Summary
I denna video visar vi hur du kan isolera mononukleära celler från centrala nervsystemet hos råttor med experimentell autoimmun encefalomyelit.
Abstract
Oavsett studera en autoimmun sjukdom riktat till det centrala nervsystemet (CNS), såsom experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE, 1) eller immunsvaret mot en infektion i CNS, till exempel polio, Lyme neuroborreliosis eller neurosyfilis är det ofta nödvändigt att isolera den CNS-infiltrera immunceller.
I denna video-protokoll visar vi hur du isolera mononukleära celler (MNC) från CNS av en råtta med EAE. Det första steget i detta förfarande kräver en kardiell perfusion av gnagare med en koksaltlösning för att säkerställa att inget blod kvar i blodkärlen bevattning CNS. Varje blodsmitta kommer att artificiellt öka antalet synliga CNS-infiltrera multinationella företag och kan ändra den uppenbara sammansättningen av immunförsvaret infiltrera. Vi visar sedan hur man tar bort hjärnan och ryggmärgen av råtta för efterföljande dilaceration att förbereda en encelliga suspension. Denna suspension är separerade på ett två-lager Percoll lutning för att isolera multinationella företag. Efter tvätt, dessa celler är sedan redo att genomgå någon form krävs förfarande.
Mononukleära celler isoleras med hjälp av detta förfarande är livskraftig och kan användas för elektrofysiologi, flödescytometri (FACS), eller biokemi. Om tekniken utförs under sterila förhållanden (med hjälp av sterila instrument i en vävnad kultur huva) kan cellerna också odlas i vävnadskultur medium. En given cell population kan renas ytterligare med hjälp av antingen magnetisk separering förfaranden eller en FACS.
Protocol
- Djupt bedöva råttor. Spray med 70% etanol och göra en hjärt perfusion med PBS i 10 min för att avlägsna celler från blodkärl (klipp höger förmak och BEGJUTA via vänster kammare).
- Ta bort hjärnan och ryggmärgen och lägg i en 50 ml rör med iskall PBS. Skär hjärnan och ryggmärgen i en 70 mm cell sil placeras i en 10 cm petriskål som innehåller 10 ml iskall PBS. Tryck på varje bit av organ genom cellen silen med baksidan av en steril 1 ml sprutkolven. Samla enda cellsuspension i ett 50 ml provrör på is. Tvätta cell-sil med PBS och lägga till röret tills lösningen är klar.
- Centrifugera i 80-10 min på 390 g.
- Resuspendera cellerna i 20 ml PBS + 30% Percoll och overlay på 10 ml PBS + 70% Percoll.
- Centrifugera vid 390 g under 20 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort fettet på toppen av röret. Samla celler från gränssnittet och tvätta två gånger med PBS. Räkna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta förfarande, som alla försök med levande djur, måste godkännas av din institutions djur användning och vård kommitté. Vi rekommenderar att en veterinär eller en veterinär tekniker vara närvarande när du utför den första hjärt perfusion för att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesi ges till djur innan och under förfarandet, och att djuren inte genomgår onödig smärta eller lidande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Cell strainer, 70 um | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Reagent | Sigma-Aldrich | P1644 |
References
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
