Summary
在这里，我们提出描述体肝移植含氧易地灌注机的协议。本文包含一步步协议采购和准备肝移植的灌注机，准备灌注液，素灌注机，并执行肝移植的含氧常温灌注机。
Abstract
相对于传统的静态低温保存（0-4°C）， 易地灌注机可以提供更好的保护供肝。器官的连续灌流提供了机会，改善器官的质量，并允许移植前供肝易地可行性评估。这个视频文章提供了分步协议易地人供体肝脏的常温灌注机（37°C）使用的设备，提供了肝动脉和门静脉的连续灌流的压力和温度控制脉冲灌流。灌注流体由两个中空纤维膜氧合充氧，温度可以在10°C和37℃下进行调节。在灌注期间，肝脏的代谢活性以及损伤的程度可以通过从灌注流体取样的生化分析进行评估。灌注机是一个非常有前途的工具增加肝脏适合于移植的数量。
Introduction
器官保存在肝移植目前的方法是冲洗出来，并与供肝的后续存储在寒冷的（0-4°C）保存液（如威斯康星溶液或组氨酸，色氨酸酮戊二酸溶液大学）。这种方法被称为静态冷库（SCS）。尽管肝脏在0-4℃下的代谢率是很低的，仍有0.27微摩尔氧/分钟/克肝组织，这是不能SCS 1期间提供的需求。 SCS的常规方法，因此，导致在一定程度的供体肝脏的（附加的）损伤。虽然这一数额保存损伤是不是质量好供肝的一个问题，它可以成为次优的肝脏已经遭受一定程度损伤的供体的一个关键和限制因素。出于这个原因，肝脏与次优的质量或所谓的扩展标准供体（ECD）肝脏经常拒绝用于移植的风险ö˚F早期移植失败被认为是太高了。对移植肾功能延迟，主要的非功能和非吻合口胆管狭窄（NAS）的高利率已经在肝脏接受者循环死亡（DCD），旧的捐助者或脂肪肝移植2收件人描述后从捐赠。 NAS是发病率和死亡率的肝脏移植后的一个主要原因。 NAS可能发生在两个预算外和捐助者的肝内胆管，可伴有导管内胆泥和铸造形成3,4。尽管NAS的病因被认为是多因素的，在移植保存和移植胆管缺血/再灌注损伤已被确定为主要的潜在机制2,5。一个DCD移植物的移植已被确定为最强的危险因素为NAS的发展中的一个。一段暖缺血的一个DCD供体，器官保存在冷缺血随后再灌注的组合，和在收件人损伤被认为是负责胆管可逆损伤，这在与胆管的不良再生能力结合，导致纤维化瘢痕和胆管的变窄肝移植2,5-之后。 NAS已经报道了高达接收DCD肝6-8 30％的患者。它已经很清楚，SCS的用于移植的当前方法肝移植是不足以preinjured ECD肝脏如来自DCD供体。需要其他方法来增加和优化利用ECD肝脏移植。
机灌注（MP）是器官保存，其可以提供供体器官的保存较好，相比SCS的方法。 MP可以是特别相关的ECD移植物的保存。 MP的一项重要优点是有可能向在保存期间提供氧气的移植物。 MP可以在各种温度下进行，已被列为低温（0-10℃），subnormothermic（10-36℃）和常温（36-37℃），MP（NMP）。取决于用于MP的温度，灌注流体的类型必须调整并随着温度的升高更多的氧气应提供。 MP在人肝移植的第一个临床应用是基于低温灌注未经灌注流体9,10的活性氧。在动物模型中，低温氧化的MP（0-10℃）已经显示出具有抗缺血的保护作用/肝的再灌注损伤移植物11，并提供更好的保存胆汁的胆管周围血管丛的管道12。 Subnormothermic含氧的MP在20℃或30℃下也进行了研究的动物模型，并且显示出提供早期恢复DCD肝脏移植物功能，相比SCS 13,14。人类肝脏subnormothermic充氧MP的可行性RECently报道了七人丢弃的供肝15。 NMP（37℃）允许接枝生存能力和现有功能的评估移植16,17。此外，MP允许肝移植物的逐渐复温移植前，这已被证明有利于恢复的移植物18和复苏。
在当前协议肝灌注机中使用的灌注装置能够双重灌注（通过门静脉和肝动脉）使用两个离心泵，即提供连续的门脉血流和脉动的动脉血流。该系统的压力进行控制，从而自动调节流经肝脏，取决于肝内阻力。两个中空纤维膜氧合允许肝移植物的氧合作用，以及用于除去的CO 2。该温度可根据期望的类型的MP（最小Temperat .. [温度设定 10℃URE）。流量，压力和温度的显示装置实时地允许灌注过程的连续控制上。一种新的一次性无菌集油管，水库及氧合可用于每个移植（ 图1）的灌注。
这个视频文章的目的是提供一个一步一步的协议，使用这种新开发的肝脏灌注机人供体肝脏的易地常温灌注机。
图1：（A）的概略图，（B）中的灌注机的照片，（C）的人工肺的更近的视图，以及（D）用于人类供体肝脏的常温灌注离心泵。获得=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
该协议已获得医学伦理委员会的格罗宁根大学医学中心的（Medisch Ethische Toetsingscommissie），荷兰。
1.制备灌注流体
注意：根据这个协议准备常温灌注机的灌注流体的总体积是2233毫升和灌注流体的目标容量渗透摩尔浓度是302 mOsmol /升。
- 从表1中描述的灌注流体的部件，保持人聚集的红血细胞，新鲜冰冻血浆和人白蛋白分离。混合各组分的其余部分以无菌的方式，并存储到手术室（OR）的溶液在无菌袋中运输。在无菌环境中（理想的是良好生产规范设施）或在层流柜中的培养室做到这一点。
| 组件 | 数量 |
| 聚集的红血细胞（血细胞比容60％） | 840毫升 |
| 新鲜冰冻血浆 | 930毫升 |
| 人白蛋白为200g / L（Albuman，Sanquin） | 百毫升 |
| 修改肠外营养（Clinimix N17G35E，百特国际公司） | 7.35毫升 |
| 多种维生素输液（Cernevit，百特国际有限公司） | 7微升 |
| 集中微量元素输液（Nutritrace，贝朗Melsungen的AG） | 7.35毫升 |
| 甲硝唑用于静脉给药（5毫克/毫升）（灭滴灵，赛诺菲 - 安万特） | 40毫升 |
| 头孢唑林1000毫克瓶5毫升粉用于静脉内给药（Servazolin，山德士） | 2毫升 |
| 速效胰岛素（100IU / ml）的（Actrapid®，诺和诺德公司） | 20毫升 |
| 葡乳醛酸钙，静脉内溶液10％，137.5毫克/毫升（Sandoz公司） | 40毫升 |
| 无菌水2 O | 51.3毫升 |
| 0.9％的NaCl溶液 | 160毫升 |
| 碳酸氢钠8.4％的溶液 | 31毫升 |
| 肝素5000 IE /毫升静脉给药 | 4毫升 |
| 总 | 2233毫升 |
表1：的直流电阻灌注的液体TS 16。
- 转让人聚集的红血细胞（840毫升），新鲜冷冻血浆（930毫升），人白蛋白为200g / L（100ml）中，并在步骤1.1到OR制备的溶液被施用于灌注设备。
2.灌注灌注设备的
- 添加灌注流体的部件，包括人类堆积的红血细胞，新鲜冷冻血浆，人白蛋白和经由连接器上的充氧的顶部在步骤1.1中制备的溶液到机器并从管道的所有气泡。
- 交换机上的静脉泵，并按照屏幕上的制造商的说明。然后打开动脉泵，并按照屏幕上的制造商的说明。
- 按照屏幕上的说明空对抗大气压的压力米。这确保了在perfus测得的压力离子是在门静脉和肝动脉的水平的实际压力。
- 启动用氧合卡波金（95％O 2 + 5％CO 2）以4升/分钟的流速。空气流将在两个充氧器之间进行分配（每个氧合2升/分钟），这应导致约60千帕的PO 2（或450毫米汞柱）在灌注流体。对于较长的灌注，最好使用单独的氧气和二氧化碳的来源。这允许在将O 2 / CO 2的比率小的调整，其可用于调节pH值和灌注流体的pCO 2。
- 取一个灌注样品用于血液气体测量15-20分钟设备已催芽后，并相应地监测pH值和电解质。
注：确保服用样品前丢弃约3ml灌注流体，因为这种流体是在外围管道，并不代表在系统中的灌注流体。添加8.4％的碳酸氢钠solution为缓冲能力，旨在为生理pH（7.35-7.45）。例如，添加25-35毫升的8.4％碳酸氢钠溶液和通过取样品用于血液气体测量定期检查在灌注流体的pH值和碳酸氢盐水平。
3.采购和供肝的制备
注：使用就地冷却的标准技术采购机关和冲洗与冷保存液（0-4°C）19。以促进动脉插管，离开附着到肝动脉（ 图2A）的supratruncal主动脉的片段。
- 冲洗出来的胆管与保存液（ 即威斯康星解决方案，大学）。结扎胆囊管与外科缝合线。
- 包和存储在一个标准的无菌供体器官袋器官和碎冰后续运输到MP中心框。
- 开始表背过程中的手术室供肝抵达后立即。
- 取为至少10毫升保存液用于微生物测试的样品。
- 取出膈肌附着物肝脏的裸露区以及从腔静脉手术剪的上袖任何剩余心肌。
- 解剖动脉和门静脉解剖用剪刀和结扎侧枝使用手术缝合线或hemoclips。
- 使用不可吸收单丝缝合线（ 例如，3-0 Prolene线）关闭supratruncal主动脉段的远端。插入动脉插管进入supratruncal主动脉的近端和带缝线（ 图2A）固定。使用由灌注设备的制造商提供设置在一次性包插管。
- 插入在门静脉的静脉插管，并与缝合线固定。使用在dispos提供的套管能够包。肝静脉仍然uncannulated。
- 冲洗出胆管与保存液。插入硅导管进入胆管并用缝线固定。
注意：不要插入导管过深地进入胆管，因为这可能会造成伤害胆管上皮细胞。 - 通过门静脉插管冲洗用0.9％的NaCl溶液中的肝如下：
- 如果接枝已在威斯康星溶液作为保存溶液大学被保存下来，冲洗出2,000毫升冷（0-4℃）的0.9％NaCl溶液中的肝接着500ml温水（37℃）的0.9％NaCl解决方案。
- 如果接枝已经在组氨酸 - 色氨酸酮戊二酸溶液，作为保存液被保存下来，冲洗出1000毫升冷（0-4℃）的0.9％NaCl溶液，然后用500ml温水（37℃）0.9肝脏％的NaCl溶液。暖冲洗的目的是为了防止在的温度的显著下降灌注液。
- 立即肝脏连接到灌注设备之前执行的热烈齐平。
注意：始终保持温暖和冲洗NMP开始小于1-2分钟之间的持续时间。
| 捐赠者的特征（N = 12） | 数（％）或中值（IQR） |
| 年龄（岁） | 61（50-64） |
| 性别男） | 8（67％） |
| 捐赠者类型 DCD，马斯特里赫特III型 DBD | 10（83％） 2（17％） |
| 身体质量指数（BMI） | 27（25-35） |
| 拒绝理由 DCD +年龄> 60岁 DCD +高体重指数 DCD +种种原因* 严重的脂肪变性 | 5（41％） 3（25％） 2（17％） |
| 保存液 UW液 HTK液 | 6（50％） 6（50％） |
| 在DCD供体热缺血时间（分钟） | 14（17 - 20） |
| 冷缺血时间（min） | 389（458-585） |
| 供体风险指数（DRI） | 2.35（2.01-2.54） |
表2：供体特性 *静脉吸毒一移植供体的历史和长期捐助SO 2 <撤销生命支持再移植后的30％。 缩写：DCD，循环死后捐赠; DBD，脑死亡后捐献;威斯康星州的华盛顿大学，大学; HTK，组氨酸 - 色氨酸酮戊二酸
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图2：（A）图片已准备对表背和人类供体移植物（B - D）随后灌注normothermically。 （A）中的动脉插管插入surpratruncal主动脉和静脉插管插入门静脉。胆管插管与硅胆汁导管。 （B）的肝脏被定位在器官腔与它的前表面朝下，插管连接到灌注设备的管路。 （C）30分钟的常温灌注机开始后。 （D）的常温灌注机开始后6小时。在操作过程中该器官腔覆盖有透明盖，以保持无菌湿润环境对肝脏（在这些照片中未示出）。“>点击此处查看该图的放大版本。
4.常温灌注机
- 定位在器官腔肝脏与前表面朝下。立即通过门静脉插管连接到灌注装置的门户流入管和动脉插管装置的动脉流入管连接的肝脏到底漆灌注设备。
- 按照屏幕上的制造商的说明书开始灌注这两种门户和动脉侧。设定在70毫米汞柱的平均动脉压和在11毫米汞柱的平均门静脉压。
- 取灌注流体样品每30分钟为的血气参数直接分析（PO 2，的pCO 2，SO 2，HCO 2 -和pH值），并使用常规的血液气体分析生化参数（葡萄糖，钙，乳酸钙，钾和钠） 。一定要丢弃约3ml灌注取的样品中，因为该流体在外围管道，并不代表在系统中的灌注流体之前流体。
- 取这些样品吸用1ml注射器从采样连接器，可在一次性管路灌注装置的一部分的灌注流体。对于每个样品使用新的注射器，并立即从注射器在灌注流体抽吸除去任何气泡。然后插入在血液气体分析仪的注射器，然后按照分析仪的手册中提供的制造商的说明。
- 从灌注液收集血浆，冷冻并储存在-80℃用于测定碱性磷酸酶（ALKP），γ-谷氨酰转移酶（γ-GT），丙氨酸转氨酶（ALT），尿素和总胆红素。 5分钟的灌注流体的离心在1500×g离心，4℃后收集血浆。
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Representative Results
这是由于各种原因拒绝移植12人的肝脏获得知情同意从捐赠者家庭的调研后使用。捐赠者的特征是通过使用本文中描述的协议表2中描述的人类供体肝脏灌流normothermically 6小时。肝移植物的质量被监测肝灌注（ - D图2A）的宏观均匀性进行评价。肝脏的血流动力学通过监测变化的动脉和门的流动进行评估。在肝动脉和门静脉流和流的随后稳定的初始增加进行观察，结果为256±16毫升/分钟的平均动脉流量（平均±SEM）和748±34毫升/平均门静脉流分（平均值±SEM）在6小时，表明在灌注（ 图3A）的肝脏的血流动力学稳定。 BL从动脉灌注流体收集灌注液样品的洪水气体分析来监测氧合在灌注流体的状态。氧合卡波金（95％O 2和5％CO 2）以4升/分钟的流量产生了连续的 O 2饱和度的100％。 图3B显示了灌注流体的氧和二氧化碳在随后的提取我们经验。
图3：灌注参数和双方的灌注液和胆汁生化分析时6小时的人12常温肝脏灌注机图形表示（A）的变化动脉和门的流动。充氧特性（B）演进和二氧化碳分压在6小时常温灌注。 （ 三）累计在灌注期间胆汁分泌。 （四）增加胆红素和碳酸氢盐的过程中灌注机取胆汁样品中的浓度。含有（E）微量离心管胆汁从代表性移植物，表明胆汁颜色逐渐变黑树荫随着时间的推移。数据表示为平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
胆汁产生作为肝功能的一个指标。代谢功能的肝脏的NMP中产生的胆汁，导致平均总胆汁产生24.6之后±6克6小时的NMP（ 图3C）的。在总胆红素和碳酸氢盐在胆汁的浓度的增加表示在NMP（ 图3D，E）的过程中产生的胆汁的质量的改进。肝组织ATP含量为mitocho的指标NMP中ndrial功能增加，导致30±5微摩尔/克蛋白质的平均ATP的6小时的NMP（ 图4）之后（平均值±SEM）。肝损伤标记物中的灌注流体，如ALT，ALKP，γ-GT和钾生化分析，来评估接枝损伤的量。稳定浓度的肝损伤标记物反射的移植物的过程中灌注（ 图5A）的最低限度的损伤。在灌注流体乳酸盐和葡萄糖水平以及耗氧先前已经17描述。此外，从肝组织和肝外胆管的远端采集， 如图5B H＆E染色的切片的组织学检查，C没有揭示在常温灌注机的任何其他伤害的移植物。
图4：变化的肝组织ATP含量NMP在 NMP 水平增加时肝组织ATP含量有所改善线粒体功能。数据表示为平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：（A）肝胆损伤，肝实质和（C）前（0小时）后（6小时）灌注机从代表采取移植肝外胆管（B）染色标记。 （A） 的过程中机器灌注稳定浓度的灌注流体损伤标记物表明移植物的最小的损伤。 （B）保存完好的AR的微观结构epresentative肝移植。肝外胆管（C）组织学（流明标有星号标记）的有代表性的移植物。由管腔上皮细胞层的部分损失表示中度胆管上皮损伤观察到基线，这在6小时的MP没有恶化。胆道损伤的程度相似已移植20日前在一系列人类肝脏的描述。胆管周围血管（箭头）和胆管周围腺体（虚线内的区域）显示没有恶化后常温灌注机损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。
灌注液的微生物检测NMP中没有发现任何细菌污染。在一种情况下培养阳性为S.表皮是由低温保存后立即收集到的样品中获得。 Howev呃6小时的NMP后的灌注液的培养为阴性的细菌，显示出在灌注流体中使用的抗生素的功效。
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Discussion
此视频提供了使用设备，使压力控制双灌注通过肝动脉和门静脉一步的人供体肝脏的常温灌注机步协议。虽然按照此协议，灌注机的技术故障并没有出现，所有移植物灌注良好和良好的氧化。 易地肝脏灌注了血流动力学稳定，并为代谢活跃，所生产的胆16,17定义。
这是一个公认的协议，用于人类供体肝脏的灌注机。该技术具有超过SCS 21的常规方法的几个潜在的优点。灌注机提供了机会，保持体肝移植在不同的温度取决于器官保存的预期终点。低温充氧灌注机提供更好的灌注和冲洗出来的microvasculture和他可能LP通过刺激三磷酸腺苷（ATP）的再生，恢复细胞内的能量含量。然而，移植物存活的全面评估，需要灌注在更多的生理温度（subnormothermic或常温）。随着气温的灌注，肝脏将成为代谢更活跃，并开始产生胆汁。最近的研究表明，胆汁生产为肝功能的指标可能是一种资产在易地 NMP评估移植前移植的可行性。这项研究表明，胆汁产生相关的肝组织ATP水平和肝损伤17的组织学和生化标志物。这些发现有待通过临床试验来确认。虽然胆汁分泌是肝实质可行性合适的潜在标志，胆管生存能力标记，可在异地 NMP进行评估仍然缺乏。因此，它是目前仍无法预测瓦特论是在NMP评估肝移植会后或不开发NAS。然而，使用该协议， 易地 NMP没有发现任何恶化胆管损伤的6小时期间的NMP。此外，这种技术具有的潜力，以允许移植前移植物的预处理，从而减少了移植后的损伤或复发基础疾病22。
对于供肝易地充氧灌注机的最佳流体是取决于所使用的温度。氧气在水中的溶解度是温度依赖性和氧气可以溶解在水样流体降低随温度增加23的量。当使用低的温度下进行MP，氧溶解在灌注流体的量可以是足够的。然而，在37℃下的氧载体应添加到灌注流体，以提供足够的氧气的移植物。对于低温MP，一个preserva化解决方案，如贝尔泽灌注机解决方案可以充分的11。对于subnormothermic或常温的MP，更复杂的灌注流体还包含营养物质和氧的载体已被用于在不同的研究15,16。在我们的研究上常温的MP，我们已经使用ABO-和恒河猴进行匹配堆积的红血细胞从本地血库作为氧气载体16。它仍有待确定是否类似的结果可以与人工血红蛋白基氧载体如Hemopure或Hemarina得到。
最关键的技术问题为人类肝脏的成功灌注有：以正确固定的插管在门静脉和supratruncal主动脉段，结扎所有小侧设有分公司以避免灌注流体的任何泄漏可能扰乱的压力和流量的规定机，以保持生理环境对肝脏特别通过调节pH一次的灌注流体的电解质浓度，和维持灌注环境的无菌性。
由于技术限制，在所描述的协议中使用的灌注设备不能降到低于10℃的灌注流体的温度。虽然这可以被认为是一种限制，它不提供有关局部缺血的一个现实问题。其理由是，超过足够量的氧气可以与温度无关地供给到灌注流体由两个薄膜充氧器。一个优点是，温度可以在灌注期间，允许供体肝脏的逐渐复温容易地进行调整。最近的一项研究中的猪肝脏表现出逐渐复温重要的优点之前使用相同的装置，在这里18所述常温灌注。
灌注供肝在不同温度下的能力，并增加额外的阿根的机会TS至器官灌注过程中的灌注流体提供评估和改善移植前器官质量的潜力。因此，这种方法可以显着增加用于移植的可用器官的数目。
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Disclosures
这个手稿的作者有没有利益冲突披露。
Acknowledgments
该研究工作得到由Innovatief Actieprogramma格罗宁根（IAG-3），扬德Kornelis屌斯蒂廷和提基亚Huizingafonds规定，所有在荷兰的资助。我们感谢所有荷兰移植协调员识别潜在的肝脏丢弃并取得知情同意。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Assist | Organ Assist | OA.Li.Li.140 | Perfusion device |
| Liver Assist disposable package | Organ Assist | OA.Li.DP.540 | Disposable set and cannulas |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Bile duct cannula |
| Human albumin 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Modified parenteral nutrition | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7.35 ml |
| Multivitamins for infusion / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μl |
| Concentrated trace elements for infusion / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7.35 ml |
| Metronidazole 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| Cefazoline / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| Fast acting insulin | various vendors | 20 ml | |
| Calcium glubionate, intravenous solution 10%, 137.5 mg/ml | Sandoz | 97038695 | 40 ml |
| Sterile H2O | Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51.3 ml |
| NaCl 0.9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| Heparin 5,000 IE/ml for i.v. administration | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| Sodium bicarbonate 8.4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | The amount depends on the pH |
| Packed red blood cell (in SAGM) | Blood bank (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| Fresh frozen plasma | Blood bank (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
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