الموجية المناسبة ليزر، وكاميرا، ومتحد البؤر المجهر المؤتمر الوطني العراقيluding المرحلة المحرك و z السيارات. اطلاق برنامج برامج التصوير. استخدام 405، 488، و 561 موجات الليزر لتصوير Hoechst-، اليكسا 488-، واليكسا أقسام 568-الملون، على التوالي.
ملاحظة: انظر الجدول مواد لدينا الأجهزة والبرمجيات المواصفات. - جبل الشريحة التحكم (ساترة إلى أسفل لمجهر مقلوب) على المسرح الشريحة.
- باستخدام الهدف 4X (انظر الجدول المواد)، والعثور على عينة ومجال الاهتمام. التقاط صورة لاستخدامه كقاعدة الخريطة عندما التصوير في تضخم عالية.
- إزالة الشريحة، مما يجعل الحد الأدنى من التعديلات على مرحلة الشريحة. تغيير في الهدف الغمر 60X النفط (انظر الجدول المواد)، ووضع قطرة صغيرة من الزيت على الهدف، واستبدال الشريحة (ساترة لأسفل) على خشبة المسرح الشريحة.
- البحث عينة مرة أخرى. تعيين قوة الليزر، وقت التعرض، وbinning إلى المستوى المطلوب لكل قناة.
ملاحظة: نحن نستخدم بشكل عام قوة الليزر 0.8، وقت التعرض كاميرا من 100 ميللي ثانية، وbinning من 2 (SEالمواد الإلكترونية الجدول للمعدات والبرمجيات مواصفات)؛ تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل تجربة الإعدادات المثلى.- مرة واحدة يتم تحديد الإعدادات المثلى، استخدم نفس الإعدادات لجميع أقسام الأنسجة داخل التجربة. استخدام الرسم البياني كثافة الإشارة إلى مدى شدة الأمثل لكل قناة (وسوف تستخدم هذه المعلومات لتحليل).
- توليد كومة من الألف إلى الياء باستخدام وظيفة الشراء: اختيار القنوات المناسبة ليزر، ثم اختيار الحدود العليا والدنيا للض المكدس. اختر من الالف إلى الياء حجم الخطوة كومة التي هي واحدة نصف قيمة سمك شريحة البصرية التي يقدمها البرنامج. انقر على "تشغيل" لجمع الصور.
- استخدام فيجي 16 أو برنامج مماثل لتحليل الصور. داخل فيجي، افتح الملف كومة Z لون مخصص خيار الوضع والقنوات تنقسم إلى نوافذ منفصلة مع. فتح "ضبط السطوع / التباين" أداة من صورة القائمة المنسدلة. داخل كل قناة، قوآخرون والأمثل مجموعة كثافة الرسم البياني يحدد في 4.5.1. تطبيق هذه النطاقات قناة لجميع مداخن ض يجري تحليلها.
- دمج القنوات الفردية في صورة مركبة واحدة باستخدام -الصورة> القائمة المنسدلة اللون.
- إنشاء ض كومة بالارض من الصورة المركبة باستخدام -الصورة> Stacks-> القائمة مشروع ض. هذه الصورة ستكون أكثر إشراقا بكثير من صورة 3D. ضبط مجموعة كثافة الرسم البياني للالعينة الضابطة لتجنب oversaturation، وتطبيق نفس الإعدادات لالتجريبية بالارض ض المكدس.
- لتوليد صورة 3D، استخدم لأول مرة -الصورة> Stacks-> القائمة مشروع 3D 17. اختر إما محور س أو ص محور الدوران. تعيين تباعد شريحة كما نفس العدد من ميكرون ويبلغ حجم ض خطوة المكدس. اختيار دوران إجمالي المطلوب وتعيين زيادة زاوية دوران إلى 1. ثم افتح صورة J عارض 3D من الإضافات القائمة المنسدلة. اختيار صورة مركبة ولدت في 4.8، كما عرض الحجم، وإعادة تعيينأخذ العينات عامل إلى 1 أو 2.
Representative Results
الأرقام من 2 إلى 6 مشاهدة النتائج النموذجية للمشاركة في تلطيخ للبروتينات مختلفة في القلب المفاجئة المجمدة والثابتة الأسيتون. الأجسام المضادة ضد S-α-actinin المسمى بتكاثر Z-الأقراص والأقراص مقحم مع خصوصية عالية والحد الأدنى من الخلفية (أرقام 2A، 3A، 4A، 5A، 6A، و6C)؛ يدل الشكل 6 أن المضادة للماوس مفتش (H + L) أحادي التكافؤ فاب شظية كتل فعال الماوس الذاتية مفتش ملزمة من قبل الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس. الأجسام المضادة ضد البروتين الملتصقة تقاطع β كاتينين ملزمة غشاء كلا العضلية والخلايا غير cardiomyocyte، وشارك في التعريب مع S-α-actinin حدث في أقراص مقحم يفترض في E16.5 (الشكل 2C وD)، كما هو متوقع من β نمط كاتينين تلطيخ في قلب الكبار 18. β1 إنتغرين المناعي في قلب الجنينية يمثل تحديا خاصة وغالبا ما يفشل لتحديد الالتصاقات البؤرية 14، ولكن β1 تلطيخ إنتغرين في هذه الدراسات كشفت إشارة على نفس الوتيرة الزمنية كما وصفت S-α-actinin-Z-الأقراص، وربما يعكس costameres الوليدة في تشكيل E16.5 (الشكل 3D).
في E12.5، S-α-actinin والتروبوميوزين (قسيم عضلي رقيقة بروتين خيوط) كشف المناعي نمط تلطيخ مع دورية منتظمة في العضلية تربيقية تتفق مع اللييفات العضلية الناضجة في هذه الخلايا (أرقام 4A و 5A ل s-α-actinin، الشكل 4B لالتروبوميوزين). تلطيخ N-كادهيرين في العضلية تربيقية في قلوب E12.5 تميل إلى colocalize مع مجالات مكثفة S-α-actinin تلطيخ (الشكل 5B - D) والشكل (6A - C) ربما تمثل أقراص مقحم. فيعلى النقيض من لmyocytes تربيقية، كان S-α-actinin في منطقة المدمجة أكثر منقط من الخطية، وكان التروبوميوزين تلطيخ منتشر بدلا من الخطية (الشكل 4A و 4B). وبالتالي، قد تحدث التجمع قسيم عضلي في وقت لاحق في التعاقد مقارنة عضلة القلب تربيقي. وعلاوة على ذلك، وأنماط التفاضلية من ليالي-α-actinin والتروبوميوزين في منطقة المدمجة تشير إلى أن S-α-actinin ينظم إلى نقاط وغير ناضجة وZ-أقراص في وقت مبكر، في حين التروبوميوزين إدراجها في خيوط رقيقة قد يكون حدث لاحق في التجمع ميوفيبريل.
الرقم 7، 1 الفيلم، والفيلم 2 تظهر النتائج نموذجية من E12.5 القلب الجنينية PFA الثابتة. في هذه الأمثلة، تم استخدام الجنين المعدلة وراثيا LifeAct-RFPruby للتصوير. التحوير LifeAct-RFPruby 19 تسميات الأكتين الخيطية ولكن يتطلب PFA التثبيت. كانت Z-أقراص المسمى مع S-α-actinin سهلة لتصور في معظم المناطق، ولكن كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء decre ASED مقارنة الأداة الإضافية المجمدة أقسام القلب (الشكل 7A)؛ وكانت هذه إشارة نموذجية لالمناعي S-α-actinin في الأنسجة PFA الثابتة، والتي يمكن أن ملثمين الحواتم بواسطة بروتين عبر وصلات. ويبين الشكل 7B شارك في التصور من الأكتين الخيطية وimmunolabeled S-α-actinin داخل اللييفات العضلية (السهام) والأكتين الخيطية داخل الخلايا داخل القلب المتاخمة لmyocytes تربيقية (السهام). وكشف ثلاثي الأبعاد إعادة بناء صورة تفاصيل إضافية: تم تمييزها العضلية الفردية أكثر سهولة، اللييفات العضلية داخل cardiomyocyte تم موازية تقريبا لبعضها البعض، ولكن كانت موجهة العضلية الفردية في زوايا مختلفة لبعضها البعض (الشكل 7C وD، الفيلم 1، وفيلم 2 ). وأعرب عن تقديره لتقريب وثيق بين الخلايا داخل القلب والعضلية بشكل أفضل في وجهات النظر ثلاثية الأبعاد أيضا.
">
الشكل 1. sarcomeres Cardiomyocyte، وأقراص مقحم، وcostameres. المراسي وZ-القرص خيوط الأكتين، في حين أن خط M المراسي ألياف الميوسين، والتي تتداخل خيوط الأكتين. ويضم قسيم عضلي واحد Z-القرص - خط M - وحدة Z-القرص. sarcomeres متعددة في سلسلة تخلق ميوفيبريل. نهاية الجانبية للميوفيبريل إدراج في الحدود عرضية من cardiomyocyte في وكالة متخصصة خلية خلية هيكل موصلي يسمى القرص مقحم. اللييفات العضلية المحيطية الاتصال لالطولي cardiomyocyte غشاء البلازما عبر costameres، والتي تشكل الالتصاقات البؤرية مع المصفوفة خارج الخلية العضلية بين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/>
الشكل 2. S- α -actinin وβ كاتينين المناعي في اليوم الجنينية 16.5. تم استئصال القلب، والمفاجئة المجمدة، cryosectioned، وimmunostained باستخدام (A) الفأر وحيدة النسيلة استنساخ EA53 الأجسام المضادة ضد S-α-actinin الثابتة الأسيتون، والتي تظهر cardiomyocyte المسمى Z-القرص وأقراص مقحم، و (ب) أرنب الأجسام المضادة polycloncal ضد بروتين الملتصقة تقاطع β كاتينين. (C) مدموجة الصور S-α-actinin وβ كاتينين تلطيخ. (D) تضخيم مجال الاهتمام من لوحة C . علامة النجمة يفترض أقراص مقحم مع زملاء توطين S-α-actinin وβ كاتينين. تم الحصول على الصور من الطرفية جدار البطين الأيسر أو عضلة القلب المدمجة، مع طبقة النخابية في الجانب الأيسر العلوي من الألواح AC. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 460-1600 (من سو من الممكن 0-65535) لكل من نانومتر و β كاتينين / 561 قنوات نانومتر الليزر S-α-actinin / 488. مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. S- α -actinin وβ 1 إنتغرين المناعي في اليوم الجنينية 16.5. تم استئصال القلب، والمفاجئة المجمدة، cryosectioned، الثابتة الأسيتون، وimmunostained باستخدام (A) الفأر وحيدة النسيلة استنساخ EA53 الأجسام المضادة ضد S-α-actinin و وتشير (B) الماعز بولكلونل الأجسام المضادة ضد بروتين التصاق البؤري β1 إنتغرين. (C) مدموجة الصور إنتغرين β1 في cardiomyocyte وكذلك الخلايا غير cardiomyocyte. ملاحظة كلا منتشر ومنقط β1 إشارة إنتغرين في العضلية (D) مجال الاهتمام من لوحة C. ملاحظة منقط، β1 الدوري إنتغرين تلطيخ (الأسهم) مع دورية مماثلة لقريب S-α-actinin تلطيخ في Z-أقراص تضخيم؛ هذه الهياكل قد تمثل costameres. تم الحصول على الصور من عضلة القلب الصغير البطين الأيسر. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 460-1200 (من الممكن 0-65535) لS-α-actinin / 488 قناة نانومتر الليزر و460-600 للقناة نانومتر الليزر β1 إنتغرين / 561. مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. S- α -actinin والمناعي التروبوميوزين في الجنينية اليوم 12.5: منظمة ميوفيبريل في تربيقية وعضلة القلب المضغوط. تم رفعه قلوب من الأجنة littermate، المفاجئة المجمدة، cryosectioned، ثابتة الأسيتون، وimmunostained باستخدام (A) الفأر وحيدة النسيلة استنساخ EA53 الأجسام المضادة ضد S-α-actinin و (B) الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد خيوط رقيقة ميوفيبريل البروتين التروبوميوزين (دراسات الإنمائية هجين البنك CH1). يشار إلى تربيقية (الأسهم) وعضلة القلب المضغوط (السهام). ملاحظة خطية S-α-actinin تلطيخ مع دورية منتظمة في عضلة القلب تربيقي، مقارنة مع مجموعة واسعة من أنماط تلطيخ بما في ذلك نقاط وفضلا عن تلطيخ الخطي في طبقة المدمجة (A). نلاحظ أيضا الخطي تلطيخ التروبوميوزين مع دورية منتظمة في عضلة القلب تربيقية لكن تلطيخ أكثر انتشارا في عضلة القلب المضغوط. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 460-1،400 (من الممكن 0-65535) للقناة S-α-actinin و460-1،000 للقناة التروبوميوزين. مقياس شريط 10 ميكرون."https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. S- α -actinin والمناعي N-كادهيرين في اليوم الجنينية 12.5: اللييفات العضلية وأقراص مقحم في العضلية تربيقية تم رفعه القلب، والمفاجئة المجمدة، cryosectioned، الثابتة الأسيتون، وimmunostained باستخدام (A) الفأر وحيدة النسيلة استنساخ EA53 الأجسام المضادة ضد S-α-actinin و (ب) الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد بروتين التصاق البؤري N-كادهيرين. تم جمع 0.2 ميكرون شرائح البصرية وكومة من الألف إلى الياء، وكان بالارض مداخن ض لتوليد الصور. تظهر (C) مدموجة مداخن بالارض سواء N-كادهيرين و S-α-actinin تلطيخ داخل العضلية تربيقية كما ثالذراع كما نوى المسمى مع هويشت صبغ (D) تضخيم مجال الاهتمام من لوحة C؛ النجمة علامة أقراص مقحم مع زملاء توطين S-α-actinin وN-كادهيرين. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 470-1،200 (من الممكن 0-65535) لهويشت / 405 قناة نانومتر الليزر و470-2،000 لكل من S-α-actinin / 488 نانومتر و N-كادهيرين / 561 قنوات نانومتر الليزر. مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. المضادة للماوس مفتش (H + L) أحادي التكافؤ فاب شظية كتل فعال الماوس الذاتية مفتش ملزمة من قبل الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس، وE12.5 تم رفعه القلب الجنينية، والمفاجئة المجمدة، cryosectioned، الثابتة الأسيتون، وimmunostained.
الرقم 7. S- α -actinin وتنظيم الأكتين في كاردات تربيقيomyocytes في اليوم الجنينية 12.5. وقد استخدمت LifeAct-RFPruby خط الماوس المعدلة وراثيا لتصور الأكتين الخيطية 19، في حين تم استخدام الماوس وحيدة النسيلة استنساخ EA53 الأجسام المضادة ضد S-α-actinin لتسمية الأقراص Z-وأقراص مقحم. أجنة تم PFA-ثابتة. تم جمع 0.2 ميكرون شرائح البصرية وكومة من الألف إلى الياء يظهر (A) البراغي ض المكدس الذي S-α-actinin كان تلطيخ أكثر انتشارا في الأنسجة PFA الثابتة من الأداة الإضافية المجمدة والأسيتون الثابتة أقسام (الأرقام 2-5). (B يظهر) البراغي ض كومة كلا الأكتين الخيطية وS-α-actinin. الخيطية مضان الأكتين محلية بين Z-أقراص داخل اللييفات العضلية (السهام). كان ينظر الأكتين الخيطية مضان أيضا في الخلايا التي تبطن داخل القلب myocytes تربيقية (السهام). (C) عرض ثلاثي الأبعاد للالعضلية تربيقية، كما يرى من أعلى المكدس. (D) عرض ثلاثي الأبعاد للوالعضلية تربيقية، كما ينظر إليها من أسفل المكدس. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 470-900 (من الممكن 0-65535) لكل من قناة الليزر 488 نانومتر، وللقناة ليزر 561 نانومتر في ألف وباء؛ عرض نطاق 460-800 لكل من القنوات في C و D. مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1. صدر 360 درجة عرض 3D التناوب من S- α -actinin وتنظيم الأكتين في العضلية تربيقية في اليوم الجنينية 12.5. مكدس صورة من الشكل (6) في ثلاثة أبعاد باستخدام صورة J عارض 3D المساعد ضمن برنامج تحليل الصور فيجي. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 470-800 (من الممكن 0-65535) لكل من القنوات 488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر. </ P>
فيلم 2. تم تقديم وجهات النظر 3D مختارة من S- α -actinin والأكتين منظمة في العضلية تربيقية في اليوم الجنينية 12.5. مكدس صورة من الشكل (6) في ثلاثة أبعاد باستخدام صورة J عارض 3D المساعد ضمن برنامج تحليل الصور فيجي. تناوب صغيرة حول X، Y، Z والفؤوس أظهرت محاذاة نسبيا اللييفات العضلية في العضلية ولكن سوء التوافق بين معظم العضلية. كما أظهرت تناوب صغيرة تقريب وثيق الخلايا داخل القلب التي تفتقر إلى S-α-actinin حول العضلية. كثافة الرسم البياني عرض نطاق 470-800 (من الممكن 0-65535) لكل من نانومتر 488 و 561 نانومتر القنوات الليزر.
Discussion
ويجب تحديد أفضل تقنية تثبيت الأنسجة والتخفيف تجريبيا لكل الأجسام المضادة. في أيدينا، والإضافية تجميد متفوقة على PFA تثبيت لعدة مستضدات cardiomyocyte، بما في ذلك S-α-actinin، β-كاتينين، β1-إنتغرين، التروبوميوزين، تالين (لا يظهر) وN-كادهيرين. في المقابل، PFA تثبيت تؤدي إلى نتائج ممتازة لتنسيق التصاق كيناز (لا يظهر). وcrosslinks البروتين التي شكلتها PFA قد يخفي الحواتم والحد من الأجسام المضادة ملزمة؛ قد تكون هناك حاجة استرجاع مستضد في مثل هذه الحالات، وطرق لاسترجاع مستضد ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى 20. يمكن تخفيض تركيز PFA أو طول التثبيت للحد من حاتمة اخفاء، مع تحديد الظروف المثلى تجريبيا لكل الأجسام المضادة وعند كل مرحلة التطوير. ضوابط السلبية المناسبة ينبغي أن تستخدم عندما تميز الأجسام المضادة جديد أو متحولة القلب، بما في ذلك المصل قبل المناعة مثل مراقبة الأجسام المضادة الأولية و"لا الأجسام المضادة الأولية" التعاونntrol. استخدام الفئران خروج المغلوب هو السيطرة السلبية مثالية ولكن الفتك في وقت مبكر يمنع استخدامها للعديد من المنتجات الجينات درس هنا.
استخدام كميات كافية لغمر تماما الشرائح التجريبية والضابطة في نفس حجب المناعي، الأجسام المضادة، وكان حلول غسل المهم كما كان هزاز لطيف من الشرائح خلال حضانة لضمان التعرض موحدة من الأقسام إلى حلول. هذا النهج التقليل من التغير التقني في تلطيخ بين الأقسام والشرائح ضمن التجربة. عندما يحد تكلفة حجم حل الأجسام المضادة، واستخدام عنق الرحم القلم للحد من تدفق حلول أبعد من أقسام الأنسجة والحفاظ على الشرائح في غرفة ترطيب أثناء حضانات طويلة. إذا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس الابتدائي - وبالتالي الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس - يتم استخدامه، وخطوة حجب الثانية لتغطية المناعية الذاتية الماوس يكون الضرورية (الخطوة 3.4) لتقليل إشارة الخلفية غير محددة.
المجهر ومعالجة الصور التقنيات الملائمة حاسمة لحصول على معلومات دقيقة بيولوجيا 21. الرسم البياني كثافة يشير توزيع بكسل في كل مستوى كثافة (0-65535 المستويات للحصول على صورة 16-بت) لكل لون. الخلفية، والسطوع، والتباين يمكن تعديلها عن طريق الدخول في عرض نطاق كثافة أن الأجنحة ذروة الرسم البياني. لإجراء مقارنات صحيحة بين الظروف، يجب استخدام نفس الإعدادات بين السيطرة والظروف التجريبية.
يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتحليل نضوج cardiomyocyte والتنمية في الأصلي الجنينية القلب الماوس. في حين غالبا ما يستخدم المناعي للبروتينات cardiomyocyte محددة للاحتفال العضلية خلال التنمية، دراسات قليلة توظف التقنيات التي تسمح تحليل عالية الدقة من هيكل ميوفيبريل وظهور أقراص مقحم وcostameres 12-14،22،23. هذه التقنية يمكن استخدامها لفي الخامستقييم ايفو الطفرات التي تسبب عيوب القلب التنموية، كوسيلة لتحديد التغيرات في cardiomyocyte النضج التي قد تسلط الضوء على آليات تشوهات هيكلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-α-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-βcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-β1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Risebro, C. A., Riley, P. R. Formation of the ventricles. The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
- Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
- Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
- Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
- Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
- Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
- Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
- Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
- Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
- Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
- Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
- Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274 (2010).
- Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
- Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
- Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
- Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).
