Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
Under hjerte utvikling, generering av hjerteinfarkt spesifikke strukturelle og funksjonelle enheter inkludert sarcomeres, kontraktile myofibrils, interkalerte plater og costameres krever koordinert montering av flere komponenter i tid og rom. Forstyrrelser i montering av disse komponentene fører til utviklingshjertefeil. Immuno-fluorescensfarging teknikker brukes vanligvis i dyrkede kardiomyocytter å sondere myofibril modning, men dette ex vivo tilnærming er begrenset av i hvilken grad myocytter vil fullt skille i kultur, mangel på normale in vivo mekaniske innganger, og fravær av endokardiale signaler. Anvendelse av immunfluorescens teknikker til studiet av utviklingen mus hjerte er ønskelig, men mer teknisk utfordrende, og metoder ofte mangler tilstrekkelig følsomhet og oppløsning for å visualisere sarcomeres i de tidlige stadiene av hjerte utvikling. Her beskriver vi en robust og reproduserbar metode for å co-immunfarging av multiple proteiner eller å co-visualisere et fluorescerende protein med immunofluorescent flekker i den embryonale mus hjerte og bruke denne metoden for å analysere utviklings myofibrils, interkalerte plater og costameres. Denne fremgangsmåte kan videre anvendes for å vurdere cardiomyocyte strukturelle endringer forårsaket av mutasjoner som fører til utviklingshjertefeil.
Under utvikling, hjerte sammentrekninger begynne snart etter kardiomyocytter migrere til midtlinjen og danner lineære hjerte tube 1,2. Sarcomere er den grunnleggende kontraktile enhet innenfor cardiomyocyte; dette høyt organisert cytoskeletal strukturen inneholder actinfilamenter forankret til Z-platen ved sarcomeric α-actinin (s-α-actinin) og myosin fibre forankret til M linjen (figur 1). Som cardiomyocyte modnes, sarcomeres sammen i serie for å danne myofibrils som strekker seg over cellen. Myofibrils er forankret til endene av cardiomyocyte av interkalert platen, celle-celle junctional struktur som inneholder en overgangs krysset med et delsett av Z-skålelementer som s-α-actinin 3, adherens koplingsproteiner slik som N-cadherin og β catenin, gap junction-proteiner, og desmosomer (figur 1) 4. Langs lengde membran, Z-plater av perifere myofibrils ogsåknytte til cellemembranen via costameres; disse spesialiserte fokale adhesjon tilveiebringe en forankring mellom myofibrillene, plasmamembranen, og ekstracellulær matriks for å gi ytterligere strukturell understøttelse til cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidlig i hjertet utvikling, er kardiomyocytter arrangert i fingeraktige utvekster som kalles trabeculae som stikker inn i ventrikkel plass og inneholder relativt modne myofibrils 5. Som hjerte utvikling provenyet, de cardiomyocytes i sub-epikardial region sprer å danne den kompakte hjertemuskelen som består av kammerveggene, men sarcomere og myofibril montering er forsinket sammenlignet med trabecular myocardium 5,6.
Modeller av sarcomere og myofibril montering kommer i stor grad fra immunofluorescence studier på dyrkede kardiomyocytter 7-10, som er grei, men mangler et tredimensjonalt miljø, blodstrøm, og kontakter med andre hjertecelles stede in vivo. Høyoppløselige strukturelle studier med immunfluorescens i mus embryonale hjerte er teknisk utfordrende, og få studier har utforsket fremveksten av interkalerte plater og costameres under musen hjerte utvikling. Den adherens krysset protein β catenin ser ut til å lokalisere til interkalerte plater av embryonale dag (E) 17.5 11, lokaliserer N-cadherin til lineære strukturer som kan representere interkalerte plater av E18.5 12 versus postnatal dag 0 13, og costameres er påvist på E18.5 14, men disse proteinene vise diffus og mer sammenhengende membran fordeling på tidligere utviklings tidspunkter 11-13.
Her beskriver vi en enkel og reproduserbar metode for farging og fluorescens mikroskopi av seksjonert mus embryonale hjerter som gjør det mulig for detaljert analyse av myofibril og cardiomyocyte utvikling, herunder fremveksten av intercalated-plater så tidlig som E12.5 og gryende costameres på E16.5. Denne protokollen kan være nyttig for undersøkelser av virkningene av mutasjoner på sarcomere dannelse samt myofibril og cardiomyocyte modning.
Den optimale vev fiksering teknikk og fortynning må bestemmes empirisk for hvert antistoff. I våre hender, snap-frysing er overlegen til PFA fiksering for flere cardiomyocyte antigener, inkludert s-α-actinin, β-catenin, β1-inte, tropomyosin, Talin (ikke vist) og N-cadherin; I motsetning til dette, gir PFA fiksering overlegne resultater for fokal adhesjonskinase (ikke vist). Proteintverrbindinger som dannes ved PFA kan maskere epitoper og begrense antistoffbinding; antigen gjenfinning kan være nødvendig i slike tilfeller, og metoder for antigen gjenfinning kan finnes andre steder 20. PFA konsentrasjon eller lengden av fiksering kan reduseres for å redusere epitop maskering, med optimale forhold empirisk bestemt for hvert antistoff, og ved hvert utviklingsstadiet. Passende negative kontroller bør brukes for å karakterisere en ny antistoff eller hjerte mutant, inkludert pre-immune serum som den primære antistoff kontroll og en "ingen primær antistoff" control. Bruk av knockout-mus er en ideell negativ kontroll, men tidlig dødelighet forhindrer deres anvendelse for mange av genprodukter studert her.
Bruk av tilstrekkelige volumer til helt senk eksperimentelle og slides i samme immunfluorescens blokkering, antistoff, og vaskeløsninger var viktig som var milde rocking av lysbilder under inkubasjon for å sikre ensartet eksponering av seksjonene til løsninger. Denne tilnærmingen minimert teknisk variasjon i farging mellom seksjoner og lysbilder i et eksperiment. Når kostnadene begrenser løsning volumet antistoff, bruke en Pap penn for å begrense flyten av løsninger utover vevsdelene og holde lysbilder i en fuktet kammer under lange inkubasjonene. Dersom et monoklonalt muse primært antistoff – og derfor en anti-muse-sekundært antistoff – blir brukt, vil en andre blokkerende trinn for å dekke endogene mus immunoglobuliner være nødvendig (trinn 3.4) for å redusere ikke-spesifikk bakgrunnssignal.
Passende mikroskopi og bildebehandling teknikker er avgjørende for å oppnå biologisk nøyaktig informasjon 21. Intensiteten Histogrammet indikerer fordelingen av bildepunkter ved hver intensitetsnivå (0-65535 nivåer for et 16-bits bilde) for hver farge. Bakgrunn, kan lysstyrke og kontrast justeres ved å sette en intensitet visningsområde som flankerer histogrammet topp; fatte gyldige sammenligninger mellom forholdene, må de samme innstillingene mellom kontroll og eksperimentelle forhold brukes.
Denne protokollen gir en pålitelig metode for å analysere cardiomyocyte modning og utvikling i den innfødte embryonale mus hjerte. Mens immunfluorescens av cardiomyocyte-spesifikke proteiner blir ofte brukt til å markere kardiomyocytter under utvikling, er det få studier anvende teknikker som gjør det mulig med høy oppløsning analyse av myofibril struktur og fremveksten av interkalerte plater og costameres 12-14,22,23. Denne teknikken kan brukes for in vIvo vurdering av mutasjoner som forårsaker utviklingshjertefeil, som et middel til å fange opp endringer i cardiomyocyte modning som kan kaste lys over mekanismene for strukturelle misdannelser.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |