Abstract
De electroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische methode voor het bepalen van retinale functie. Door het plaatsen van een elektrode op het oppervlak van de cornea, elektrische activiteit gegenereerd in reactie op licht kan worden gemeten en gebruikt om de activiteit van retinale cellen in vivo te evalueren. Dit manuscript beschrijft het gebruik van de ERG om de visuele functie te meten in de zebravis. Zebravis zijn al lange tijd gebruikt als een model voor gewervelde ontwikkeling als gevolg van het gemak van het gen onderdrukking door morfolino- oligonucleotiden en farmacologische manipulatie. 5-10 dpf, alleen kegels zijn functioneel in de larvale retina. Daarom is de zebravis, in tegenstelling tot andere dieren, is een krachtig model voor de studie van kegel visuele functie in vivo. Dit protocol maakt gebruik van standaard anesthesie, micromanipulatie en stereomicroscopie protocollen die gangbaar zijn in de laboratoria die de zebravis onderzoek uit te voeren. De geschetste methoden maken gebruik van standaard elektrofysiologie equipment en een weinig licht camera om de plaatsing van de opname micro-elektrode te begeleiden op de larvale hoornvlies. Tenslotte tonen we hoe een commercieel verkrijgbaar ERG stimulator / recorder oorspronkelijk ontworpen voor gebruik met muizen gemakkelijk worden aangepast voor gebruik bij zebravis. ERG van larvale zebravis biedt een uitstekende methode voor het bepalen van kegel visuele functie bij dieren die zijn gewijzigd door morfolino- oligonucleotide injectie, alsook nieuwere genoom engineering-technieken zoals Zinc Finger Nucleasen (ZFNs), transcriptie Activator-Like Effectorcellen Nucleasen (Talens), en Regelmatig Gegroepeerde afgewisseld met korte Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, die allemaal sterk verhoogde de efficiëntie en effectiviteit van gen targeting in zebravis. Bovendien benutten we het vermogen van farmacologische middelen aan zebravis larven de moleculaire componenten die bijdragen aan de photoresponse evalueren dringen. Dit protocol beschrijft een opstelling die kan worden gemodificeerd en gebruikt door onderzoekersmet diverse experimentele doelen.
Introduction
De elektroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische werkwijze die uitgebreid is gebruikt in de kliniek voor de bepaling van de functie van de retina bij de mens. De elektrische activiteit in reactie op een stimulus licht wordt gemeten door opname elektroden op het buitenoppervlak van de cornea. De kenmerken van de stimulus paradigma en de respons golfvorm hier de retinale neuronen bijdragen aan de respons. Deze werkwijze is aangepast voor gebruik met een aantal diermodellen zoals muizen en zebravissen. De typische gewervelde ERG response vier hoofdcomponenten: de a-golf, een cornea-negatieve potentiaal afkomstig van fotoreceptorcellen celactiviteit; de b-golf, een hoornvlies-positieve potentiële afgeleid van de ON bipolaire cellen; de d-golf, een cornea-positieve potentiaal geïnterpreteerd als de activiteit van de UIT bipolaire cellen; en de C-golf, die enkele seconden plaatsvindt na de B-golf weerspiegelt activiteit Müller glia en retinal pigment epitheel 1-4. Extra referenties voor het begrijpen van de geschiedenis en beginselen van ERG analyse bij de mens en het model dieren zijn de online leerboek, WebVision, van de Universiteit van Utah en teksten zoals de Principles and Practice of Clinical Electrofysiologie van Vision 4, 5.
Danio rerio (zebravis) is al lang favoriet als een model voor gewervelde ontwikkeling, vanwege de snelle rijping en transparantie, die het mogelijk maakt voor niet-invasieve morfologische analyse van orgaansystemen, gedrags-assays en zowel vooruit als achteruit genetische screens (voor een overzicht, zie Fadool en Dowling 6). Zebravis larven zijn zeer vatbaar voor genetische en farmacologische manipulatie, die, in combinatie met hun hoge vruchtbaarheid, maken ze een uitstekend diermodel voor high-throughput biologische analyses. De hogere verhouding kegels te staven larvale zebravis - ongeveer 1: 1 in vergelijking met muizen (~ 3% cones) - hen bijzonder bruikbaar voor de studie van conus functie 7-9.
In de gewervelde netvlies, kegeltjes ontwikkelen voordat staven 10. Interessant, zebravis kegels zijn werkzaam zo vroeg als 4 dpf, waardoor voor selectieve elektrofysiologische analyse van kegels in die fase 6, 11,12. Daarentegen ERG reacties in staven staan tussen 11 en 21 dpf 13. Daarom zebravis larven op 4-7 dpf dienen functioneel als een all-conus netvlies. Echter, de inheemse photopic ERG reactie van 4-7 DPF larven gedomineerd door de b-golf. Toepassing van farmacologische middelen, zoals L - (+) - 2-amino-4-fosfono-boterzuur (L-AP4), een agonist voor de metabotrope glutamaat (mGluR6) receptor door expressie ON bipolaire cellen blokkeert effectief de generatie van de b-golf en onthult de geïsoleerde kegel massa receptor potential, (de "a-wave") 14-17.
Hier beschrijven we een eenvoudige en reliable werkwijze voor ERG analyse met behulp van commercieel verkrijgbaar ERG materiaal bestemd voor gebruik met muizen die zijn aangepast voor gebruik met zebravis larven. Dit systeem kan worden gebruikt op zebravis larven van verschillende genetische achtergronden, evenals die behandeld met farmacologische middelen, onderzoekers helpen bij de identificatie van signaalroutes die bijdragen aan de visuele gevoeligheid en lichte aanpassing 16. De experimentele procedures die in dit protocol onderzoekers begeleiden bij het gebruik van ERG analyse van verschillende biologische vragen over visie beantwoorden, en tonen de constructie van een flexibele ERG setup.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke onderhoud en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comités van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill, en voldoen aan alle eisen van de NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare en de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International.
OPMERKING: Om larven voor ERG analyse te verkrijgen, gepubliceerde protocollen voor standaard zebravis veeteelt en onderhoud in dienst waren 18. Larven worden verkregen door middel van natuurlijke fokken en gehuisvest onder een 14 uur licht / 10 uur donker cyclus. Dit protocol is geoptimaliseerd voor larven aan 5-7 dagen na de bevruchting (dpf), maar zouden idealiter uitgevoerd op oudere vis met kleine aanpassingen aan de procedure. Hier, gebruik maken van de TL stam van wild-type zebravis larven op 5 DPF.
1. Micropipet Production
- Trek een aantal micropipetten behulp 1,5 x 0,86 mm (buitendiameter door binnendiameter) brand gepolijst borosilicaatglas haarvaten metfilament (smelttemperatuur, 821 ° C) en een P-97 Flaming / Brown Micropipet Puller uitgerust met doos warmte gloeidraad. Met het programma kneden micropipetten in tabel 1 beschreven.
- Controleer elke micropipet onder een microscoop met een passende rasterplaat liniaal om ervoor te zorgen dat de tips zijn 10-15 micrometer in doorsnede en heeft een gladde tip opening (dat wil zeggen, zonder gekartelde randen).
- Zorgvuldig te slaan micropipetten te tip schade en blootstelling aan stof te voorkomen. Opslag opties omvatten petrischaaltjes met lab tape, schuim gevoerde dozen, of in de handel verkrijgbare micropipette opslagcontainers.
OPMERKING: Andere micropipet trekkers en glas capillairen zolang de juiste diameter van de micropipet en een hoge kwaliteit tip bereikt worden.
| Druk | Hitte | Trek | Snelheid Tijd | |
| 500 | 560 | - | 30 | 200 |
| 500 | 450 | - | 30 | 200 |
| 500 | 410 | 55 | 40 | 200 |
Tabel 1: Programma voor de productie van micropipetten met een P-97 Flaming / bruin Micropipet Trekker voorzien van een vat verwarmd filament Micropipetten worden gemaakt onder toepassing van 1,5 x 1,0 mm2 (buitendiameter door binnendiameter) vuur gepolijst borosilicaatglas capillairen met gloeidraad. (smelttemperatuur, 821 ° C).
2. Buffer Voorbereiding
- Gebruik gefiltreerd geoxygeneerde goudvis Ringer buffer 19 in de micro-elektrode capillair en de polyvinylalcohol (PVA) spons waarop de larven worden geplaatst experimenten verzadigen. U kunt ook gebruik maken van de E3 embryomedium of Hank's Balanced Salt Solution.
- Pesticide 10x goudvis Ringer zoals beschreven in Tabel 2. Stel de pH 7,8 en gesteriliseerd met een 0,22 urn filter en bewaar de 10x voorraad bij 4 ° C.
- Maak een werkoplossing op de dag van het experiment door verdunning van de 10x Ringer's oplossing tot 1x met gedeïoniseerd, gedestilleerd water. Filteren met een 0,22 pm filter systeem. Oxygenate door borrelen met 95% O 2/5% CO 2 gas voor 10 minuten. Cap strak daarna dat de oplossing is zuurstof.
| NaCl | 1.25 M |
| KCl | 26 mM |
| CaCl2 | 25 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| glucose | 100 mM |
| HEPES | 100 mM |
3. electroretinogram Platform
- Voer ERG experimenten op antivibratietafel in een Faraday kooi de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Bevestig een aangepaste stalen platform om de anti-vibratie tafel met behulp zeskantmoeren. Plaats een beweegbaar kunststof platform met een visco-elastische urethaan polymeer schokabsorberende bodem op de tafel onder de lichtbron.
- Plaats de camera met een gemagnetiseerde stand, naar beneden gericht op de beweegbare kunststof platform. Plaats de micromanipulator met een tweede gemagnetiseerde stand rechts van het beweegbare kunststof platform (die de opname micro-elektrode houdt). Zorg ervoor dat de camera en micromanipulator niet gestoord worden door de beweging van andere apparatuur en dat zij geen verlichting van de lichtbron hoeft te blokkeren.
- Sluit de camera aan op een video-monitor en de positie van het aan het oog van de te bekijkenlarve voor het plaatsen van de elektrode in de juiste positie.
- Zorg ervoor dat de installatie goed geaard is met koperdraad. Om het geluid te controleren, plaatst u de referentie-elektrode en de punt van de opname micro-elektrode in een 35 mm petrischaal gevuld met Ringer-oplossing. Controleer de elektrische geluidsniveaus van de setup met een oscilloscoop of een ingebouwde functie van de ERG apparaat. Geluidsniveau mag niet meer dan ± 10 mV ten opzichte van baseline zijn.
4. Spons Voorbereiding
- Snijd een kleine rechthoek van droge PVA spons die goed past in een 35 mm petrischaal. De dikte van de spons niet groter dan de diepte van de schotel. Gebruik een mes met een schone scheermesje voor het snijden.
- Een aanvullend gesneden in de spons met de referentie-elektrode geschikt (een ondiepe snede lengterichting op de bodem van de spons of een vlinder die verticaal door een van de kleinere uiteinden).
- Gebruik een chemisch resistente markereen kleine stip op de spons (waar de larven worden geplaatst) die kunnen worden gebruikt voor het positioneren van de camera te markeren.
- Week de PVA spons in Ringer-oplossing tot verzadiging. Verwijderen en dep snel op een papieren handdoek 2-3 keer. Plaats de spons in een schone 35 mm petrischaal.
- Plaats de petrischaal met de spons op de plastic platform zodanig dat het merkteken kan worden gevisualiseerd door de camera.
5. Elektrode Voorbereiding
OPMERKING: De zebravis opstelling bestaat uit een referentie-elektrode in contact met Ringer-oplossing verzadigd PVA spons en een registratie-elektrode in contact met de cornea. De referentie-elektrode bestaat uit een Ag / AgCl pellet. De registratie-elektrode is een getrokken glas micropipet gevuld met Ringer-oplossing en in het bezit van een micro-elektrode houder met daarin een Ag draad.
- Chloride de elektroden door weken in 6-9% natriumhypochloriet (bleek) gedurende 5 min (de opname microelectrode draad) of 15 min (de referentie-elektrode). Lucht drogen op een Kimwipe voor 5 min.
- Afhankelijk van het soort snede gemaakt in stap 4.2, plaatst de Ag / AgCl pellet van de referentie-elektrode in (voor verticale vlinder cut) of onder (de ondiepe snede lengte onderaan) de spons. Bevestig de referentie-elektrode leiden tot de opname-systeem.
- Als alternatief, als de ERG setup heeft beperkte ruimte of zijn er bijzonder sterk fotovoltaïsche artefacten uit de Ag / AgCl elektrode, sluit de referentie-elektrode naar de spons via een agar zout brug naar de elektrode uit het lichtpad te verplaatsen.
- Hechten ~ 40 cm van de juiste maat slang aan op een 5 ml lock niet-Luer spuit. Vul de spuit met Ringer-oplossing. Micro-elektrode houders bezitten druk poorten worden doorgaans geleverd met adapters om slangen met een binnendiameter van 1/16 tegemoet ", 3/32", 1/8 "en 5/32".
- Vul een 1 ml niet-Luer lock spuitRinger-oplossing en, met behulp van een Micro-fil, aandachtig en vullen de micro-elektrode houder. Voorkomen de vorming van bellen.
- Maak de spuit 5 ml de drukpoort van de micro-elektrode houder buizen en gebruiken zodat de micro-elektrode houder vol Ringer's oplossing. Met behulp van de Micro-fil en 1-ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing, vul het micropipet glas uit de tip en zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Bevestig de glazen micropipet om de micro-elektrode houder, let daarbij goed op de elektrode draad recht te houden. Eenmaal bevestigd, gebruikt de spuit 5 ml Ringer's oplossing door de micro-elektrode voorzichtig dwingen tot een kleine hoeveelheid oplossing is zichtbaar op de tip. Incidenteel toepassing van druk op de spuit (indien niet toegepast op cornea) zal de vorming van luchtbellen, en occlusies vanwege stof of zout ophoping voorkomen in de micropipet tip.
- Als de oplossing naar buiten komt als een stroom, vervang dan de glass micropipet, de punt opening te groot of beschadigd.
- Plaats voorzichtig de opname micro-elektrode in de micromanipulator en bevestig de kabel aan op de opname-systeem.
6. electroretinogram Analyse
LET OP: Door de kegel dominantie van de larvale netvlies, kan een hoge kwaliteit ERG resultaten worden verkregen wanneer de voorbereidingen voor de opname worden uitgevoerd onder lage niveaus van indirecte wit licht (<1 lux) of met korte periodes (<1 min) van hogere intensiteit ( ≤250 lux) werkverlichting. Een korte periode van aanpassing aan het donker is nog steeds nodig voorafgaand aan de opname (zie stap 6.7). Echter, experimenten bij weinig rood of infrarood licht worden uitgevoerd met een infrarood gevoelige camera. Alle experimenten werden in steriel gefiltreerd (0,22 pm) systeem water uit de UNC zebravis aquacultuurvoorziening maar alternatieve embryo media kunnen worden gebruikt.
- Snijd papieren handdoek vierkanten van ongeveer 1cm2.
- Als het meten van geïsoleerde kegel massa receptor potential, incubeer 3-5 larven in het systeem water met 500 uM (±) -2-amino-4-phosphonobutyric zuur (APB) gedurende 5 minuten.
Opmerking: hoewel APB is een racemisch mengsel van de actieve (L) en inactieve (R) vormen van AP4, is even effectief als L-VA4 en goedkoper. - Verdoven 3-5 larven in het systeem water met 0,02% (w / v) tricaïne totdat reageert, ongeveer 1-2 minuten.
- Gebruik een Pasteur pipet en pipetpomp individuele larven zorgvuldig overbrengen op papier handdoek pleinen onder een dissectie stereoscoop met minimale verlichting (≤250 lux voor <1 min). Controleer de positie van elke larve en kiezen voor een kandidaat die is dorsale zijde omhoog met een unoccluded oog.
- Voor langere opnames (> 30 min), houden de larve vochtig door verglazing van het lichaam tot aan, maar niet met inbegrip van het hoofd met 3% methylcellulose met een fijn kameelharen borstel.
- Met behulp van een tang, overdracht van de papieren handdoek square met de larve van de vochtige PVA spons.
- Voor langere opnames (> 30 min), toepassen van een continue stroom van waterverzadigde 100% O2 gas over de larve door doorleiden het gas door een uitstroomsteen in een zijarm kolf met gedestilleerd water. Plaats de slang de kolf zijarm dat de bevochtigde zuurstof in de buurt van het hoofd van de larve straalt verlaten.
OPMERKING: Stap 6.4.1 en 6.5.1 stap zal de levensduur verlengen van de vis 16.
- Voor langere opnames (> 30 min), toepassen van een continue stroom van waterverzadigde 100% O2 gas over de larve door doorleiden het gas door een uitstroomsteen in een zijarm kolf met gedestilleerd water. Plaats de slang de kolf zijarm dat de bevochtigde zuurstof in de buurt van het hoofd van de larve straalt verlaten.
- Onder minimale verlichting, gebruik dan de micromanipulator en camera aan de micro-elektrode tip positioneren in het midden tussen de neus en de caudale uiteinden van het oog en druk voorzichtig op de dorsale grens van het hoornvlies.
OPMERKING: verkeerd gerichte van de elektrode naar het verre distale gebieden van het hoornvlies kan resulteren in ERG golfvormen van omgekeerde polariteit. - Laat larve tot donker-passen voor 5-10 min.
- Recordtestwinnaar flash reacties op licht voorzien van een LED-lichtbron of optische stimulator met behulp van de beschiketiket stimulatie en opnameapparatuur. Pas protocol parameters zoals flitsintensiteit, flash lengte, flash kleur, achtergrond intensiteit en kleur en filter instellingen om het experiment te passen.
- Wanneer u klaar bent met het experiment, euthanaseren larven volgens AVMA / IACUC richtlijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gewoonlijk ERG worden geregistreerd van zebravis larven 5 dpf, aangezien een aantal studies ERG opnames gepubliceerd in dit stadium 9, 16,20. Larvale reacties werden gemeten onder donker aangepaste voorwaarden zonder achtergrond verlichting met behulp van een 20 msec stimulans van wit LED licht. We gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbaar ERG systeem dat bestaat uit een Ganzfeld licht stimulator en computer controller / recorder. De stimulator gebruikt een strak eigen pulsbreedtemodulatie (PWM) systeem om de luminantie van zowel de achtergrond en flash stimulus controleren. Reacties werden opgenomen met een eigen volledig differentiële versterker met een hardware anti-aliasing filter besturen van een 16-bit analoog-digitaalomzetter (ADC). Stimulus en respons opnames werden gecontroleerd door proprietary software die bij de apparatuur volgens protocol van de fabrikant. Onze apparatuur is geprogrammeerd om een sampling rate van 1 kHz te gebruiken, digitale Bessel CASCade filters ingesteld op een bandpass van tussen de 0.312 Hz en 300 Hz, en een 60 Hz notch filter om overtollige ruis te verwijderen. In het donker aangepaste larve b-golf amplitude toeneemt met toenemende lichtintensiteit (figuur 1). Het a-golf wordt typisch gemaskeerd door de B-golf en kunnen niet betrouwbaar worden gedetecteerd. De B-golf kan worden geblokkeerd door incuberen van de larven van de metabotrope glutamaat receptor (mGluR6) agonist, 4-fosfono-boterzuur (APB). Dit maakt de conus massa receptor potentiaal (of "a-wave") te detecteren. Deze "a-wave" reactie toeneemt met toenemende amplitude lichtintensiteiten (figuur 2).
Extra paradigma's kunnen worden gebruikt om visuele parameters waarop elementaire visuele functie en gevoeligheid te testen. Door het gebruik van een dubbele flash paradigma, kan men het vermogen van de kegel photoresponse te herstellen van de oorspronkelijke prikkel (Figuur 3A) te meten. Aangezien de interstimulus interval(ISI) verhogen de amplitude van de tweede respons toeneemt, wat aangeeft herstel van de oorspronkelijke prikkel (Figuur 3B). De APB-geïsoleerde "a-wave" sporen gepresenteerd zijn het gemiddelde van drie sweeps en conform gepubliceerde verslagen van de zebravis larven ERG gebruik vergelijkbare stimulatie paradigma 2, 9,16.
Figuur 1: Typische ERG opname in 5 dpf larvale zebravis. De intensiteit serie is verkregen onder donker aangepaste voorwaarden. De vissen worden blootgesteld aan LED-wit licht voor een duur van 20 msec met intensiteiten gelijk aan 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1.250, 2.500 en 5.000 cd / m 2. Het begin van het licht stimulus wordt aangegeven met de gestippelde verticale lijn. De negatieve potentieel een-wave (verticale pijl) is moeilijk te onderscheiden, terwijl de positievepotentiële b-golf (hoek pijl) is de dominante piek van de golfvorm. Een kleine fotovoltaïsche artefact kan worden waargenomen als een minder positieve uitslag voorafgaand aan het intreden van de a-golf. Inzet, gemiddeld b-golf reactie amplitudes met toenemende intensiteit van het licht dat zijn passen met behulp van de Naka-Rushton vergelijking 21, 22. Fout balken geven SEM.
Figuur 2: APB-geïsoleerde kegel massa receptor potential opgenomen van larvale zebravis Intensity serie verkregen onder donker aangepaste voorwaarden op 5 dpf.. De stimulus is een 20 msec LED wit licht met intensiteiten gelijk 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1.250, 2.500 en 5.000 cd / m 2. Het begin van het licht stimulatie wordt aangegeven met de gestippelde verticale lijn. De geïsoleerde kegel massa receptor potentiaal ("a-wave") is het dominerende bestanddeel van de golfvorm (pijl). Een kleinefotovoltaïsche artefact kan worden waargenomen als een minder positieve uitslag voorafgaand aan het intreden van de kegel respons. Inzet, gemiddeld reactie amplitudes met toenemende intensiteit van het licht dat zijn passen met behulp van de Naka-Rushton vergelijking. Fout balken geven SEM.
Figuur 3:.. Cone massa receptor potential opname onder toepassing van een dubbele flits paradigma A 5 dpf APB-behandelde larve werd onderworpen aan twee 20 msec flitsen van wit licht (LED bron), elk met een intensiteit van 1000 cd / m 2 (A) De respons op 2 opeenvolgende flitsen met interstimulus interval (ISI) gelijk aan 2 sec. Lichte blootstelling worden gekenmerkt door gestippelde verticale lijnen. De amplitude van de tweede respons is lager dan die van de eerste reactie, wat duidde op onvolledige reactie herstel. (B) De verhouding van de maximale geïsoleerde kegel massa receptor potentieel respons van de tweede stimulus die van de oorspronkelijke prikkel voor elke ISI. Een best-fit niet-lineaire regressie-analyse is toegepast. Zoals de ISI toeneemt, de reactie op de tweede stimulus stijgingen in amplitude ten opzichte van de respons op de initiële stimulans te geven progressief herstel van de fotoreceptoren gevoeligheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol een eenvoudige procedure voor ERG opnames van larvale zebravis is gedetailleerd. Deze procedure zorgt voor een snelle en uitgebreide analyse van de visuele function.There zijn verschillende kritische stappen tijdens de hele procedure die moet in gedachten worden gehouden. De zebravis larven moeten gezond zijn voor het experiment te overlijden tijdens potentiële behandelingen met medicijnen te voorkomen en te zorgen voor langdurige levensonderhoud tijdens de ERG opnames. Bovendien is het belangrijk dat de larven gebruikt in experimenten nauw vergelijkbare leeftijd. Dit komt door de snelle ontwikkeling van de retina (dwz de differentiële ontwikkeling kegel subtypes) en ook de algehele morfologie en fysiologie van de larven. Bijvoorbeeld, na 7 dpf de efficiëntie van epitheliale transpiratie vermindert het moeilijker om de vissen leven. Een andere belangrijke factor is de kwaliteit van de opname en referentie-elektroden. Zorg moet worden genomen bij het trekken van glas haarvaten om te voorkomen dat ruwe randen tips. Een micropipet microforge kunnen worden gebruikt om brand-polish getrokken elektroden en hulp aan signaal acquisitie te verbeteren. Bovendien handhaven van de kwaliteit van de Ag / AgCl-elektroden is erg belangrijk. Na gebruik moeten zij worden gespoeld met gedestilleerd water en lucht onmiddellijk gedroogd. Terwijl donker worden van het buitenoppervlak van de elektroden kan optreden bij tijd en niet de prestatie aangetast (geel tot donker rood) of kuiltjes elektroden moet worden vermeden. Vermijd afhandeling elektroden met blote handen, zoals eiwit besmetting nadelig kan beïnvloeden gedrag elektrode. Tenslotte zij opgemerkt dat Ag / AgCl elektroden lichtgevoelig en kan leiden tot flash artefacten als zij niet beschermd. Wij hebben echter deze artefacten vonden minimaal zijn (zie legenda van de figuren 1 en 2) en niet interfereren met onze metingen van de larvale zebravis reacties op stimuli knipperen. Als alternatief kan een zoutbrug worden gebruikt om de Ag / AgCl-elektrode om de spons aansluit met een agar nvlt brug naar de elektrode uit te gaan van het lichtpad. Hoewel een zoutbrug wordt in gelijkstroom (DC) opnamen de elektrodepotentiaal 23 stabiliseren, gebruikt de ERG opname wisselstroom (AC). Daarom is het enige doel van een zoutbrug in dit systeem zou zijn als de specifieke setup heeft beperkte ruimte of bijzonder sterke fotovoltaïsche artefacten.
ERG heeft verscheidene voordelen boven andere technieken om visuele functie te meten. Het belangrijkste voordeel is dat het een in vivo opname. Het nadeel is dat de activiteit van specifieke cellen worden afgeleid uit de golfvorm niet rechtstreeks meten, zoals voor zuig-elektrode of patch clamp fotoreceptoren en andere cellen in het netvlies is. Normaal afzuigelektrode opnamen patch clamp en hele retina ERG het voordeel dat farmacologische agentia gemakkelijk kan worden ingebracht in cellen de moleculaire componenten definiërenvan de reactie, terwijl dit moeilijker in vivo in zoogdieren modellen. De permeabiliteit van de zebravis larven dergelijke agentia overwint dit nadeel.
Analyse van donker aangepaste larven in afwezigheid van farmacologische middelen veroorzaakt een ERG golfvorm gedomineerd door de B-golf, een resultaat dat is waargenomen door een aantal andere groepen 2, 9,24 -26. We demonstreren de mogelijkheid om de conus massa receptor potentiaal isoleren door te profiteren van het vermogen van farmacologische middelen aan larvale zebravis dringen. Larven behandeld met APB weer een intrekking van de b-golf, waardoor de "a-wave" te worden gevisualiseerd 14-17. Golfvormen met een uitstekende signaal-ruis verhoudingen werden verkregen door het gemiddelde van 3 veegt. Variatie in de reactie golfvormen wordt soms opgemerkt, maar Makhankov et al. 2 hebben gerapporteerd dat de variantie in herhaalde metingen van hetzelfde dier minderdan die waargenomen tussen individuen. Daarom is de variantie waarschijnlijk het resultaat van biologische variatie plaats variabiliteit in de techniek.
We ook gebruikt ERG analyse conus herstel in vivo met een dual flash paradigma, vergelijkbaar met gepubliceerde resultaten in de aanwezigheid en afwezigheid van achtergrondverlichting 9, 16 onderzocht. Dit werd bewerkstelligd door het meten van het vermogen van de larvale netvlies te reageren op opeenvolgende flitsen van verschillende ISI. Bij gebruik in combinatie met farmacologische middelen of genoom techniek strategieën, zoals Talens om knock-out pad targets, de zebravis is krachtig systeem voor de in vivo studie van de moleculaire mechanica van kegel aanpassing en visuele herstel.
Onze werkwijze en apparatuur kunnen gemakkelijk worden aangepast aan geïsoleerde larvale ogen, oudere zebravissen en andere vertebraten 27 onderzocht 28. In feite, de ERG stimulatie en registratiesysteemdat we gebruiken is hoofdzakelijk ontworpen voor gebruik in een klinische setting en vervolgens aangepast voor experimenten op muizen. Het aanpassen van het platform voor zebravis larven was eenvoudig en kan gemakkelijk worden overgenomen in andere laboratoria voor lage kosten. Soortgelijke opstellingen bestaande uit klassieke elektrofysiologische apparatuur kunnen worden geconstrueerd tegen minimale kosten en is aangetoond dat betrouwbare resultaten 16 verschaffen. Kortom, deze techniek is van groot voordeel voor onderzoekers die de mechanismen van visuele functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
- Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B.
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C.
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
