Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
Under hjärtutveckling, generering av hjärtspecifika strukturella och funktionella enheter inklusive sarkomerer, kontraktila myofibriller, inskjutna skivor och costameres kräver samordnade montering av flera komponenter i tid och rum. Störningar i montering av dessa komponenter leder till utvecklings hjärtfel. Immunofluorescerande färgning tekniker används vanligen i odlade kardiomyocyter att sondera myofibrill mognad, men detta ex vivo tillvägagångssätt begränsas av i vilken utsträckning myocyter kommer helt skilja på kultur, brist på normala in vivo mekaniska ingångar, och frånvaro av endokardiska ledtrådar. Tillämpning av immunofluorescenstekniker till studiet av att utveckla musen hjärta är önskvärt men mer tekniskt utmanande och metoder ofta saknar tillräcklig känslighet och upplösning för att visualisera sarkomerer i de tidiga stadierna av hjärtutveckling. Här beskriver vi en robust och reproducerbar metod att samarbeta immunostain multiple proteiner eller att samarbeta visualisera ett fluorescerande protein med immunofluorescens färgning i den embryonala musen hjärta och använda denna metod för att analysera utvecklings myofibriller, inskjutna skivor och costameres. Denna metod kan tillämpas ytterligare för att bedöma cardiomyocyte strukturella förändringar som orsakas av mutationer som leder till utvecklings hjärtfel.
Under utveckling, hjärtsammandragningar börjar snart efter kardiomyocyter migrera till mittlinjen och bildar den linjära hjärtröret 1,2. Sarcomere är den grundläggande kontraktila enhet inom cardiomyocyte; denna mycket organiserad cytoskelettala strukturen innehåller aktinfilament förankrade till Z-skivan genom sarcomeric α-actinin (s-α-aktinin) och myosin fibrer förankrade till M-linje (figur 1). Som cardiomyocyte mognar, sarkomerer samlas i serie för att bilda myofibriller som sträcker sig över cellen. Myofibrils är förankrade vid ändarna av cardiomyocyte av den inlagrade skivan, den cell-cell Junktional struktur som innehåller en övergångs korsning med en delmängd av Z-skivelement, exempelvis s-α-aktinin 3, adherens proteiner såsom N-cadherin och β catenin, gap junction proteiner, och desmosomer (Figur 1) 4. Längs längd membranet, Z-skivor av perifera myofibriller ocksåfäster cellmembranet via costameres; dessa specialiserade fokala sammanväxningar åstadkomma ett ankare mellan myofibrill, plasmamembran och extracellulär matris för att ge ytterligare strukturellt stöd till cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidigt i hjärtutveckling, är kardiomyocyter anordnade i fingerliknande utskott som kallas trabekulae som sticker in i det ventrikulära utrymmet och innehåller relativt mogna myofibriller 5. Som skrider hjärta utveckling, kardiomyocyterna i under epikardiell region förökar att bilda den kompakta myokardiet som omfattar kammarväggarna, men sarcomere och myofibrill montering fördröjs jämfört med trabekulära hjärtmuskeln 5,6.
Modeller av sarcomere och myofibrill montering kommer till stor del från immunofluorescens studier på odlade hjärtmuskelceller 7-10, som är enkel, men saknar en tredimensionell miljö, blodflöde, och kontakter med andra hjärtcells före in vivo. Högupplösta strukturella studier med immunofluorescens i musen embryonala hjärtat är tekniskt utmanande, och få studier har undersökt uppkomsten av inskjutna skivor och costameres under musen hjärt utveckling. Den adherens proteinet β catenin förefaller att lokalisera till inskjutna skivor av embryonala dag (E) 17,5 11, lokaliserar N-cadherin linjära strukturer som kan representera inskjutna skivor från E18.5 12 kontra postnatal dag 0 13, och costameres har avslöjats vid E18.5 14, men dessa proteiner visar diffusa och mer kontinuerlig membranfördelningen vid tidigare utvecklings tidpunkter 11-13.
Här beskriver vi en enkel och reproducerbar metod för immunfärgning och fluorescens mikroskopi av sektion mus embryonala hjärtan som möjliggör detaljerad analys av myofibrill och cardiomyocyte utveckling, inklusive uppkomsten av intercalated skivor så tidigt som E12.5 och begynnande costameres vid E16.5. Detta protokoll kan vara användbart för att sondera effekterna av mutationer på sarcomere bildning samt myofibrill och cardiomyocyte mognad.
Den optimala vävnadsbindningsteknik och utspädning måste bestämmas empiriskt för varje antikropp. I våra händer, snap-frysning är överlägsen PFA fixering flera cardiomyocyte antigener, bland s-α-actinin, β-catenin, β1-integrin, tropomyosin, talin (visas ej) och N-cadherin; däremot ger PFA fixa överlägsna resultat för fokal vidhäftningskinas (ej visad). Proteintvärbindningar bildas av PFA kan maskera epitoper och begränsa antikroppsbindning; antigenåtervinning kan krävas i dessa fall, och metoder för antigenåtervinning kan hittas någon annanstans 20. PFA koncentration eller längd fixering kan minskas för att minska epitop maskering, med optimala förutsättningar empiriskt bestämts för varje antikropp och vid varje utvecklingsstadium. Lämpliga negativa kontroller bör användas när som kännetecknar en ny antikropp eller hjärt mutant, inklusive förimmunserum som den primära antikroppskontroll och en "ingen primär antikropp" control. Användning av knockout-möss är en idealisk negativ kontroll men tidig dödlighet hindrar deras användning för många av de genprodukter studeras här.
Användning av lämpliga volymer att helt dränka försöks- och kontrollglas i samma immunofluorescens blockering, antikropp, och tvättlösningar var viktigt eftersom var försiktig skakning av diabilder under inkubationstiden för att säkerställa en enhetlig exponering av sektionerna till lösningar. Detta tillvägagångssätt minimeras teknisk variation i färgning mellan sektionerna och diabilder inom ett experiment. När kostnaden begränsar antikroppslösningen volymen, använd en Pap penna för att begränsa flödet av lösningar bortom vävnadssnitt och hålla glider i en fuktig kammare under långa inkubationer. Om en monoklonal mus primär antikropp – och därför en anti-mus sekundär antikropp – används, kommer en andra blockeringssteg för att täcka endogena musimmunoglobuliner vara nödvändig (steg 3.4) för att minska ospecifik bakgrundssignal.
Lämpliga mikroskopi och bildbehandlingsteknik är avgörande för att få biologiskt korrekt information 21. Intensiteten histogrammet indikerar fördelningen pixlar vid varje intensitetsnivå (0-65.535 nivåer för en 16-bitars bild) för varje färg. Bakgrund, kan ljusstyrka och kontrast justeras genom att sätta en intensitet visningsintervall som flankerar histogrammet topp; att göra meningsfulla jämförelser mellan förhållandena, måste samma inställningar mellan kontroll och experimentella betingelser användas.
Protokollet ger en tillförlitlig metod för att analysera cardiomyocyte mognad och utveckling i den infödda embryonala musen hjärta. Medan immunofluorescens av cardiomyocyte specifika proteiner används ofta för att markera kardiomyocyter under utveckling, få studier använder tekniker som möjliggör hög upplösning analys av myofibrill struktur och uppkomsten av inskjutna skivor och costameres 12-14,22,23. Denna teknik kan användas för in vivo bedömning av mutationer som orsakar utvecklingsstörningar hjärtfel, som ett sätt att identifiera förändringar i cardiomyocyte mognad som kan belysa mekanismer för strukturella abnormiteter.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |