Summary
ניתוח הסימטריה forelimb הקלאסי של מבחן הגליל משמש באופן שגרתי כדי להעריך גירעונות התנהגות בחולדות הבאים פגיעה מוחית או שבץ; עם זאת, זה לא מצליח לזהות את הגירעונות עקביים בעכברים. מחקר זה מוכיח כי כימות כפת גרירת התנהגות הוא ניתוח רגיש יותר של פגיעה מוחית בעכברים.
Abstract
מבחן הגליל משמש באופן שגרתי כדי לחזות נזק איסכמי מוקד לקליפת המוח המוטורי forelimb במכרסמים. כאשר הניחו בגליל, מכרסמים לחקור על ידי גידול ולגעת בקירות של הגליל בכפות forelimb לתמיכה ביציבה. בעקבות פציעת איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb, חולדות להסתמך יותר בכבדות על כפת forelimb המושפעת לתמיכה ביציבה וכתוצאה מכך פחות נגיעות בכפה המושפעת שנקראת סימטריה forelimb. לעומת זאת, נזק איסכמי מוקדי במוח העכבר לא מצליח לגרום לגירעונות עקביים דומים בסימטרית forelimb. בעוד גירעונות הסימטריה forelimb הם נצפו לעתים רחוקות, עכברים אין להפגין התנהגות פוסט שבץ רומן נקרא "כפת גרירת". Paw גרירת היא הנטייה לעכבר כדי לגרור כפתה המושפעת לאורך קיר הצילינדר ולא ישירות מלדחוף את הקיר כאשר פירוק מאחורי לעמדת ארבעה רגליים. אנחנו הוכחנו בעבר שהתנהגות גרירת כפה היא רגישה מאוד לפציעות איסכמי בקליפת המוח קטנות לקליפת המוח המוטורי forelimb. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח גרירה-כפה. אנו מגדירים מה היא כפת גרירה ולהדגים כיצד לכמת גרירה-כפת התנהגות. מבחן הגליל הוא בדיקה פשוטה ולא יקרה לניהול ואינו דורש מראש הכשרה או אסטרטגיות מניעת מזון. בשימוש בניתוח גרירה-כפה עם מבחן הגליל, זה ממלא נישה לניבוי פציעות איסכמי קליפת המוח כגון photothrombosis ואנדותלין-1 (ET-1) איסכמיה -induced - שני דגמים שהולכים וגוברים בפופולריות ולייצר פציעות מוקדי קטנות יותר מחסימת עורק המוח אמצעית. לבסוף, מדידת גרירה-כפת התנהגות במבחן הגליל תאפשר מחקרים של החלמה תפקודית לאחר פגיעה בקליפת המוח באמצעות עוקבה רחבה של זני עכבר מהונדסים שבי ניתוח הסימטריה forelimb קודם לא הצליח לזהות את גירעונות עקביים.
Introduction
המטרה של אסטרטגיות התחדשות עצביות היא להדגים שני תיקון רקמות והחלמה תפקודית. התאוששות תפקודית מוערכת בדרך כלל עם בדיקות התנהגותיות המודדות גירעונות תפקודיים, במקרה זה כרוך בכישורים מוטוריים הקשורים לפגיעה באזורים הספציפיים במוח. פגיעה מוחית טראומטית או נזק איסכמי לאזור forelimb הסנסורית של הקליפה ניתן להדגים על ידי מספר הבדיקות התנהגותיות. מבחן אחד כזה, במבחן הגליל נעשה שימוש נרחב בחולדות להעריך גירעונות תפקודיים בפעילות forelimb 1. יש מבחן עלות הקמה נמוכה הדורשת רק צילינדר, מצלמה ושולחן עם ראש שקוף. זה קל לניהול כפי שהוא מבוסס על התנהגות הגישוש הטבעית של מכרסמים, כך שלפני אימון ומניעת מזון או תגמולים אינם נדרשים. למרות יתרונות רבים אלה, מבחן הגליל מנוצל תחת להעריך גירעונות forelimb בעכברים הבאים פציעות מוקד לים forelimbensorimotor קליפה, שאנו מייחסים לניתוח התנהגות עכבר במבחן הגליל. הסימטריה forelimb היא המדד הקלאסי של ניתוח לבדיקת הצילינדר. כאשר הניחו בגליל, מכרסמים באופן טבעי לחקור את הקירות של הגליל על ידי גידול על הגפיים האחורי שלהם ולגעת בקירות הצילינדר בכפות forelimb לאיזון יציבה. מספר נגיעות כפה עם הקיר אחד עם forelimb הוא לכמת בקלות על ידי צילומי מכרסמים במהלך חקירה זו של הגליל. הסימטריה forelimb מתרחשת כאשר כפת forelimb המושפעת עושה פחות נגיעות בקיר מכפת forelimb מושפעת ומעידה על נזק לקליפת המוח הסנסורית הנגדית. בחולדות, זריקות תוך-המוחיית של סוכן vasoconstrictive, אנדותלין (ET-1), לקליפת המוח הסנסורית forelimb גורם נגע איסכמי מוקדי שתוצאת גירעונות התנהגות בforelimb הנגדי. גירעונות בשימוש forelimb נגדי מזוהים בקלות שינויים בForelimb חוסר סימטריה במבחן הגליל בחולדות 1-3. בניגוד לחולדות עם זאת, שינויים בסימטרית forelimb משתנים ופחות עקביים בעכברים הבאים זריקות ET-1 דומה 4-6. כאן אנו מדגימים ניתוח רומן של forelimb התנהגות במבחן הגליל - ניתוח של גרירה-כפת התנהגות. הראינו בעבר כי ניתוח גרירה-כפה הוא מדד רגיש יותר לנזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb בעכברים מאשר ניתוח הסימטריה forelimb הקלאסי ולכן חל על מגוון רחב של דגמי פציעת קליפת המוח מוקד.
בדיקה של כמה אנשי הקשר בכפו קיר הצילינדר הבאים נזק איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb חשף התנהגות רומן בעכברים - כפה-גרירת 4. גרירת כפה מתרחשת כאשר עכבר עומד על רגליו האחוריות כדי לחקור את קיר הגליל אז גורר את כפתה המושפעת (קונטרה-lesional) לאורך קיר הגליל לכיוון קו האמצע שלה או את הקיר בזמן שבכפו לא נפגע מספקת תמיכה יציבה על הקיר. Paw-גורר לעתים רחוקות מתרחש בעכברים ללא כל פגע לכן את המראה של כף גרירה הוא אינדיקטור חיובי של פגיעה בקליפת המוח הסנסורית forelimb 4. יש לנו לכמת בעבר גרירה-כפת התנהגות בעכברים הבאה ET-1 נזק איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb והראו שנגרמה התנהגות גרירה-כפה בעכברים עד שבועיים שבץ-פוסט 4. כאן אנו מראים כי גרירה-כפת ההתנהגות מתמשכת עד שבץ-פוסט ארבעה שבועות. ניתוח של גרירה-כפת התנהגות מספק כלי חדשני ורגיש להערכת נזק איסכמי מוקד לקליפת המוח הסנסורית forelimb בעכברים. ההגדרה שלה זולה, קל ממשל ובקיע להפוך את זה לכלי פשוט, עדיין שימושי כדי להעריך במהירות את גירעונות התנהגות forelimb בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה ממוריאל של ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של ניופאונדלנד בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
1. עכברים
- השתמש עכברים בוגרים. במחקר זה, עכברי FVBN זכר בוגר (n = 10) בין 2-4 חודשים היו בשימוש. עכברי בית בשעה 00:12 להפוך מחזור אור-חושך ולספק אוכל מכרסם סטנדרטי וכרצונך מים.
2. חומרים הדרושים לבדיקת הצילינדר
- להשיג שולחן עם ראש שקוף לצלם את מבחן הגליל. הממדים של השולחן הם לא רלוונטיים, העליון חייב להיות פרספקס או זכוכית, ושחייב להיות מספיק מקום כדי למקם מראה מתחת לשולחן. זה מאפשר לעכבר להיות צילם מלמטה. השתמש במראה מתחת לשולחן כדי לשקף את התמונה דרך הגליל. כחלופה, להשתמש מצלמה הפוכה, אם זמין. הממדים של שולחן שימוש בפרוטוקול זה הם 54 x 56 x 66.5cm (wxlxh) עם 51 x 51cm העליון (wxl).
- להשיג מראה. הממדים של מראה שימוש בפרוטוקול זה הם 34 x 58cm (wxl).
- להשיג צילינדר שקוף / פרספקס לעכבר כדי לבצע ב. הממדים של הגליל בשימוש בפרוטוקול זה הם 17.5cm גבוה, 8.8cm זיהוי, 9.5cm OD עם עובי דופן של 0.35cm. גליל גבוה עשוי להידרש לזני עכבר פעילים יותר.
- מניחים את הגליל על השולחן ולצלם את ההשתקפות במראה להלן.
- מצלמת וידיאו וחצובה נדרשים. להקליט קטעי וידאו בכ 650Kb / s, שכ הוא 190MB לכל 5 דקות של וידאו גליל. ודא שיש לו את המצלמה פונקציונלי זום על מנת להבטיח שהגליל מקיף את כל שדה הראייה.
הערה: מצלמת וידיאו שימוש בפרוטוקול זה הוא Sony DCR-SR42, זום אופטי 40X, זום דיגיטלי 2,000x, 680kpix אשר משתמש הגדרה סטנדרטית, interlaced וידאו NTSC). - להשיג תוכנה לניתוח - pl תקשורתAyer עם תמיכת וידאו ואפנון מהירות השמעה. נגן המדיה שימוש בפרוטוקול זה הוא v2.1.2 VLC Media Player.
- להשיג מחשב עם מערכת הפעלה מסוגלת להריץ את נגן המדיה וצג.
- אחסון אלקטרוני עבור קטעי וידאו נדרש. להוריד קטעי וידאו לדיסק קשיח חיצוני או להעתיק אותו על גבי תקליטורי DVD לאחסון לטווח ארוך.
הערה: ב190MB לוידאו, 84 מפגשים יתאימו על כרטיס SD GB 16 ו -168 מפגשים יתאימו על כרטיס SD 32GB. בשל inexpensiveness היחסי של תקשורת SD, וחוסר הוודאות בכמה זמן כמה עכברים דורשים כדי להשלים 20 אחוריים, כרטיס 32 GB מומלץ. במחקר הנוכחי, קטעי הווידאו הועתקו מהמצלמה לדיסק קשיח חיצוני 2TB ולאחר מכן recopied על תקליטורי DVD כגיבוי.
3. התקנה ניסיונית של מבחן הצילינדר
- להדק מראה מתחת לשולחן בזווית של 45 מעלות לשולחן. האם שני סוגריים תמיכה זו באמצעות מצורף לרגלי השולחן לSupport העליון ותחתון של המראה, בהתאמה. מקומות הסוגר מצוינים בצד וצפה בטבלה (איור 1 א) ונוף פנים על השולחן (איור 1).
- מניחים גליל במרכז השולחן. לצייר ארבעה קווים במרחק שווה הגליל שבי יושב על השולחן עם טוש שחור (נוכל), כך שהגליל יכול להיות הרים וחזר לאותו המצב (איור 2). ציורם בחלק התחתון של השולחן השקוף מאפשר השולחן לנקות בין ניסויים בבעלי החיים ללא המסת דיו הסמן.
- צרף את המצלמה וחצובה. לכוון את המצלמה במראה, כך שהתמונה היא מחפשת ישירות דרך הקנה של הגליל. ודא שהקיר הפנימי המלא של הגליל הוא גלוי וללא הפרעה על ידי הבסיס (איור 3). ראה מבט מצד על של ההתקנה, כולל הזווית היחסית של התקנת המצלמה ומראה, מלמעלה (איור 4 א) ומרמה של השולחן, כולל גידול עכבר (איור 4).
- הכן כרטיסי רמיזה לזהות כל עכבר לפני צילומים. ודא שהכרטיסים כוללים בדרך כלל מספר זיהוי לכל עכבר, נקודת הזמן של הבדיקה (לדוגמא., 3 ימים לאחר טיפול) ומועד פגישת צילומים. אינו כולל את קבוצת הטיפול בכרטיס האות כדי להבטיח את הניסוי הוא עיוור.
- סרט בתנאי תאורה פנימיים סטנדרטיים כמו זה ברמה של אור נדרש כדי לראות את תנועות העכבר סביב הגליל בבירור.
הערה: אם זמין מצלם בחושך עם מצלמה אור אדומה עשויים להספיק, אולם אחד היה קודם צריך לבדוק אם נגיעות כפה וגורר נראות בבירור לכימות.
4. ביצוע
- להתחיל לצלם. הצג את כרטיס אות העכבר המתאים מול עדשת מצלמה.
- מנמיכים את העכבר לתוך הצילינדר מלמעלה הפתוחים מייד לאחר שצילם את כרטיס האות.
- תתחיל לצלם את העכבר. למזער את הרעש בתקופה זו, כמו עכברים עלולים לאבד עניין בחקר אם נבהל.
- שים לב לחלק אחורי העכברים לחקור את הגליל. ללכוד את הווידאו עד העכבר מבצע מינימום של אחוריים עשרים.
הערה: אחורית מתרחשת כאשר שני כפות רגליו קדמיות מאבדות מגע עם הרצפה והעכבר עומד על רגליו האחוריות. - נגב שולחן וגליל עם תמיסת ניקוי מתאימה בין כל עכבר כדי לטהר ולהסיר ריחות עכבר.
- הקפאה היא כאשר עכברים להפסיק לחקור ולהישאר בשקט יושבים על ארבע לכ 5 דקות. אם עכברים להקפיא לפני אחוריים עשרים להתרחש, זה עשוי להיות נחוץ כדי להסיר אותם מהגליל 10-20 דקות לפני חידוש המבחן. אם עכברים לא לבצע אחוריים עשרים, הם יוסרו מן המחקר.
הערה: מניסיוננו, עכברים לא צריכה להיות נכללו עקב אי לחקור את הגליל.
5. הערכת מבחן הצילינדר באמצעות Paw גרירהניתוח
- לנגן את הווידאו בקצב של בין 0.25x ו0.67x מהירות קבועה תלוי כמה מהר את העכבר בוחן את הגליל. להשתמש בנגן מדיה שמציע מהירויות השמעה איטיות יותר.
- לכמת את המספר הכולל של נגיעות כפה. נגיעות כפה להתרחש כאשר אחורי העכבר (איור 5 א), נוגעים בצד של הגליל (איור 5), לאחר מכן יורדת מסוס עם שני כפות בו זמנית (איור 5 ג) ואדמות (איור 5D). הכפה יכולה או לא יכולה לפנות לקיר הגליל עם כף מלאה, אבל קשר כלשהו עם קיר הגליל חייב להתרחש. להעריך נגיעות כפה על ידי ספירת מספר הפעמים שהעכבר יוצר קשר (לא משנה כמה קצר) עם קיר הגליל עם אחת או את שני כפות רגליו קדמיות עת שעמד על הרגליים האחוריות שלה במהלך אחורי.
שים לב שקשר עם קיר הגליל נספר רק כ" מגע כפה "או" כפת גרירה "אם העכבר נמצא בעמדה אחורית - מעמדעל הגפיים האחורי שלה עם שני כפות רגליו קדמיות מעל השולחן. אם העכבר נשאר בעמדת 3 נקודות - שני גפיים אחוריות וכף אחת על השולחן וממשיך לגעת בקיר עם הכפה החופשית - זה לא נחשב כמגע כף. עכברים עשויים אחוריים ולגעת בקיר הגליל עם כף אחת וזה נחשב כמגע כף. הערה: עכבר עשוי גם להזיז את הגוף שלה ברחבי הגליל במהלך אחורי, עושה יותר משני אנשי קשר. מגעים אלה נספרים - אחד לכל מגע בכפו שמאלי ואחד לכל מגע בכפו ימני. - לכמת את מספר כפה-שאיפות. התנהגות גרירת כפה שונה מנגיעות כפה נורמליות.
- אם אנשי קשר כפת קיר הגליל עם כף יד פתוחה מלאה (איור 6), היא תיפול לאט מהקיר, לעתים קרובות עם רעד קל. התנועה מתחילה בספרות גרירה על קיר הגליל או בכיוון המדיאלי או כלפי מטה, (איור 6 ג) לפני שנפלתי משם completאיליי (איור 6 ד). אז העכבר יהיה לרדת עם הכפה המושפעת (איור 6-ה) לפני שנחת על ארבע (איור 6F). זה נחשב כפת גרירה וצריך לספור במניין.
- אם הכפה לא לפנות לקיר הגליל עם כף יד פתוחה באופן מלא, זה יהיה לרעות קיר הגליל עם הספרות שלה לפני שנפל מקיר הגליל. באופן דומה, עכבר עשוי לגרור כפתה כנגד קיר הגליל אך לא לשחרר אותו לחלוטין לפני פירוק. אלה שני נחשבים כפה-גוררת כמו גם נגיעות וצריכה להיחשב כשני במספר נקודות.
- הכפה עלולה גם לגרור לאורך קיר הגליל תוך עכבר בוחן את הגליל. במקרה זה, הכפה תעקוב הפיתול של פלג הגוף העליון של העכבר כפי שהוא בוחן שמאלי או ימני של העמדה המקורית שלו (איור 7 א-ד) לפני פירוק (איור 7E). זו אינה נחשבת כפת גרירה, כפי שהוא תלוי בעכבר באופן אקראי בחירהכיוון לחקור ואינו תלוי שבחצי כדור קליפת המוח נפגע.
- Paw-שאיפות באות לידי ביטוי כאחוז מכפה-גורר למספר כולל של נגיעות כפה במהלך. הגעה מספר כפה-שאיפות כאחוז מאנשי קשר כפה כוללת עבור כל forelimb בנפרד.
- נגיעות וכתוצאה מכך כף גרירה לספור ככפת גרירה ומגע בו זמנית. לכן, אם עכבר גורר הכפה בכל פעם שהאנשים הקשר שלו כפת קיר הגליל, אחוז גרירה-הכפה מבוטא 100%.
6. הצעות ניסויי עיצוב נוסף
- כדי למזער את המשתנים חיצוניים:
- בדוק את העכברים באותו הזמן בכל יום בדיקה. בדוק את העכברים במהלך המחזור בעקבותיהם. שמירה על עכברים במחזור הפוך אור 12 שעות מאפשרת ביצועים.
- עכברים יכולים להיות מסרבים לחקור את הגליל אם הדגיש גם על ידי רעש או סביבת רומן. בדיקת עכברים בחדר שלהם בבעלי החיים החזקות או חדר הם been להכיר עם מפחית את הלחץ. זה יכול להתרחש אם החדר רועש, אם העכבר כבר נדחק לפני כניסת הצילינדר או בשל התרגלות.
הערה: בדיקה צריכה להתבצע פעם אחת לפני מניפולציה ניסויית לשמש כקריאה בסיסית. לאחר מניפולציה, ימי בדיקה הם בשיקול דעתו של הנסיין, למרות שזה מומלץ להימנע ממספר מופרז של חשיפות לגליל על פני תקופה קצרה של זמן. - עכברים עלולים להיות ששים אחורי אחרי 6-7 חשיפות לגליל. לצורך המחקר הנוכחי, עכברים נבדקו בגליל עבור הסכום כולל של שבע פעמים, לפני איסכמיה ובימים 1, 3, 7, 14, 21 ו -28 לאחר ניתוח.
הערה: במחקר זה השתמשנו בזן FVBN העכבר. בדקנו בעבר C57Bl / 6 עכברים בגליל ונצפתה התנהגות גרירה-כפה הבאה פציעת איסכמי ET-1 (מידע לא מוצג). עכברי C57BL / 6 היו פעילים יותר מעכברי FVBN כאשר גידול ולעתים קרובות קפצו על החישוק של הגליללפני הטיפוס החוצה. יש להשתמש בגלילים גבוהים אם עכברים מנסים להימלט בקפיצה.
7. מדידות נפח אנדותלין -1 ניתוח והאוטם
- לבצע ניתוח אנדותלין -1 ומדידות נפח אוטם על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר 4. כדי למקד את הקורטקס המוטורי forelimb הקדמי, כל עכבר צריך לקבל שלוש ET-1 זריקות בקואורדינטות הבאות: 0.7 (i) anteriorposterior (AP) /1.5 המדיאלי-צדדיים (מיליליטר) / - 1.2 הגבי-הגחון (DV), ( ii) 0.4 AP / 1.25 מיליליטר / - 1.2 DV וכן (iii) 0.1 AP / 1.75 מיליליטר / -1.2 DV 4.
8. ניתוח סטטיסטי
- ניתוח מדידות חוזרים דו-כיוונית של שונות (ANOVA) מומלץ לנתח אחוזים לכפות המושפעות ותושפענה על פני נקודות זמן שונות גרירה-כפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו הוכחנו בעבר כי התנהגות גרירה-כפה מופיעה הבאה פציעת איסכמי מוקד לקליפת המוח הסנסורית forelimb והוא אינדיקטור חיובי של נזק 4. זריקות תוך-המוחיית של ET-1 לקליפת המוח הסנסורית forelimb שמשו כדי לגרום לפגיעת איסכמית (איור 8 א ', ב'). מחקר זה בדק האם גרירה-כפת ההתנהגות הוארכה ליותר מ -14 ימים לאחר פציעה לשימוש הפוטנציאל שלה כדי להעריך את ההחלמה תפקודית. עכברים נבדקו במבחן הגליל ביום לפני ET-1 זריקות לנקודת הזמן מראש ניתוח, ובימים 1, 3, 7, 14, 21 ו -28 לאחר פציעה. בכל נקודת זמן, מספר נגיעות כפה וגורר את הכף היה לכמת עבור שתי כפות המושפעות ותושפענה. שני צעדים בדרך חוזר ונשנה ANOVA על מספר נגיעות כפה גילו השפעות משמעותיות עיקריות של זמן [F (6108) = 3.59, P = .0028] ונושאים [F (18108) = 2.38, P = .0032] אבל אין כל השפעה של טיפול(טבלה 1). ואילו, באמצעות הניתוח הסטנדרטי של הסימטריה forelimb למבחן הגליל אשר מכמת נגיעות כפה מושפעות לעומת סך נגיעות כפה חשף גירעונות התנהגות forelimb עולה בקנה אחד. צעדים בכיוון אחד חזרו ANOVA על אחוזים שימוש כפה המושפע חשפו השפעה העיקרית משמעותית של זמן (p = 0.015) שאחריו מבחן הפוסט הוק של Dunnett הראה ירידה משמעותית בשימוש כפה המושפע אחוזים בשעה 7, 14 ו -21 ימים לאחר -surgery והתאושש ב -28 ימים שלאחר הניתוח (איור 8C). לעומת זאת, שני צעדי דרך חוזרות ונשנות ANOVA על מספר הכפה גוררים חשפו השפעות עיקריות משמעותיות של זמן [F (6108) = 7.09, P <0.0001], טיפול [F (1,108) = 33.02, P <0.0001], אינטראקציה [ F (6108) = 9.89, P <0.0001] ונושאים [F (18108) = 4.84, P <0.0001]. ניתוח Bonferroni נוסף פוסט הוק הראה עלייה משמעותית במספר הכפה גורר בכל נקודת זמן לאחר ניתוח (טבלת 1). כמו כן, שתי בדרך חזרו אמצעי ANOVA השוואת מספר מושפע הכפה-גורר לעומת סך נגיעות כפה מושפעות גילה השפעות משמעותיות עיקריות של זמן [F (6108) = 6.63, p <0.0001], טיפול [F (1,108) = 20.46, p = 0.0003], אינטראקציה [F (6108) = 8.21, p <0.0001] ונושאים (התאמה) [F (18108) = 7.35, p <0.0001]. ניתוח Bonferroni נוסף פוסט הוק הראה משמעותית גרירה-כפת התנהגות עד לאחר ניתוח 28 ימים (איור 8D). התנהגות גרירה-הכפה הייתה ספציפית לאיבר הפגוע כמו שאף עלייה או שינוי בכפת גרירת נצפתה עם האיבר מושפע. התנהגות עם הכף המושפעת גרירה-הכפה הייתה גבוהה באופן משמעותי בבית 1, 3, 7, 21 ו -28 ימים שלאחר הניתוח (איור 8D). התנהגות גרירת כפה הגיעה לשיא של פוסט-ניתוח יום 1 ב> 30% מכל נגיעות הכפה עם forelimb המושפע וכתוצאה מכך כף גרירה אז ירד ל ~ 15% ב -3 ימים לאחר ניתוח שבו נשאר עד וכולל 28 ימים לאחר ניתוח. בשעת 28 ימים לאחר ניתוח, עכברים מורדמים וכרכי אוטם העריכו. נפח האוטם הממוצע לקבוצה היה 3.2 ± 0.4 מיקרומטר 3 (n = 10 עכברים). תוצאות אלו מראות כי אוטמים בקליפת המוח קטנים יכולים לגרום לגירעונות התנהגות משמעותיים ומתמשך, כפי שנמדדו במבחן הגליל. לסיכום, נתונים אלה מראים כי לא רק הוא תגובה מאוד לניזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb גרירה-כפה, אבל שכפת גרירת גם נמשכת לאורך זמן וניתן להשתמש בו כדי להעריך את ההחלמה תפקודית.
מקומות תושבת איור 1. להדק מראה במקום מתחת לשולחן. (א) להציג חזית שולחן מראה מקומות הסוגר על רגליים הקדמיות של השולחן. הגדלה גבוהה של הבלעה במיקום מראה בסוגריים על רגליים הקדמיות (א '). מבט אחורי של הצג שולחן (ב) ing מקומות תושבת רגל אחוריים. הגדלה גבוהה של הבלעה בB מציינת מיקום תושבת על רגליים האחוריות של שולחן (ב ').
איור 2. סימון המיקום למיקום גליל על השולחן. תמונה של השולחן מציין מיקום של הגליל עם קווים שחורים נמשכים סביב ההיקף של הבסיס. חצים מצביעים על הקווים השחורים נמשכים בחלק התחתון של פרספקס משמש למרכוז הגליל על השולחן.
מבט מלפנים איור 3. של מצלמה והגדרת שולחן. תמונה של השולחן מפגין קו הראיה ישיר דרך קנה הגליל (חץ אדום).
דק-page = "תמיד"> 
איור 4. מבט מצד של הגדרת המצלמה ושולחן. המצלמה מיועדת ישירות בבסיס של הגליל. טבלה () והתקנת מצלמה נלקחו מלמעלה. טבלה (B) והתקנת מצלמה נלקחו ברמה של השולחן, מראים גידול עכבר בגליל.
איור 5. רצף של תמונות מפגינות גידול עכבר וללא כל פגע. (א) תמונה של עכבר לפני אחורי. (ב) העכבר נוגע בקיר הגליל עם שני כפות. (ג) כדי לרדת, עכבר ידחוף על קיר הגליל באמצעות שני כפות, ואדמה (ד) בכל ארבע כפות. הכפה של לוטננט = העכבר השמאלי, הכפה הימנית של RT = העכבר.
איור 6. רצף של תמונות מפגינות כפת גרירת עכבר פצועה. (א) תמונה של עכבר לפני אחורי. (ב) העכבר לגעת בקיר הגליל עם שני כפות; (ג) אז תן לאט את הספרות על גרירת הכפה המושפעת בצורה אנכית במורד קיר הגליל; (ד) לפני שנותן לי הכפה נופלת מהקיר. (ה) העכבר ואז לרדת ברגלם לא נפגעה ואדמה (F) בכל ארבע כפות. ריבועי בהגדלה גבוהים בB, C ו- D להדגים כיצד אנשי הקשר בכפו המושפע קיר הגליל. הכפה השמאלית של לוטננט = העכבר.
איור 7. "כפת גרירה שאינה". (ב) העכבר מסובב את הגוף שלה רוחבי לחקור את קיר הגליל. (ג) העכבר מחדש עמדות הכף המובילה שלה למיקום חדש רוחבי וגורר את הכפה נגררת שלה באותו הכיוון. הכפה נגררת (ד) נטועה עמוקה במיקומו החדש, ושני כפות משמשות ללרדת (E) כדי לחזור לכל ארבעת כפות. ראשי החץ אדומים מצביעים על מיקום של כפות במיקומי התחלה וסיום. חץ אדום מציין תנועה של כף נגרר לאורך קיר הגליל.
() PH 8. התנהגות Paw-גרירת הדמות ספגה במשך 4 שבועות הבאים בקליפת המוח מוקדי, נגע איסכמי. נציג otomicrograph של סעיף מוכתם סגול cresyl עטרה מוח דרך נגע איסכמי ET-1 ב 28 ימים שלאחר ניתוח. הגדלה גבוהה של נגע ET-1 של אזור התאגרף ב( B). ניתוח (C) של א-סימטריה forelimb במבחן הגליל הבא פציעת איסכמי ET-1 להסנסורית forelimb תערוכות גירעונות התנהגות משתנים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אמצעים נותחו על ידי מדידות חוזרות בכיוון אחד ANOVA חושף השפעה העיקרית משמעותית של זמן (p = 0.015) ואז אחרי בדיקת הפוסט הוק של Dunnett השוואה בכל האמצעים לאמצעים לפני הטיפול. (ד) ניתוח של גרירה-כפת התנהגות במבחן הגליל חושף גירעון התנהגות forelimb מתמשך עד ארבעה שבועות הבאים פציעת איסכמי מושרה ET-1. אמצעים נותחו על ידי אמצעים דו-כיווניים חזרו ANOVA ואחריו מבחן posthoc Bonferroni. (N = 10) * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.f = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נקודות מפתח להקמה כאשר כימות גרירה-כפת התנהגות במבחן הגליל שעוקבים: i) לכמת את מספר הכפה-גורר לעומת נגיעות כפה כוללת עבור כל כפה לפני פגיעה מוחית להקים בסיס; ii) לכמת את מספר כפה-שאיפות לעומת נגיעות כפה כוללת עבור כל כפה הבאה פציעת איסכמי; וiii) להפלות בין כפת גרירה והתנועה לרוחב של כף הרגל לאורך קיר הגליל במהלך סיבוב לרוחב של פלג הגוף העליון של העכבר.
Paw גרירת היא התנהגות רומן שמופיעה לאחר פגיעה בקליפת המוח הסנסורית forelimb. המראה של גרירה-כפת התנהגות לכן יכול לשמש כאינדיקציה חיובית שקליפת המוח הסנסורית forelimb נפגעה. התוצאות מראות כי נציג אוטמים קטנים ET-1 כ 2-4 מ"מ 3 בנפח ומקומי לתוצאות הקליפה הסנסורית forelimb בגרירה-כפת התנהגות. זאת בניגוד לforelimb asymניתוח "חג שלא מצליח לזהות את הגירעונות עקביים באחוז נגיעות כפה המושפעות לעומת נגיעות כללי הבא ET-1 פציעות קליפת המוח איסכמי 4-6. ניתוח של גרירה-כפת התנהגות לכן הוא יותר רגיש בגילוי נזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb. יתר על כן, כי כפת גרירת נשמרה עד ארבעה שבועות לאחר פציעה זה יכול להיות גם מתאים לניתוח שחזור של פונקציה. כפי שהראינו בעבר כי גרירה-כפת התנהגות בקורלציה עם נזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb 4, כל מספר של דגמי פציעה עשוי להועיל שבניתוח זה של מבחן הגליל. למרות פציעות גדולות, כגון עורקים התיכון ספיגה מוחין ומוח פציעת 7,8 גירעונות מופע טראומתיים על ניתוח א-סימטריה forelimb הקלאסי של מבחן הגליל, גירעונות אלה לעתים קרובות לפתור לאורך זמן. במקרים אלה, כפה-גרירה, להיות מדד רגיש יותר לנזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb תהיה useful באיתור גירעונות כרוניים, עדינים יותר. כמו כן בדגמי פציעה אשר מראים תוצאות פחות בקנה אחד עם ניתוח הסימטריה forelimb הקלאסי, ניתוח גרירה-כפה יהיה שימושי באיתור גירעונות התנהגות עקביים יותר. יש כפת גרירה-אנליזה של מבחן גליל יישומים רחבים עבור מגוון רחב של דגמי פציעת איסכמי כוללים עורקים התיכון ספיגה מוחין, photothrombosis, הפשטת pial וET-1, כפי שמודגם כאן.
יש מגוון של בדיקות התנהגותיות המשמשות לניתוח מנוע forelimb וגירעונות חושיים הבאים פגיעה בקליפת המוח הסנסורית. מבחן מדרגות מונטויה מעריך forelimb להגיע ולתפוס התנהגויות 9,10. כמו גלולה אחת להגיע ואכילת פסטת בדיקות לנתח את הפעילות המוטורית העדינה של כפות וספרות 11,12. ניתוח הסימטריה forelimb של מבחן הגליל מזוהה עם תמיכה ביציבה כאשר סמן העכבר נמצא על הגפיים האחורי שלה 1. רק המספרמאנשי קשר של כל כפה עושה עם קיר הגליל הוא לכמת. איך הכפה יוצרת קשר לא נבדק ועלול להוות אינדיקציה נוספת של נזק. מחקרים קודמים לכמת את משך התמיכה של כל כף מגע ומצאו יותר גירעונות עקביים בעכברים לאחר שבץ photothrombotic 13,14. התוצאות שלנו מראות כי בגליל גרירה-הכפה מופיעה בעקבות פציעה לקליפת המוח הסנסורית forelimb ועשויה להיות קשורה ליכולת מופחתת כדי לתמוך במשקל שלה עם הכף המושפעת ו / או עקב אובדן של קליטה חושית בכפה. הכפה הוא ציין ליצור קשר עם הקיר אך אינו מופיעה כדי לשמור על עמדה תומכת או לסייע בדחיפה מהקיר אלא מחליקה את מה שאנו מכנים בכפת גרירה. ראינו כי גרירה-כפת התנהגות מתרחשת כמעט בכל בעלי חיים עם פגיעה בקליפת המוח הסנסורית forelimb וכרוך דפוס ייחודי מאוד של התנהגות, מה שהופך את זה די חזק בניבוי פגיעה בקליפת המוח בr שלהight. במובן זה, כפת גרירת היא כלי שימושי בסוללה של ניתוחי התנהגות. זה שילוב של עלות הזנק נמוכה, קלות ניהול של הבדיקה, והאמינות של ניתוח גרירה-הכפה שעושה ניתוח גרירה-כפה של מבחן גליל בחירה אטרקטיבית כגון בניבוי פגיעת איסכמית מוקדי בעכבר .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למר ג'ון קרוול ומר טרי Upshall למומחיותם הטכנית וסיוע בצילום וצילום וידאו ב. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלת מענקים לJLV מהמכון הקנדי לחקר בריאות והחברה למחקר ופיתוח של ניופאונדלנד ולב ושבץ הקרן של השותפות הקנדית קנדה למענק Catalyst שחזור שבץ. RBR היה נמען של ושבץ מלגת קרן בוגר קית גריפיתס זיכרון לב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
