Anvendelsen af høj opløsning Infrarød termografi (HRIT) for Studiet af isnukleering og Ice Formering i Plants
Summary
Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).
Abstract
Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.
Introduction
Frysning temperaturer, der forekommer, når planterne er aktivt voksende kan være dødbringende, især hvis planten har ringe eller ingen frysning tolerance. Sådanne frost begivenheder ofte ødelæggende virkninger på landbrugsproduktionen og kan også spille en vigtig rolle i udformningen af samfundet struktur i naturlige populationer af planter, især i alpin, sub-arktiske og arktiske økosystemer 1-6. Episoder med svær forårsfrost har haft store konsekvenser for frugtproduktion i USA og Sydamerika i de seneste år 7-9 og er blevet forværret af den tidlige debut af varmt vejr, efterfulgt af mere typiske gennemsnitlige lave temperaturer. Den tidlige varmt vejr inducerer knopper til at bryde, aktivering af væksten af nye skud, blade og blomster som alle har meget lidt at ingen frost tolerance 1,3,10-12. Sådanne uberegnelige vejrmønstre er blevet rapporteret til at være en direkte afspejling af igangværende klimaændringer og forventes at være en fælles vejr mønster for foreseeable fremtid 13. Bestræbelser på at give økonomiske, effektive og miljøvenlige management teknikker eller landbrugskemikalier, som kan give øget frost tolerance har haft begrænset succes for et væld af grunde, men dette kan til dels tilskrives den komplekse karakter af frysning tolerance og frysning unddragelse mekanismer i planter. 14
De adaptive mekanismer forbundet med frost overlevelse i planter er traditionelt blevet opdelt i to kategorier, frysning tolerance og frysning unddragelse. Førstnævnte kategori er forbundet med biokemiske mekanismer reguleres af et bestemt sæt af gener, der giver planter til at tolerere de belastninger, der er forbundet med tilstedeværelsen og den dehydratiserende virkning af is i sine væv. Mens sidstnævnte kategori er typisk, men ikke udelukkende, i forbindelse med de strukturelle aspekter af en plante, der bestemmer, om, hvornår og hvor is former i et anlæg 14. Til trods for forekomsten af fryse undgåelse som en adaptive mekanisme, er lidt forskning er blevet afsat i den seneste tid på at forstå de underliggende mekanismer og regulering af fryse unddragelse. Læseren henvises til en nylig 15 for nærmere detaljer om dette emne.
Mens isdannelse ved lave temperaturer kan virke som en enkel proces, mange faktorer bidrager til at bestemme den temperatur, hvor is nukleerer i plantevæv, og hvordan den spreder inden planten. Parametre, såsom tilstedeværelsen af extrinsiske og iboende is kimdannelsesmidler, heterogene vs. homogene nukleeringsbegivenheder, termisk-hysterese (frostvæske) proteiner, tilstedeværelsen af specifikke sukkere og andre osmolytter, og et væld af strukturelle aspekter af planten kan alle spille en væsentlig rolle i fryseprocessen i planter. Kollektivt, disse parametre påvirker temperatur, ved hvilken en plante fryser, hvor isen er indledt, og hvordan det vokser. De kan også påvirke morfologien af de resulterende iskrystaller.Forskellige metoder er blevet anvendt til at undersøge fryseprocessen i planter under laboratoriebetingelser, herunder kernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) 16, magnetisk resonans (MRI) 17, cryo-mikroskopi 18-19, og lav temperatur scanningselektronmikroskopi (LTSEM ). 20 Indefrysning af hele planter i laboratorie- og field indstillinger har dog primært blevet overvåget med termoelementer. Anvendelsen af termoelementer for at studere frysning er baseret på frigivelse af varme (smeltevarme), når vandet undergår en faseovergang fra en væske til et faststof. Frysning derpå registreres som en exoterm begivenhed. 21-23 Selvom termoelementer er de typiske foretrukne metode i at studere frysning i planter, deres anvendelse har mange begrænsninger, der begrænser mængden af information indsamlet under selve frysningen. For eksempel med termoelementer er det vanskeligt at næsten umuligt at afgøre, hvor isen initieres i planter, hvordan det udbreder,hvis det udbreder med en ensartet hastighed, og hvis nogle væv forbliver fri for is.
Fremskridt i høj opløsning infrarød termografi (HRIT) 24-27, men har øget muligheden for at indhente oplysninger om indefrysning processen i hele planter, især når de anvendes i en differential billedbehandlingstype. 28-33 I nærværende rapport, vi beskriver anvendelsen af denne teknologi til at studere forskellige aspekter af fryseprocessen og forskellige parametre, som påvirker, hvor og og til hvilken temperatur is initieres i planter. En protokol vil blive præsenteret, der vil demonstrere evne til is-nukleation-aktiv (INA) bakterie, Pseudomonas syringae (Cit-7) til at fungere som en ydre kimdannelsesmiddel indlede frosset for urteagtig plante med en høj, frost temperatur.
Høj opløsning Infrarød kamera
Protokollen og eksempler dokumenteret i denne rapport anvender en høj opløsning infrarødvideo radiometer. Den radiometer (figur 1) leverer en kombination af infrarøde og synlige spektrum billeder og temperaturdata. Det spektrale respons på kameraet er i området fra 7,5 til 13,5 um og giver 640 x 480 pixel opløsning. Synlige spektrum billeder genereret af den indbyggede kamera kan fusioneres med IR-billeder i realtid, hvilket letter fortolkningen af komplekse, termiske billeder. En række linser til kameraet kan bruges til at lave close-up og mikroskopiske observationer. Kameraet kan bruges i en stand-alone mode eller grænseflader og styres med en bærbar computer ved hjælp propietary software. Kan bruges softwaren til at få en bred vifte af termiske data indlejret i de optagede videoer. Det er vigtigt at bemærke, at en lang række af infrarøde radiometre er kommercielt tilgængelige. Derfor er det vigtigt, at forskeren diskutere deres påtænkte anvendelse med en kyndig produkt ingeniør og at forskeren teste evnen af enhver specific radiometer til at give de nødvendige oplysninger. Det billeddannende radiometer anvendes i den beskrevne protokol anbringes i en akryl boks (figur 2) isoleret med Styrofoam i n for at afskrække eksponering for kondensation under opvarmning og køling protokoller. Er ikke nødvendigt for alle kameraer eller programmer denne beskyttelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vand har evnen til at blive underafkølet til temperaturer et stykke under 0 ° C og den temperatur, hvor vand vil fryse kan være ganske variabel. 36. Grænsen temperatur i underafkøling af rent vand er ca. -40 ° C, og er defineret som det homogene nukleationspunkts. Når vand fryser ved temperaturer varmere end -40 ° C er det som følge af tilstedeværelsen af heterogene kimdannelsesmidler at sætte små is embryoner til at danne, der udgør en katalysator for isdannelse og vækst. 37 Der er e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af den østrigske Science Fund (FWF): P23681-B16.
Materials
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
References
- Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
- Neuner, G., Hacker, J., Lütz, C. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. , 163-174 (2012).
- Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? – Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
- Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D., Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. , 1-11 (2009).
- Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
- Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
- Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
- Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, 1031-1039 (2007).
- Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
- Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
- Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
- Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
- Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
- Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
- Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
- Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
- Ishikawa, M., Sakai, A., Li, P. H., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. , 325-340 (1982).
- Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
- Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
- Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
- Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
- Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
- Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
- Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
- Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
- Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
- Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
- Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
- Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
- Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
- Wisniewski, M., Fuller, M. P., Margesin, R., Schinner, F. . Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. , 105-118 (1999).
- Franks, F. . Biophysics and biochemistry at low temperatures. , (1985).
- Neuner, G., Kuprian, E., Hincha, D., Zuther, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. , 91-98 (2014).
