Abstract
Under hjärtutveckling, generering av hjärtspecifika strukturella och funktionella enheter inklusive sarkomerer, kontraktila myofibriller, inskjutna skivor och costameres kräver samordnade montering av flera komponenter i tid och rum. Störningar i montering av dessa komponenter leder till utvecklings hjärtfel. Immunofluorescerande färgning tekniker används vanligen i odlade kardiomyocyter att sondera myofibrill mognad, men detta ex vivo tillvägagångssätt begränsas av i vilken utsträckning myocyter kommer helt skilja på kultur, brist på normala in vivo mekaniska ingångar, och frånvaro av endokardiska ledtrådar. Tillämpning av immunofluorescenstekniker till studiet av att utveckla musen hjärta är önskvärt men mer tekniskt utmanande och metoder ofta saknar tillräcklig känslighet och upplösning för att visualisera sarkomerer i de tidiga stadierna av hjärtutveckling. Här beskriver vi en robust och reproducerbar metod att samarbeta immunostain multiple proteiner eller att samarbeta visualisera ett fluorescerande protein med immunofluorescens färgning i den embryonala musen hjärta och använda denna metod för att analysera utvecklings myofibriller, inskjutna skivor och costameres. Denna metod kan tillämpas ytterligare för att bedöma cardiomyocyte strukturella förändringar som orsakas av mutationer som leder till utvecklings hjärtfel.
Introduction
Under utveckling, hjärtsammandragningar börjar snart efter kardiomyocyter migrera till mittlinjen och bildar den linjära hjärtröret 1,2. Sarcomere är den grundläggande kontraktila enhet inom cardiomyocyte; denna mycket organiserad cytoskelettala strukturen innehåller aktinfilament förankrade till Z-skivan genom sarcomeric α-actinin (s-α-aktinin) och myosin fibrer förankrade till M-linje (figur 1). Som cardiomyocyte mognar, sarkomerer samlas i serie för att bilda myofibriller som sträcker sig över cellen. Myofibrils är förankrade vid ändarna av cardiomyocyte av den inlagrade skivan, den cell-cell Junktional struktur som innehåller en övergångs korsning med en delmängd av Z-skivelement, exempelvis s-α-aktinin 3, adherens proteiner såsom N-cadherin och β catenin, gap junction proteiner, och desmosomer (Figur 1) 4. Längs längd membranet, Z-skivor av perifera myofibriller ocksåfäster cellmembranet via costameres; dessa specialiserade fokala sammanväxningar åstadkomma ett ankare mellan myofibrill, plasmamembran och extracellulär matris för att ge ytterligare strukturellt stöd till cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidigt i hjärtutveckling, är kardiomyocyter anordnade i fingerliknande utskott som kallas trabekulae som sticker in i det ventrikulära utrymmet och innehåller relativt mogna myofibriller 5. Som skrider hjärta utveckling, kardiomyocyterna i under epikardiell region förökar att bilda den kompakta myokardiet som omfattar kammarväggarna, men sarcomere och myofibrill montering fördröjs jämfört med trabekulära hjärtmuskeln 5,6.
Modeller av sarcomere och myofibrill montering kommer till stor del från immunofluorescens studier på odlade hjärtmuskelceller 7-10, som är enkel, men saknar en tredimensionell miljö, blodflöde, och kontakter med andra hjärtcells före in vivo. Högupplösta strukturella studier med immunofluorescens i musen embryonala hjärtat är tekniskt utmanande, och få studier har undersökt uppkomsten av inskjutna skivor och costameres under musen hjärt utveckling. Den adherens proteinet β catenin förefaller att lokalisera till inskjutna skivor av embryonala dag (E) 17,5 11, lokaliserar N-cadherin linjära strukturer som kan representera inskjutna skivor från E18.5 12 kontra postnatal dag 0 13, och costameres har avslöjats vid E18.5 14, men dessa proteiner visar diffusa och mer kontinuerlig membranfördelningen vid tidigare utvecklings tidpunkter 11-13.
Här beskriver vi en enkel och reproducerbar metod för immunfärgning och fluorescens mikroskopi av sektion mus embryonala hjärtan som möjliggör detaljerad analys av myofibrill och cardiomyocyte utveckling, inklusive uppkomsten av intercalated skivor så tidigt som E12.5 och begynnande costameres vid E16.5. Detta protokoll kan vara användbart för att sondera effekterna av mutationer på sarcomere bildning samt myofibrill och cardiomyocyte mognad.
Protocol
OBS: Alla experimentella procedurer godkändes av UCSF Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Frysförvaring och Fixering av embryonala Mouse Hearts.
1.1) Snap-frysning embryonala hjärtan
- Fyll en 3,5 cm petriskål och 7 mm cryomolds med Optimal Cutting Temperatur (OCT) medium (se Material tabell). I en kemisk huva, kyla 2-metylbutan i flytande kväve.
- Dispensera 30 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 10 cm petriskålar, 10 ml PBS i 3,5 cm petriskålar, och placera alla petriskålar på is. Förbered en 10 cm skål och flera 3,5 cm rätter per gravida mus.
- Isolera embryon som tidigare beskrivits 15, utför dissektionen i iskall PBS.
- Kortfattat, avliva den gravida kvinnliga använder CO2 narkos och halsdislokation.
- Gör ett snitt i buken, dissekera ut livmodern genom att skära fartygen along inner krökning av livmodern, och överföra livmodern till en 10 cm petriskål med iskall PBS.
- Skär livmodern i mellan varje embryo och överföring till en individuell 3,5 cm petriskål med iskall PBS. Isolera varje embryo såsom beskrivits 15.
- Öppna perikardiell hålrum med fin pincett, ta bort hjärtat bort från lungorna och kärl genom att skära på aorta, sämre hålvenen, och lungvenerna, och överföra till 3,5 cm petriskål med oktober
- Låt hjärtat jämvikt i OCT i flera sekunder, sedan överföra hjärtat i 7 mm form innehållande oktober Rikta den främre väggen av hjärtat till botten av formen.
- Placera försiktigt formen i flytande kväve kyld 2-metylbutan. Se till att inte tillåta 2-metylbutan vätska röra ULT eller hjärta. Frys tills ULT är fast vitt, sedan överföra formen till en ishink med torris. Gå vidare till nästa embryot.
- Wrap cryomolds i folie och förvara vid -80 ° C tills redo för cryosectioning.
1.2) Alternativ: Paraformaldehyd (PFA) fastställande, cryoprotecting, och OCT bädda embryonala hjärtan
- Fyll brunnarna i en 12-brunnars vävnadsodlingsplatta med 4% PFA i 1x PBS.
- Dissekera ut embryonala hjärtan som beskrivs i 1.1.3. Placera varje hjärta i en brunn innehållande 4% PFA och fixa vid 4 ° CO / N.
- Kryoskydd: att använda en plast överföringspipett, flytta varje hjärta till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 1,5 ml 15% sackaros i PBS och skaka försiktigt vid 4 ° C tills hjärtat sjunker till botten av röret (flera timmar till O / N ). Överför varje hjärta till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 1,5 ml av 30% sackaros i PBS och skaka försiktigt vid 4 ° C igen tills hjärtat sjunker till botten av röret (flera timmar till O / N).
- Med hjälp av en plast överföringspipett, placera kryoskyddad hjärta i ULT och låt den stabiliserai flera minuter för att avlägsna överskott sackaros, sedan överföra hjärtat i 7 mm form innehållande oktober Rikta den främre väggen av hjärtat till botten av formen.
- Frys hjärtat i OCT genom att placera formen i antingen flytande kväve kyld 2-metylbutan eller torris.
- Wrap cryomolds i folie och förvara vid -80 ° C tills produkten ska cryosectioning.
2. cryosectioning
- Ställ kryostat temperaturen till -17 ° C.
- Placera cryomolds in i kryostat kammaren och utjämna till temperatur i 15-20 minuter.
- Vänd cryomold och använda ett lätt tryck för att driva ut hjärtblock från formen. Rikta den främre väggen av hjärtat till toppen av den formade vävnadsblock.
- Placera en stor droppe av OCT på chucken, och montera hjärtblock på ULT droppe att frysa på chucken. Håll orientering så att den främre väggen av hjärtat är längst bort från chucken.
- Ladda chucken och monterade hankonstblocket på kryostatens objekthållaren. Justera så att vinkeln på bladet är 3-5 ° i förhållande till provet.
- Samla 10 um sektioner på objektglas som har förbehandlats med en positivt laddad beläggning (se Material tabell). Låt torka helt innan du förvarar vid -80 ° C.
3. Immunofluorescens
- För snäpp frysta snitt, fixera och permeabilisera vävnad i aceton under 10 min i ett dragskåp vid RT.
- För snäpp frysta och PFA-fasta sektioner, inkubera i PBS-0,1% Triton X-100 i 20 min för att avlägsna ULT och att permeabilisera PFA-fasta sektioner.
- Block för 45 min i 1x blockeringsbuffert, späddes i PBS.
- Vid användning av en primär antikropp som genereras i mus, inkubera i åsna eller get anti-mus IgG (H + L) envärda Fab-fragment utspädd 1: 100 i PBS-0,1% Tween 20 under 45 min vid RT (se diskussion).
- Inkubera i primär antikropp eller antikroppar utspädda i 1x blockeringsbuffert under 2 h vid RT ellerO / N vid 4 ° C (se tabell för material / Utrustning för specifika utspädningar).
- Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger i 10 min vid RT.
- Inkubera i Alexa Fluor-konjugerad sekundär antikropp utspädd 1: 500 i blockeringsbuffert under 2 h vid RT, skyddad från ljus.
- Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger i 10 min vid RT, skyddat från ljus.
- Tillval: Inkubera i Hoechst färgämne utspätt 1: 2000 i PBS vid RT (skyddad från ljus) för att märka kärnor, skölj sedan med PBS.
- Post-fix märkta sektioner i en% PFA i en min vid RT.
- Mount glider i anti-fade medium (med DAPI om kärnor inte redan har märkts) genom att placera två droppar medium på varje ände av bilden och sedan täcker med ett täckglas. Seal täckglas med nagellack. Store skyddas från ljus vid 4 ° C tills den ska bilden.
4. Confocal Imaging och bildanalys
- Slå på lämpliga laservåglängder, kamera och konfokalmikroskop including skede mover och z motor. Starta bildvisningsprogram. Använd 405, 488, och 561 laservåglängder för avbildning Hoechst-, Alexa 488- och Alexa 568-färgade snitt, respektive.
OBS: Se Material Tabell för våra hårdvaru- och programvaruspecifikationer. - Montera styrsliden (täckglas ner för ett inverterat mikroskop) på glid scenen.
- Använda 4X målet (se Material tabell), finner provet och intresseområde. Ta bilden som ska användas som en karta när avbildning med hög förstoring.
- Ta bilden, vilket gör minimala justeringar glidstadiet. Byt till 60x oljeimmersionsobjektivet (se Material tabell), placera en liten droppe olja på målet, och ersätta bilden (täckglas ner) på glid scenen.
- Hitta prov igen. Ställ in lasereffekten, exponeringstid, och binning till önskade nivåer för varje kanal.
OBS: Vi använder i allmänhet lasereffekt på 0,8, kamera exponeringstid på 100 ms, och binning av 2 (see Material Tabell för hårdvaru- och programvaruspecifikationer); optimala inställningar måste empiriskt bestämmas för varje experiment.- När optimala inställningar bestäms, använd samma inställningar för alla sektioner vävnads inom experimentet. Använd intensiteten histogrammet att notera det optimala intensitetsområdet för varje kanal (denna information kommer att användas för analys).
- Generera az stacken enligt förvärvsfunktionen: välj lämpliga laserkanalerna, välj sedan de övre och nedre gränserna för z stacken. Välj az stack stegstorlek som är en-halva värdet av den optiska snittjocklek som anges i programvaran. Klicka på "run" för att samla in bilderna.
- Använd Fiji 16 eller ett liknande program för bildanalys. Inom Fiji, öppna z stacken fil med anpassade färglägesalternativ och kanalerna delas upp i separata fönster. Öppna "Justera Ljusstyrka / Kontrast" verktyget från Bild rullgardinsmenyn; inom varje kanal, set det optimala histogrammet intensitetsintervall bestäms i 4.5.1. Applicera dessa kanalintervall för alla z stackar som analyseras.
- Slå ihop de enskilda kanalerna till en enda sammansatt bild med hjälp Bild-> Färgrullgardinsmenyn.
- Skapa en tillplattad z stack från den sammansatta bilden med Bild-> Stacks-> z projektmenyn. Denna bild kommer att vara betydligt ljusare än 3D-bilden; justera histogrammet intensitetsintervallet för kontrollprovet för att undvika övermättnad, och tillämpa samma inställningar till den experimentella tillplattad z stacken.
- För att generera en 3D-bild, först använda Bild-> Stacks-> 3D projekt meny 17. Välj antingen x-axeln eller y-axeln i rotation. Ställ slice avståndet som samma antal mikrometer som z stacken stegstorleken. Välj önskad total rotation och ställa rotationsvinkeln ökningen 1. Öppna sedan Bild J 3D Viewer från Plugins rullgardinsmenyn. Välj den sammansatta bilden genereras i 4.8, display som volym, och ange Reprovtagning faktor till 1 eller 2.
Representative Results
Figurerna 2 till 6 visar typiska resultat för co-färgning av olika proteiner på ett kick frysta och aceton fixerade hjärta. Antikropp mot S-α-actinin reproducerbart märkta Z-skivor och inskjutna skivor med hög specificitet och minimal bakgrunds (figurerna 2A, 3A, 4A, 5A, 6A och 6C), fig 6 visar att den anti-mus IgG (H + L) monovalent Fab-fragment effektivt blockerar endogena mus IgG-bindning av anti-mus sekundära antikroppar. Antikroppen mot adherens protein β catenin bunden membranet av både hjärtmuskelceller och icke-cardiomyocyte celler, och samlokalisering med s-α-actinin inträffade i förmodade inskjutna skivor vid E16.5 (Figur 2C och D), som förväntat från β catenin färgningsmönster i den vuxna hjärtat 18. β1 grin immunofluorescens i embryonala hjärtat är särskilt utmanande och ofta misslyckas med att identifiera fokala sammanväxningar 14, men β1 grin färgning i dessa studier visade signalen med samma periodicitet som s-α-actinin-märkta Z-skivor, som eventuellt reflekterar begynnande costameres bildar på E16.5 (Figur 3D).
Vid E12.5, s-α-aktinin och tropomyosin (sarcomere tunn filamentprotein) immunofluorescens avslöjade ett färgningsmönster med regelbunden periodicitet i trabekulära kardiomyocyter överensstämmande med mogna myofibriller i dessa celler (figurerna 4A och 5A för s-α-actinin; Figur 4B för tropomyosin). N-cadherin färgning i trabekulära kardiomyocyter vid E12.5 hjärtan tenderade att colocalize med områden av intensiv s-α-actinin färgning (figur 5B - D och fig 6A - C) eventuellt representerar inskjutna skivor. Ikontrast till trabekulära myocyter, s-α-actinin i kompakt zonen var mer punktat än linjär, och tropomyosin färgning var diffus snarare än linjär (Figur 4A och 4B). Således kan sarcomere montering ske senare i kompakt jämfört med trabekulärt hjärtmuskeln. Vidare differentiella mönster av s-α-aktinin och tropomyosin i den kompakta zonen antyder att s-α-actinin organiserar in puncta och omogna Z-skivor tidigare, medan tropomyosin inkorporering i det tunna filamentet kan vara en senare händelse i myofibrill montering.
Figur 7, Film 1 och Film 2 visar typiska resultat från en PFA-fast E12.5 embryonala hjärta. I dessa exempel var en LifeAct-RFPruby transgen embryo som används för avbildning; den LifeAct-RFPruby transgen 19 etiketter fintrådiga aktin men kräver PFA fixering. Z-skivor märkta med s-α-actinin var lätta att visualisera de flesta områden, men signal-brusförhållande var Decré visar därmed jämfört med snäpp frysta hjärtsektioner (figur 7A); denna signal var typisk för s-α-actinin immunfluorescens i PFA-fixerad vävnad, i vilken epitoper kan maskeras av proteintvärbindningar. Figur 7B visar samtidig visualisering av filamentös aktin och immunolabeled s-α-actinin inom myofibriller (pilhuvuden) och fintrådiga aktin inom endokardiska celler intill trabekulära myocyter (pilar). Tredimensionell bild rekonstruktion avslöjade ytterligare detaljer: enstaka kardiomyocyter var lättare urskiljas, myofibriller inom en cardiomyocyte var ungefär parallellt med varandra, men enskilda kardiomyocyter var orienterade vid olika vinklar till varandra (figur 7C och D, film 1 och film 2 ). Den nära approximation mellan endokardiska celler och hjärtmuskelceller var bättre uppskattad i de tredimensionella vyer liksom.
">
Figur 1. cardiomyocyte sarkomerer, inskjutna skivor och costameres. Z-skiva förankrar aktinfilament, medan M linjen förankrar myosin fibrer, som överlappar de aktinfilament. Sarcomere omfattar en Z-skiva - M line - Z-skiva enhet. Flera sarkomerer i serie skapar en myofibrill. Den laterala änden av myofibrill införs i den tvärgående kanten av cardiomyocyte vid en specialiserad cell-cell-skarvstruktur som kallas den inlagrade skivan. Perifera myofibriller ansluter till den längsgående cardiomyocyte plasmamembranet via costameres, som bildar fokala sammanväxningar med den extracellulära matrisen mellan hjärtmuskelceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/>
Figur 2. s- α -actinin och β catenin immunofluorescens på embryonala dag 16,5. Hjärtat skars ut, snabbfrystes, cryosectioned, acetonfixerade och immunofärgades med användning av (A) musmonoklonal klon EA53 antikropp mot s-α-aktinin, vilket märkt cardiomyocyte Z-skiva och inskjutna skivor, och (B) kanin polycloncal antikropp mot adherens proteinet β catenin. (C) Sammanslagna bilder visar s-α-actinin och β catenin färgning. (D) förstorade område av intresse från panel C ; asterisker märke antas inskjutna skivor med samlokalisering av s-α-actinin och β catenin. Bilder erhölls från det perifera vänsterkammarvägg eller kompakt hjärtmuskeln, med epicardial lagret längst uppe till vänster i paneler AC. Intensitet exponeringsmätare intervall 460-1600 (ut of möjligt 0-65535) för båda s-α-actinin / 488 nm och β catenin / 561 nm laser kanaler. Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. s- α -actinin och β en grin immunofluorescens på embryonala dag 16,5. Hjärtat skars ut, snabbfrystes, cryosectioned, acetonfixerade och immunofärgades med användning av (A) musmonoklonal klon EA53 antikropp mot s-α-aktinin och (B) get polyklonal antikropp mot bränn adhesionsproteinet β1 integrin. (C) sammanslagna bilderna visar β1 integrin i cardiomyocyte liksom icke-cardiomyocyte celler. Notera både diffus ochpunktat β1 grin signal i kardiomyocyter (D) förstorade område av intresse från panel C. Obs punktat, periodisk β1 grin färgning (pilar) med periodicitet liknar närliggande s-α-actinin-färgning i Z-skivor. dessa strukturer kan representera costameres. Bilder erhölls från vänsterkammar kompakt myokardiet. Intensitet exponeringsmätare intervall 460-1200 (av möjliga 0-65535) för s-α-actinin / 488 nm laser kanal och 460-600 för β1 grin / 561 nm laser kanal. Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. s- α -actinin och tropomyosin immunofluorescens på embryonala dag 12,5: myofibrill organisation i trabekulära och kompakt myokardium. Hjärtan från kull embryon exciderades, snabbfrystes, cryosectioned, acetonfixerade och immunofärgades med användning av (A) musmonoklonal klon EA53 antikropp mot s-α-aktinin och (B) mus monoklonal antikropp mot myofibrill tunna filamentet protein tropomyosin (Develop Studies Hybridoma Bank CH1). Trabekulärt (pilar) och kompakt myokardiet (pilspetsar) indikeras. Obs linjär s-α-actinin färgning med regelbunden periodicitet i trabekulära myokardiet, jämfört med ett område av färgningsmönster inklusive puncta liksom linjär färgning i det kompakta skiktet (A). Notera också linjär tropomyosin färgning med regelbunden periodicitet i trabekulära myokardiet men mer diffus färgning i kompakt myokardiet. Intensitet exponeringsmätare intervall 460-1,400 (av möjliga 0-65535) för s-α-actinin kanal och 460-1,000 för tropomyosin kanalen. Scale bar 10 ^ m."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. s- α -actinin och N-cadherin immunofluorescens på embryonala dag 12,5:. Myofibriller och inskjutna skivor i trabekulära hjärtmuskelceller Hjärtat skars, snap frysta, cryosectioned, aceton fixerade och immunofärgades använder (A) monoklonal klon EA53 antikropp mot s-α-aktinin och (B) kanin-polyklonal antikropp mot bränn adhesionsproteinet N-cadherin. 0,2 ^ m optiska skivor uppsamlades såsom az stacken och z stackar var tillplattad för att generera bilderna. (C) Sammanfogade plattade staplar visar båda N-cadherin och s-α-actinin färgning inuti trabekulära kardiomyocyter som well som kärnor märkta med Hoechst färgämne (D) förstorade området av intresse från panel C.; asterisker markerar inskjutna skivor med samlokalisering av s-α-actinin och N-cadherin. Intensitet exponeringsmätare intervall 470-1,200 (av möjliga 0-65535) för Hoechst / 405 nm laser kanal och 470-2,000 för både s-α-actinin / 488 nm och N-cadherin / 561 nm laser kanaler. Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Anti-mus-IgG (H + L) envärda Fab-fragment effektivt blockerar endogen mus-IgG-bindning genom antimus-sekundära antikroppar. Den E12.5 embryonal hjärta exciderades, snabbfrystes, cryosectioned, acetonfixerade, och immunfärgades.
Figur 7. s- α -actinin och aktin organisation i trabekulära koftaomyocytes på embryonala dag 12,5. Den LifeAct-RFPruby transgen mus linje användes för att visualisera filamentös aktin 19, medan musmonoklonalen klonen EA53 antikropp mot s-α-actinin användes för att märka Z-skivor och inskjutna skivor. Embryon PFA-fixerad. 0,2 ^ m optiska skivor uppsamlades såsom az stacken (A) Förenklad z stapel visar att s-α-actinin färgning var mer diffus i PFA-fixerad vävnad än i snäpp fryst och aceton fasta sektioner (figurer 2-5).. (B ) Förenklad z stapel visar både filamentös aktin och s-α-aktinin. Filamentöst aktin fluorescens lokaliserad mellan Z-skivor inom myofibriller (pilspetsar). Filamentöst aktin fluorescens observerades också i endokardiella celler som klär de trabekulära myocyter (pilar). (C) Tredimensionell vy av de trabekulära kardiomyocyter, sett från toppen av stacken. (D) Tredimensionell vy avde trabekulära kardiomyocyter, sett från botten av stapeln. Intensitet exponeringsmätare intervall 470-900 (av möjliga 0-65535) för både 488 nm laserkanalen och för 561 nm laser kanal i A och B; visningsintervall 460-800 för båda kanalerna i C och D. Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. 360 ° roterande 3D-vy över s- α -actinin och aktin organisation i trabekulära kardiomyocyter på embryonala dag 12,5. Bilden bunten från figur 6 framfördes i tre dimensioner med hjälp av Image J 3D Viewer plugin i Fiji bildanalysprogram. Intensitet exponeringsmätare intervall 470-800 (av möjliga 0-65535) för både de 488 nm och 561 nm laser kanaler. </ P>
Film 2. Valda 3D-vyer av s- α -actinin och aktin organisation i trabekulära kardiomyocyter på embryonala dag 12,5. Bilden bunten från figur 6 framfördes i tre dimensioner med hjälp av Image J 3D Viewer plugin i Fiji bildanalysprogram. Små rotationer runt x, y och z-axlarna visade relativt inriktade myofibriller inom hjärtmuskelceller men dålig anpassning mellan de flesta hjärtmuskelceller. Små rotationer visade också nära approximation av endokardiska celler som saknar s-α-actinin runt kardiomyocyter. Intensitet exponeringsmätare intervall 470-800 (av möjliga 0-65535) för både 488 nm och 561 nm laserkanaler.
Discussion
Den optimala vävnadsbindningsteknik och utspädning måste bestämmas empiriskt för varje antikropp. I våra händer, snap-frysning är överlägsen PFA fixering flera cardiomyocyte antigener, bland s-α-actinin, β-catenin, β1-integrin, tropomyosin, talin (visas ej) och N-cadherin; däremot ger PFA fixa överlägsna resultat för fokal vidhäftningskinas (ej visad). Proteintvärbindningar bildas av PFA kan maskera epitoper och begränsa antikroppsbindning; antigenåtervinning kan krävas i dessa fall, och metoder för antigenåtervinning kan hittas någon annanstans 20. PFA koncentration eller längd fixering kan minskas för att minska epitop maskering, med optimala förutsättningar empiriskt bestämts för varje antikropp och vid varje utvecklingsstadium. Lämpliga negativa kontroller bör användas när som kännetecknar en ny antikropp eller hjärt mutant, inklusive förimmunserum som den primära antikroppskontroll och en "ingen primär antikropp" control. Användning av knockout-möss är en idealisk negativ kontroll men tidig dödlighet hindrar deras användning för många av de genprodukter studeras här.
Användning av lämpliga volymer att helt dränka försöks- och kontrollglas i samma immunofluorescens blockering, antikropp, och tvättlösningar var viktigt eftersom var försiktig skakning av diabilder under inkubationstiden för att säkerställa en enhetlig exponering av sektionerna till lösningar. Detta tillvägagångssätt minimeras teknisk variation i färgning mellan sektionerna och diabilder inom ett experiment. När kostnaden begränsar antikroppslösningen volymen, använd en Pap penna för att begränsa flödet av lösningar bortom vävnadssnitt och hålla glider i en fuktig kammare under långa inkubationer. Om en monoklonal mus primär antikropp - och därför en anti-mus sekundär antikropp - används, kommer en andra blockeringssteg för att täcka endogena musimmunoglobuliner vara nödvändig (steg 3.4) för att minska ospecifik bakgrundssignal.
Lämpliga mikroskopi och bildbehandlingsteknik är avgörande för att få biologiskt korrekt information 21. Intensiteten histogrammet indikerar fördelningen pixlar vid varje intensitetsnivå (0-65.535 nivåer för en 16-bitars bild) för varje färg. Bakgrund, kan ljusstyrka och kontrast justeras genom att sätta en intensitet visningsintervall som flankerar histogrammet topp; att göra meningsfulla jämförelser mellan förhållandena, måste samma inställningar mellan kontroll och experimentella betingelser användas.
Protokollet ger en tillförlitlig metod för att analysera cardiomyocyte mognad och utveckling i den infödda embryonala musen hjärta. Medan immunofluorescens av cardiomyocyte specifika proteiner används ofta för att markera kardiomyocyter under utveckling, få studier använder tekniker som möjliggör hög upplösning analys av myofibrill struktur och uppkomsten av inskjutna skivor och costameres 12-14,22,23. Denna teknik kan användas för in vivo bedömning av mutationer som orsakar utvecklingsstörningar hjärtfel, som ett sätt att identifiera förändringar i cardiomyocyte mognad som kan belysa mekanismer för strukturella abnormiteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-α-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-βcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-β1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Risebro, C. A., Riley, P. R.
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
- Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
- Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
- Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
- Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
- Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
- Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
- Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
- Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
- Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
- Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
- Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274 (2010).
- Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
- Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
- Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
- Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).
