Summary
このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を持つラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法を示します。
Abstract
このようなポリオ、ライム神経ボレリア、または神経梅毒などの実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE、1）、または中枢神経系の感染に対する免疫応答などの中枢神経系（CNS）、、に向けられた自己免疫疾患を研究するかどうか、それはしばしばです。 CNS浸潤免疫細胞を単離することが必要。
このビデオプロトコルでは、EAEとラットの中枢神経系から単核細胞を（国籍）を分離する方法を示しています。この手順の最初のステップは、血液がCNSを灌漑血管に残っていないことを確認するために生理食塩水と齧歯類の心臓の灌流を必要とします。あらゆる血液汚染は人為的に明らかにCNS浸潤多国籍企業の数が増え、浸透させる免疫の見かけ上の構成を変更することがあります。我々は、シングルセル懸濁液を調製するために、後続の引き裂くことのためにラットの脳と脊髄を除去する方法を示します。この懸濁液を多国籍企業を分離する二層Percoll勾配で分離されています。洗浄後、これらの細胞はその後、必要な手続きを受けるために準備が整いました。
この手順を使用して単離された単核細胞は生存可能であり、電気生理学、フローサイトメトリー（FACS）、または生化学のために使用することができます。技術は無菌条件下で行われている場合（組織培養フードの滅菌器を使用して）細胞も組織培養培地で成長させることができる。特定の細胞集団は、さらに磁気分離の手続またはFACSのいずれかを使用して精製することができる。
Protocol
- 深くラットを麻酔。 70％エタノールでスプレーし、血管から細胞を（左心室を介して右心房と浸み込ませるをカット）を除去するために10分間PBSで心臓灌流を行う。
- 氷冷したPBSを含む50 mlのチューブに脳と脊髄と場所を削除します。氷冷PBSの10mlを含む10cmペトリ皿に配置された70mmのセルストレーナーに脳と脊髄を切る。滅菌1 mlのシリンジプランジャの背面を使用してセルストレイナーを通して器官の各部分を押してください。氷上で50 mlチューブに、単一の細胞懸濁液を収集する。 PBSで細胞ストレーナーを洗浄し、溶液が透明になるまでチューブに加える。
- 390 gで80〜10分間遠心する
- PBS + 70％パーコール10 mlの上に20ミリリットルのPBS + 30％パーコールとオーバーレイで細胞を再懸濁します。
- 室温で20分間390グラム間遠心。
- チューブの上に脂肪を取り除く。インタフェースから細胞を回収し、PBSで2回洗浄する。カウント。
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Discussion
この手順は、生きた動物を含むすべての手順として、所属機関の動物の利用とケアの委員会によって承認されなければならない。我々は、前と手順の間に動物に与えられる麻酔の十分なレベルを確保する最初心臓perfusionsを実行する際に獣医師や動物看護士が存在すること、そして動物が不必要な痛みや苦痛を経験しないことをお勧めします。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
