Summary
Klassische forelimb Asymmetrie Analyse des Zylindertest wird routinemäßig verwendet, um Verhaltensdefizite in Ratten nach Hirnverletzung oder Schlaganfall zu bewerten; jedoch fehlt es an konsistenten Defizite in Mäusen zu erkennen. Diese Studie zeigt, dass die Quantifizierung paw-Ziehen Verhalten ist ein empfindlicher Analyse der Hirnverletzung bei Mäusen.
Abstract
Der Zylinder-Test wird routinemäßig zur fokalen ischämischen Schäden an der Vordergliedmaße motorischen Kortex bei Nagern vorherzusagen. Wenn in dem Zylinder angeordnet, Nager erkunden von Aufzucht und berühren die Wände des Zylinders mit ihren Vorderbein Pfoten für Haltungsunterstützung. Nach ischämische Schädigung der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex, verlassen Ratten stärker auf ihre unberührt forelimb Pfote für Haltungsunterstützung was zu weniger Berührungen mit ihren betroffenen Pfote, die Vordergliedmaße Asymmetrie bezeichnet wird. Demgegenüber fokalen ischämischen Schädigung des Gehirns der Maus irgendwie in vergleichbaren konsistent Defizite forelimb Asymmetrie führen. Während forelimb Asymmetrie Defizite sind selten beobachtet, weiß Mäuse zeigen ein neuartiges Verhalten nach Schlaganfall als "Tatze-Ziehen". Paw-Ziehen ist die Tendenz für eine Maus, seine betroffenen Pfote entlang der Zylinderwand und nicht direkt zu drücken von der Wand bei der Demontage von einem hinteren zu einem vierbeinigen Haltung ziehen. Wir haben zuvor gezeigt, dasspaw-Ziehen Verhalten ist sehr empfindlich auf kleine kortikale ischämische Verletzungen an der Vordergliedmaße motorischen Kortex. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für paw-Ziehen-Analyse. Wir definieren, was eine Pfote ziehen ist und zeigen, wie man paw-Ziehen Verhalten quantifizieren. Der Zylinder-Test ist ein einfaches und kostengünstiges Test zu verwalten und nicht vor dem Training oder Nahrungsentzug Strategien erfordern. Bei der Verwendung von paw-Ziehen-Analyse mit dem Zylinder-Test, füllt es eine Nische für die Vorhersage von kortikalen ischämische Verletzungen wie photothrombosis und Endothelin-1 (ET-1) induzierte Ischämie - zwei Modelle, die immer größer werden immer beliebter und produzieren kleinere Brenn Verletzungen als mittleren Hirnarterie Okklusion. Schließlich messen paw-Ziehen Verhalten im Zylindertest Studien der funktionellen Erholung nach kortikalen Verletzung mit einer breiten Gruppe von transgenen Mausstämmen, wo frühere forelimb Asymmetrie-Analyse hat es versäumt, im Einklang Defizite erkennen lassen.
Introduction
Das Ziel der neuronalen Regenerationsstrategien ist es, sowohl die Reparatur von Gewebe und funktionelle Wiederherstellung zu demonstrieren. Funktionelle Wiederherstellung wird typischerweise mit Verhaltenstests, die funktionelle Defizite zu messen, in diesem Fall, der motorischen Fähigkeiten, die mit einer Schädigung des spezifischen Hirnregionen zugeordnet sind, ausgewertet. Traumatischer Hirnverletzung oder ischämische Schädigung sensomotorischen forelimb Bereich des Cortex kann durch eine Reihe von Verhaltenstests demonstriert werden. Ein solcher Test ist der Zylinder-Test ausgiebig an Ratten verwendet, um funktionelle Defizite in forelimb Aktivität 1 zu bewerten. Der Test hat eine geringe Einrichtungskosten nur einen Zylinder, Kamera und Tisch mit einer transparenten Deck erfordern. Es ist einfach zu verwalten, wie sie auf der natürlichen Erkundungsverhalten von Nagern basiert, so dass vor dem Training und Nahrungsentzug oder Belohnungen sind nicht erforderlich. Trotz dieser zahlreichen Vorteile wird der Zylindertest nicht ausreichend genutzt, um forelimb Defizite bei Mäusen beurteilt folgenden Schwer Verletzungen des forelimb sensorimotor Kortex, was wir auf die Analyse von Mausverhalten im Zylindertest. Vorderbein Asymmetrie ist das klassische Maß der Analyse für den Zylinder-Test. Wenn in dem Zylinder angeordnet, Nagetiere natürlich erkunden Sie die Wände des Zylinders durch die Aufzucht auf ihre Hinterbeine und die Berührung der Zylinderwände mit ihren Vorderbein Pfoten für Haltungsgleichgewicht. Die Anzahl der Pfote berührt mit der Wand mit jedem Vorderbein ist leicht durch die Dreharbeiten Nagetiere während dieser Explorations des Zylinders quantifiziert. Vorderbein Asymmetrie tritt auf, wenn der betroffene forelimb paw macht weniger Berührungen mit der Wand als die unberührt forelimb Pfote und ist ein Hinweis auf eine Beschädigung des kontralateralen sensomotorischen Kortex. Bei Ratten, intra-kortikalen Injektionen des vasokonstriktorischen Mittel, Endothelin (ET-1), in das Vorderbein sensomotorischen Kortex verursacht einen fokalen ischämischen Läsion, die in Verhaltensdefizite in der kontralateralen Vorderbein führt. Defizite in der kontralateralen Vorderbein Verwendung leicht Veränderungen in f erkanntorelimb Asymmetrie in der Zylindertest bei Ratten 1-3. Im Gegensatz zu Ratten sind jedoch Änderungen in forelimb Asymmetrie variabel und weniger konsequent in Mäusen nach vergleichbaren ET-1-Injektionen 4-6. Hier zeigen wir eine neue Analyse der Vordergliedmaße Verhalten im Zylindertest - Analyse der Tatze-Ziehen Verhalten. Wir haben zuvor gezeigt, dass Pfoten verschieben Analyse ist ein empfindlicheres Maß der Beschädigung der Vordergliedmaßen sensomotorischen Cortex von Mäusen als die klassische forelimb Asymmetrie Analyse und ist daher für eine Vielzahl von fokalen kortikalen Verletzung Modellen.
Zu prüfen, wie die Vorderpfote Kontakte der Zylinderwand nach ischämischer Schäden an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex ergab eine neuartige Verhalten bei Mäusen - paw-Ziehen 4. Eine Pfote ziehen tritt auf, wenn eine Maus steht auf seinen Hinterbeinen, die Zylinderwand zu erkunden dann schleppt seine betroffenen (Kontra läsionaler) paw entlang der Zylinderwand in Richtung seiner Mittellinie oder auf der Wand, währendseine Vorderpfote unberührt bietet Haltungsunterstützung gegen die Wand. Paw-schleppt selten in unverletzten Mäusen treten daher das Auftreten einer Pfote ziehen ist ein positiver Indikator der Schädigung des forelimb sensomotorischen Kortex 4. Wir haben vorher quantifiziert paw-Ziehen Verhalten bei Mäusen nach ET-1 ischämische Schädigung des forelimb sensomotorischen Kortex und haben nachhaltig paw-Ziehen Verhalten bei Mäusen bis zu zwei Wochen nach Schlaganfall. 4 gezeigt Hier zeigen wir, dass paw-Ziehen Verhalten wird bis zu vier Wochen nach Schlaganfall erlitten. Analyse von paw-Ziehen Verhalten stellt eine neuartige und empfindliche Instrument zur Bewertung fokalen ischämischen Schäden am Vorderbein sensomotorischen Kortex bei Mäusen. Seine preiswerten Aufbau, einfache Verwaltung und Scoring machen dies zu einem einfachen, aber nützliches Werkzeug, um schnell beurteilen forelimb Verhaltensdefizite in Mäusen.
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Protocol
Ethics Statement: Alle Experimente wurden von Memorial University of Animal Care Ethikkommission Neufundlands nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care genehmigt.
1. Mäuse
- Verwenden erwachsenen Mäusen. In dieser Untersuchung wurden erwachsene männliche FVBN Mäusen (n = 10), die zwischen 2-4 Monaten verwendet. Hausmäuse auf einem 12:12 h Rückwärts Hell-Dunkel-Zyklus und bieten Standard-Nagetierfutter und Wasser ad libitum.
2. Materialien für die Zylindertest erforderlich
- Besorgen Sie sich eine Tabelle mit einer transparenten top, um den Zylinder Testfilm. Die Abmessungen der Tabelle sind irrelevant, die Besten müssen Plexiglas oder Glas sein, und es muss genug Platz, um einen Spiegel unterhalb der Tabelle zu positionieren. Dies ermöglicht die Maus, um von unten gefilmt werden. Verwenden Sie einen Spiegel unterhalb der Tabelle, um das Bild durch den Zylinder zu reflektieren. Alternativ verwenden Sie eine Upside-Down-Kamera, sofern verfügbar. Die Abmessungen der Tabelle in diesem Protokoll verwendet werden 54 x 56 x 66,5 cm (BxTxH) mit einer 51 x 51 cm nach oben (B x L).
- Besorgen Sie sich einen Spiegel. Die Abmessungen des Spiegels in diesem Protokoll verwendet werden, sind 34 x 58 cm (B x L).
- Besorgen Sie sich eine transparente / Plexiglaszylinder für die Maus, um in durchzuführen. Die Abmessungen des Zylinders in diesem Protokoll verwendet werden, sind 17,5 cm hoch, 8,8 cm ID, 9,5 cm OD mit einer Wandstärke von 0.35cm. A größer Zylinder kann für mehr aktive Mausstämmen erforderlich.
- Setzen Sie den Zylinder auf der Tischplatte und filmen die Reflexion im Spiegel unten.
- Eine Videokamera und Stativ sind erforderlich. Nehmen Sie Videos auf etwa 650KB / s, was etwa 190 MB pro 5 min von Zylinder Video. Sicherzustellen, dass die Kamera eine Zoom-Funktion, um sicherzustellen, dass der Zylinder umfasst das gesamte Gesichtsfeld.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Videokamera ist eine Sony DCR-SR42, 40x optischer Zoom, 2,000x Digitalzoom, 680kpix die Standard-Definition, NTSC Interlaced-Video verwendet). - Software zur Analyse zu erhalten - eine Medien player mit Video-Unterstützung und die Wiedergabegeschwindigkeit-Modulation. Der Media-Player in diesem Protokoll verwendet ist der VLC Media Player v2.1.2.
- Besorgen Sie sich einen Computer mit einem Betriebssystem lauffähig den Media Player und einen Monitor.
- Elektronischen Speicher für Videos benötigt. Laden Sie Videos auf eine externe Festplatte oder kopieren Sie sie auf DVDs für langfristige Lagerung.
HINWEIS: Bei 190 MB pro Video, werden 84 Sitzungen auf einem 16 GB SD-Karte passen und 168 Sitzungen werden auf einer 32 GB SD-Karte passen. Aufgrund der relativen Billigkeit von SD-Medien, und der Unsicherheit in wie viel Zeit benötigen, um einige Mäuse 20 Hinterreifen zu vervollständigen, wird eine 32-GB-Karte empfohlen. In der aktuellen Studie wurden die Videos von der Kamera auf einen 2 TB externe Festplatte kopiert und dann auf DVDs als Backup erneut kopiert.
3. Experimenteller Aufbau der Zylinder-Test
- Befestigen Spiegel unterhalb des Tisches in einem 45 Grad-Winkel zu der Tischplatte. Tun Sie dies mit Hilfe von zwei Halterungen an den Tischbeinen befestigt, um support die Oberseite und Unterseite des Spiegels sind. Halterung Standorte sind in einer Seitenansicht des Tisches (1A) und ein Gesichts auf Ansicht des Tisches (1B) angegeben ist.
- Platzieren Zylinder auf der Mitte des Tisches. Zeichnen vier äquidistante Linien, wo der Zylinder sitzt auf dem Tisch mit einem schwarzen Filzstift (Sharpie), so dass der Zylinder angehoben und wieder in derselben Position (Abbildung 2). Ziehen derselben auf der Unterseite der transparenten Platte ermöglicht die Tischplatte zwischen Tierversuchen ohne Auflösen der Markertinte zu reinigen.
- Befestigen Sie die Kamera und Stativ. Die Kamera auf den Spiegel, so daß das Bild direkt durch das Gehäuse des Zylinders suchen. Sicherzustellen, dass der ganze innere Wand des Zylinders sichtbar ist und unbehindert durch den Boden (Figur 3). Sehen eine Seitenansicht auf der Setup, einschließlich der relativen Winkel der Kamera und Spiegelaufbau von oben (Figur 4A) und dasPegel der Tabelle, einschließlich einer Maus Aufzucht (4B).
- Bereiten Cue Cards, jede Maus vor den Dreharbeiten zu identifizieren. Stellen Sie sicher, dass die Karten enthalten in der Regel eine Identifikationsnummer für jede Maus, die Zeitpunkt des Tests (z. B. 3 Tage nach der Behandlung) und das Datum der Dreharbeiten Sitzung. Sie die Behandlung Gruppe auf der Cue-Karte nicht enthalten, um sicherzustellen, der Experimentator wird geblendet.
- Film in Standard-Innenbeleuchtung Bedingungen, wie dieser Ebene von Licht benötigt, um die Mausbewegungen um den Zylinder klar zu sehen.
HINWEIS: Wenn die Dreharbeiten zur Verfügung in der Dunkelheit mit einer Rotlichtkamera genügen jedoch einer ersten müssten, um zu testen, ob Pfote berührt und zieht deutlich zur Quantifizierung sichtbar.
4. Ausführung
- Dreharbeiten beginnen. Zeigen Sie den entsprechenden Maus Cue Karte vor Kameralinse.
- Senken Sie die Maus in den Zylinder von der offenen Oberseite unmittelbar nach Dreharbeiten für den Cue-Karte.
- Beginnen die Dreharbeiten mit der Maus. Minimieren Sie Rauschen während dieser Zeit, wie Mäuse können Interesse an der Erforschung, wenn aufgeschreckt zu verlieren.
- Beachten Sie die Mäuse hinten, um den Zylinder zu erkunden. Nehmen Sie das Video, bis die Maus führt eine mindestens zwanzig bäumt.
HINWEIS: Eine Rück tritt auf, wenn beide Vorderpfoten zu verlieren Kontakt mit dem Boden und die Maus steht auf den Hinterbeinen. - Wischen Tischplatte und Zylinder mit einem geeigneten Reinigungslösung zwischen jeder Maus zu desinfizieren und zu entfernen Maus Düften.
- Das Einfrieren ist, wenn Mäuse stoppen Erforschung und bleiben ruhig auf allen Vieren sitzen für ca. 5 min. Wenn Mäuse einfrieren vor zwanzig rears auftreten, kann es erforderlich sein, um sie aus dem Zylinder zu entfernen für 10-20 min vor der Wiederaufnahme des Tests. Wenn Mäuse nicht zwanzig Rückseiten durchzuführen, die sie von der Studie entfernt.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung Mäusen noch nie benötigt, um auszuschließen, wegen des Ausfalls, den Zylinder zu erkunden.
5. Bewertung des Zylinder-Test unter Verwendung von Paw schleppAnalyse
- Spielen Sie den Video mit einer Rate von zwischen 0,25x und 0.67x normaler Geschwindigkeit je nachdem, wie schnell die Maus untersucht die Zylinder. Verwenden Sie einen Media-Player, die langsamer Wiedergabegeschwindigkeiten bietet.
- Quantifizierung der Gesamtzahl der Pfote berührt. Pfote Berührungen auftreten, wenn die Rückseiten der Maus (5A), berührt die Seite des Zylinders (5B), danach steigt ab mit beiden Pfoten gleichzeitig (5C) und Stegen (Figur 5D). Die Pfote kann oder kann nicht mit einem vollen Handfläche an die Zylinderwand, aber einige Kontakt mit der Zylinderwand auftreten müssen. Beurteilen Pfote berührt durch Zählen der Anzahl von Malen, die Maus berührt (egal wie kurze) mit der Zylinderwand mit einer oder beiden Vorderpfoten, während man auf seine Hinterbeine bei einem Heck.
Beachten Sie, dass der Kontakt mit der Zylinderwand wird nur als "paw touch" oder "Pfote ziehen", wenn sich der Mauszeiger in eine hintere Position gezählt - stehendauf seine Hinterbeine mit beiden Vorderpfoten aus der Tischplatte. Wenn die Maus bleibt in einem 3-Punkt-Haltung - beide Hinterbeine und eine Vorderpfote auf der Tischplatte und geht, um die Wand mit dem kostenlosen Pfote berühren - ist dies nicht als eine Pfote berühren gezählt. Mäuse können hinten und berühren Sie die Zylinderwand mit einem einzigen Vorderpfote und dies wird als einer Pfote berühren gezählt. Hinweis: eine Maus kann auch seinen Körper um den Zylinder zu bewegen während einer hinten, so dass mehr als zwei Kontakte. Diese Kontakte werden gezählt - eine für jede linke Vorderpfote Note und eine für jede rechte Vorderpfote touch. - Quantifizierung der Anzahl von paw-Drags. Paw-Ziehen Verhalten unterscheidet sich von normalen Pfote berührt.
- Wenn der Pfote berührt die Zylinderwand mit einem vollen Handfläche (6B), wird es langsam zu fallen von der Wand weg, oft mit einem leichten Zittern. Die Bewegung beginnt mit den Ziffern Ziehen gegen die Zylinderwand entweder in einer medialen oder Abwärtsrichtung (6C), bevor der Abfall completEly (6D). Die Maus wird dann demontieren mit seiner Pfote unberührt (6E) vor der Landung auf allen Vieren (6F). Dies wird als eine Pfote ziehen und sollte in einer Strichliste angerechnet werden.
- Wenn die Pfote nicht mit einer vollständig offenen Handfläche an die Zylinderwand, wird die Zylinderwand mit seinen Ziffern vor dem Fallen weg von der Zylinderwand grasen. In ähnlicher Weise kann eine Maus ihre Pfote gegen die Zylinderwand ziehen, aber nicht loslassen vollständig vor der Demontage. Diese werden sowohl als Pfoten schleppt sowie Berührungen und sollte als beide in einer Strichliste angerechnet werden.
- Die Pfote können auch entlang der Zylinderwand ziehen, während eine Maus untersucht die Zylinder. In diesem Fall wird die Pfote die Verdrehung der Maus Torso folgen, wie es links oder rechts von seiner ursprünglichen Position (7A-D) untersucht vor der Demontage (7E). Dies wird nicht als eine Pfote ziehen, da sie abhängig von der Maus nach dem Zufallsprinzip wähleneine Richtung zu erkunden und nicht davon abhängen, welche kortikalen Hemisphäre beschädigt.
- Paw-schleppt werden als Prozentsatz von ausgedrückt paw-schleppt per Gesamtzahl der Pfote berührt während einer Sitzung. Express die Anzahl der Tatze-Drags als Prozentsatz der gesamten Pfote Kontakte für jedes Vorderbein getrennt.
- Touches was zu einer Pfote ziehen als Pfote ziehen und einen Hauch gleichzeitig zu zählen. Wenn also eine Maus schleppt seine Tatze jedesmal die Pfote berührt die Zylinderwand, die Pfote-Ziehen Prozentsatz wird als 100% ausgedrückt.
6. Zusätzliche Experimentelles Design Suggestions
- Um Störvariablen zu minimieren:
- Testen Sie die Maus zur gleichen Zeit an jedem Testtag. Testen Sie die Mäuse während der Wach-Zyklus. Keeping Mäuse auf einer 12 Stunden umgekehrter Lichtzyklus erleichtert Leistung.
- Mäuse nur ungern, um den Zylinder, wenn entweder durch Rauschen oder einer neuen Umgebung gestresst zu erkunden. Testen Mäuse in ihren Tierhaltezimmer oder ein Zimmer sie b habeneen vertraut mit reduziert Stress. Dies kann auftreten, wenn der Raum ist laut, wenn die Maus vor dem Eintritt in den Zylinder oder durch Gewöhnung angerempelt worden.
Hinweis: Der Test sollte einmal experimentelle Manipulation durchgeführt werden, um als Grundlage dienen Lesung. Nach der Manipulation, sind Testtage im Ermessen des Experimentators, obwohl es ratsam, eine übermäßige Anzahl von Forderungen an den Zylinder über einen kurzen Zeitraum zu vermeiden. - Mäuse können sich nur ungern hinten nach 6-7 Forderungen an den Zylinder. Für die vorliegende Studie wurden die Mäuse in den Zylinder für insgesamt sieben Mal, vor der Ischämie und an den Tagen 1, 3, 7, 14, 21 und 28 nach der Operation getestet.
HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir die FVBN Mausstamm. Wir haben zuvor getestet C57BL / 6-Mäuse im Zylinder und beobachteten Pfoten verschieben Verhalten nach einer ET-1-ischämische Verletzung (Daten nicht gezeigt). C57BL / 6-Mäuse waren aktiver als FVBN Mäusen der Aufzucht und häufig sprang auf dem Rand des Zylindervor dem Aufstieg aus. Taller Zylinder sollte verwendet werden, wenn Mäuse versuchen, durch einen Sprung zu entgehen.
7. Endothelin-1 Chirurgie und Infarktvolumen Maße
- Führen Endothelin-1-Chirurgie und Infarktvolumen Messungen nach früher veröffentlichten Protokolle 4. Um den vorderen forelimb motorischen Kortex Ziel sollte jeder Maus drei ET-1-Injektionen an den folgenden Koordinaten zu erhalten: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medial-lateralen (ml) / - 1,2 dorsal-ventral (DV), ( ii) +0.4 AP / 1,25 ml / - 1,2 DV und (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV 4.
8. Statistische Analyse
- Ein Zwei-Wege wiederholten Messungen Varianzanalyse (ANOVA) wird empfohlen, die Prozent der Tatze-Ziehen für die betroffenen und nicht betroffenen Pfoten über verschiedene Zeitpunkte zu analysieren.
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Representative Results
Wir haben bereits gezeigt, dass paw-Ziehen Verhalten erscheint nach einer fokalen ischämischen Schädigung der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex und ist ein positiver Indikator für Schäden 4. Intra-kortikalen Injektionen von ET-1 in den forelimb sensomotorischen Cortex wurden verwendet, um einen ischämischen Läsion (8A, B) zu induzieren. Diese Studie untersucht, ob paw-Ziehen Verhalten erweitert für mehr als 14 Tage nach der Verletzung für seine mögliche Verwendung zur funktionellen Erholung zu bewerten. Mäuse wurden im Zylindertest am Tag vor ET-1-Injektionen zur voroperativen Zeitpunkt und an den Tagen 1, 3, 7, 14, 21 und 28 nach der Verletzung untersucht. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Anzahl der Pfote Pfote berührt und schleppt sowohl für die betroffenen und nicht betroffenen Pfote quantifiziert. Zwei ANOVA mit wiederholten Messungen von der Anzahl der Pfote berührt ergab signifikante Haupteffekte der Zeit [F (6108) = 3,59, p = 0,0028] und Themen [F (18108) = 2.38, P = 0,0032], aber keine Wirkung der Behandlung(Tabelle 1). Der Erwägung, dass mit Hilfe der Standardanalyse forelimb Asymmetrie für den Zylinder-Test, der betroffenen Pfote berührt gegen insgesamt Pfote berührt quantifiziert ergab inkonsistente forelimb Verhaltensdefizite. Ein One-Way ANOVA mit wiederholten Messungen auf der Prozent der betroffenen Pfote Verwendung ergab einen signifikanten Haupteffekt der Zeit (p = 0,015), die von Dunnett Post-hoc-Test, gefolgt zeigten eine signifikante Reduktion der Prozent betroffenen Pfote Einsatz bei 7, 14 und 21 Tage nach -Chirurgie und um 28 Tage nach der Operation (8C) gewonnen. Im Gegensatz dazu ist ein Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen von der Anzahl der Pfote schleppt ergab signifikante Haupteffekte der Zeit [F (6108) = 7,09, p <0,0001], Behandlung [F (1,108) = 33.02, p <0,0001], Interaktion [ F (6108) = 9,89, p <0,0001] und Themen [F (18108) = 4,84, p <0,0001]. Weitere Bonferroni post hoc-Analyse zeigte deutliche Steigerungen in der Anzahl der Pfote schleppt zu jedem Zeitpunkt nach der Operation (Tabelle 1). Ähnlich ist ein Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen Vergleich der Anzahl der betroffenen Pfote-schleppt gegen insgesamt betroffenen Pfote berührt ergab signifikante Haupteffekte der Zeit [F (6108) = 6,63, p <0,0001], Behandlung [F (1,108) = 20.46, p = 0,0003], Interaktion [F (6108) = 8,21, p <0,0001] und Themen (Matching) [F (18108) = 7.35, p <0,0001]. Weitere Bonferroni post hoc-Analyse zeigte signifikante paw-Ziehen Verhalten bis zu 28 Tage nach der Operation (8D). Die Pfoten Ziehen Verhalten war spezifisch für die betroffene Extremität, da keine Erhöhung oder Änderung der Tatze-Ziehen mit der nicht betroffenen Extremität beobachtet. Pfoten verschieben Verhalten mit dem betroffenen Vorderpfote wurde bei 1, 3, 7, 21 und 28 Tagen nach der Operation (8D) signifikant erhöht. Paw-Ziehen Verhalten nach 1 Tag nach der Operation mit> 30% aller Pfote berührt mit dem betroffenen forelimb was zu einer Pfote ziehen ihren Höhepunkt fiel dann auf ~ 15% nach 3 Tagen nach der Operation, wo es blieb bis einschließlich 28 Tage nach der Operation. Bei 28 Tage nach der Operation wurden die Mäuse eingeschläfert und der Infarktvolumen bestimmt. Die mittlere Infarktvolumen für die Gruppe betrug 3,2 ± 0,4 & mgr; m 3 (n = 10 Mäuse). Diese Ergebnisse zeigen, dass kleine kortikalen Infarkten kann in signifikante und anhaltende Verhaltensdefiziten, wie in den Zylinder-Test gemessen führen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass nicht nur paw-Ziehen stark reagieren, um zu der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex beschädigt, aber das Pfoten Ziehen auch bestehen bleibt über die Zeit und kann verwendet werden, um die funktionelle Erholung zu bewerten.
Abbildung 1. Bracket Standorte Spiegel an Ort und Stelle unter dem Tisch zu befestigen. (A) Frontansicht der Tabelle, welche Halterung Stellen auf die Vorderbeine des Tisches. (A ') Stärkere Vergrößerung der Einschub in A zeigt Lage der Klammern auf die Vorderbeine. (B) Rückansicht der Tabelle zeigen,ing hintere Bein Klammer Standorten. (B ') Stärkere Vergrößerung der Einsatz in B anzeigt Halterung Lage am hinteren Beine von Tisch.
Abbildung 2. Markieren Sie den Speicherort für Zylinder Platzierung auf dem Tisch. Foto der Tischplatte anzeigt Platzierung der Zylinder mit um den Umfang der Basis gezogen schwarzen Linien. Pfeile zeigen auf die an der Unterseite der zum Zentrieren des Zylinders auf der Tischplatte eingesetzt Plexiglas schwarzen Linien gezeichnet.
Abbildung 3. Vorderansicht der Kamera und Tabletop Set-up. Foto von der Tischplatte zeigt, die Sichtlinie direkt über der Zylindertrommel (roter Pfeil).
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Abbildung 4 ist eine Seitenansicht der Kamera und Tisch-Set-up. Die Kamera wird direkt an der Basis des Zylinders ausgerichtet. Von oben (A) Tabelle und Kamera-Setup übernommen. Auf der Ebene der Tabelle (B) Tabelle und Kamera-Setup gemacht und zeigt eine Maus Aufzucht im Zylinder.
Abbildung 5. Eine Folge von Fotos zeigt, dass ein unverletzten Mauszucht. (A) Foto einer Maus vor einer hinteren. (B) Die Maus berührt die Zylinderwand mit beiden Pfoten. (C) Zur Demontage wird die Maus an die Zylinderwand mit beiden Pfoten, und (D) Land an allen vier Pfoten zu schieben. Lt = Maus linke Pfote, Rt = rechte Mauspfote.
Abbildung 6. Eine Folge von Fotos zeigen eine verletzte Pfote Maus-Ziehen. (A) Foto einer Maus vor einer hinteren. (B) Die Maus wird die Zylinderwand mit beiden Pfoten berühren; (C) dann langsam die Ziffern auf der betroffenen Pfote ziehen Sie vertikal in der Zylinderwand lassen; (D) zu lassen, bevor die Pfote von der Wand fallen. (E) Die Maus wird dann demontieren mit ihren unberührt Pfote und (F) Land an allen vier Pfoten. Hohe Vergrößerung Einsätze in B, C und D zeigen, wie die betroffenen Vorderpfote in Kontakt mit der Zylinderwand. Lt = Maus linke Pfote.
Abbildung 7. A 'nicht paw-drag'. (A) Die Maus berührt die Zylinderwand mit beiden Pfoten. (B) Die Maus dreht seinen Oberkörper seitlich an die Zylinderwand zu erkunden. (C) Die Maus re-Positionen seine führende Vorderpfote an eine neue Position seitlich und zieht seiner Hinterpfote in die gleiche Richtung. (D) Die Hinterpfote ist fest an seinem neuen Standort gepflanzt, und beide Pfoten werden verwendet, um abzusteigen (E), um auf alle vier Pfoten zurück. Red Pfeilspitzen zeigen Lage der Pfoten bei Start- und Endposition. Rote Pfeil zeigt die Bewegung der hinteren Vorderpfote an der Zylinderwand.
Abbildung 8 Paw-Ziehen Verhalten wird für 4 Wochen nach einer fokalen kortikalen, ischämische Läsion erlitten. (A) Repräsentative ph otomicrograph eines Kresylviolett gebeiztes koronalen Hirnschnitt durch eine ET-1 ischämischen Läsion 28 Tage nach der Operation. (B) Höhere Vergrößerung des ET-1 Läsion des eingerahmten Bereich in A. (C) Analyse der Vordergliedmaße Asymmetrie in der Zylinderprüfung im Anschluss an eine ET-1 ischämische Schädigung der Vordergliedmaße sensomotorischen zeigt variable Verhaltensdefizite. Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Mittelwerte wurden durch Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen enthüllt einen signifikanten Haupteffekt der Zeit analysiert (p = 0,015) zugegeben und durch Dunnett Post-hoc-Test Vergleich von allen Mitteln, die Mittel vor der Behandlung folgt. (D) Die Analyse der Tatze-Ziehen Verhalten im Zylinder Test zeigt ein Vorderbein Verhaltensdefizit bis zu vier Wochen im Anschluss an eine ET-1-induzierten ischämischen Verletzung erlitten. Mittel wurden durch Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Bonferroni posthoc Test analysiert. (N = 10) * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die wichtigsten Punkte bei der Quantifizierung paw-Ziehen Verhalten im Zylindertest sind die folgenden, um festzustellen: i) zu quantifizieren, die Anzahl der Pfoten zieht gegen die Gesamt Pfote berührt für jede Pfote vor Hirnverletzung, um eine Basis zu schaffen; ii) zu quantifizieren, die Anzahl der Tatze-Drags gegen insgesamt Pfote berührt für jede Pfote nach der ischämischen Verletzung; und iii) zu unterscheiden zwischen einer Pfote ziehen und die seitliche Bewegung der Pfote an der Zylinderwand während der seitlichen Drehung der Mausoberkörper.
Paw-Ziehen ist ein neuartiges Verhalten, das nach einer Verletzung an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex scheint. Das Aussehen der Tatze-Ziehen Verhalten kann somit als positiver Indikator, dass der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex beschädigt wurde verwendet werden. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass kleine ET-1 Infarkte ca. 2-4 mm 3 im Volumen und an den Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex Ergebnis in paw-Ziehen Verhalten lokalisiert. Dies steht im Gegensatz zu forelimb asymmetrie-Analyse, die im Einklang Defizite in der Prozent der betroffenen Pfote berührt gegen insgesamt berührt folgenden ET-1 ischämischen Rindenverletzungen 4-6 erkennen ausfällt. Analyse von paw-Ziehen Verhalten ist daher bei der Aufdeckung von Schäden an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex empfindlicher. Da ferner paw-Ziehen war bis zu vier Wochen nach der Verletzung aufrechterhalten kann es auch für die Analyse von Wiederherstellung der Funktion sein. Wie wir bereits gezeigt, dass paw-Ziehen Verhalten korreliert mit Schäden an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex 4 kann eine beliebige Anzahl von Verletzungen Modelle mit dieser Analyse der Testzylinder profitieren. Obwohl große Verletzungen, wie der mittleren Hirnarterie und traumatische Hirnverletzung 7,8 zeigen Defizite auf der klassischen forelimb Asymmetrie Analyse des Zylinder-Test, diese Defizite oft im Laufe der Zeit zu lösen. In diesen Fällen Pfoten verschieben, ein empfindlicher Maß für Schäden an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex wäre useful bei der Erfassung chronischer, subtiler Defizite. Ebenso in der Nachspiel Modelle, die weniger konsistente Ergebnisse mit der klassischen forelimb Asymmetrie-Analyse zeigen, würde paw-Ziehen-Analyse nützlich bei der Aufdeckung von konsistenter Verhaltensdefizite sein. Paw-Ziehen-Analyse des Zylindertest hat breite Anwendungen für eine Vielzahl von ischämischer Verletzung Modelle einschließlich der mittleren Hirnarterie, photothrombosis, Pia-Strippen und ET-1, wie hier gezeigt.
Es gibt eine Vielzahl von Verhaltenstests, die forelimb motorischen und sensorischen Defiziten nach Verletzungen sensomotorischen Cortex analysieren. Die Montoya Treppe Test beurteilt forelimb Erreichen und Greifen Verhaltensweisen 9,10. Ebenso einzigen Pellet Erreichen und Pasta essen Tests analysieren die Feinmotorik der Pfoten und Ziffern 11,12. Vorderbein Asymmetrie Analyse des Zylinders Test wird mit Haltungsunterstützung zugeordnet, wenn die Maus auf den Hinterschenkeln 1. Nur die Zahlvon Kontakten jeder Pfote macht mit der Zylinderwand wird quantifiziert. Wie die Pfote berührt nicht untersucht und kann weiter anzeigt Schäden. Frühere Studien haben die Dauer der Unterstützung jeder Vorderpfote Touch quantifiziert und fand konsequenter Defizite in Mäusen nach photothrombotic Schlaganfall 13,14. Unsere Ergebnisse zeigen, dass paw-Ziehen in den Zylinder erscheint nach Verletzungen des forelimb sensomotorischen Kortex und kann zu einer reduzierten Fähigkeit, sein Gewicht mit der betroffenen Pfote und / oder auf einen Verlust der sensorischen Empfang in der Pfote unterstützt bezogen werden. Die Pfote beobachtet wird, um Kontakt mit der Wand zu machen, aber scheint nicht, eine unterstützende Haltung beibehalten oder helfen bei Abstoßen von der Wand, sondern rutscht in, was wir eine Pfote ziehen nennen. Wir haben beobachtet, dass paw-Ziehen Verhalten tritt in fast jedem Tier mit einer Verletzung an der Vordergliedmaße sensomotorischen Kortex und beinhaltet eine sehr einzigartige Muster des Verhaltens, so dass es ziemlich stark in die Vorhersage kortikalen Verletzung in eigenen right. In diesem Sinne ist die Pfote-Ziehen ein nützliches Werkzeug in einer Reihe von Verhaltensanalysen. Es ist die Kombination aus einem niedrigen Start-up-Kosten, der einfachen Verabreichung der Test, und die Zuverlässigkeit der Tatze-Ziehen-Analyse, die Pfote-Ziehen-Analyse des Zylinders Test wie eine wirklich gute Adresse in der Vorhersage fokalen ischämischen Verletzungen in der Maus macht .
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Herrn John Crowell und Mr. Terry Upshall für ihr technisches Know-how und Unterstützung bei der Fotografie und Videografie. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse zur JLV von den Canadian Institutes of Health Research und der Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft von Neufundland und von einem Heart & Stroke Foundation of Canada Canadian Partnership for Stroke Recovery Katalysator Zuschuss unterstützt. RBR war ein Empfänger eines Keith Griffiths Memorial Heart & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
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