Summary
हम हड्डी वातानुकूलित मध्यम (बीसीएम) तैयार करने और इन विट्रो में अपनी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए कैसे यहाँ का वर्णन।
Abstract
ऑटोलॉगस हड्डी ग्राफ्ट व्यापक रूप से मौखिक और मैक्सिलोफैशियल सर्जरी, हड्डी रोग, और Traumatology में उपयोग किया जाता है। ऑटोलॉगस हड्डी grafts ही लापता हड्डी की जगह नहीं है, वे भी हड्डी पुनर्जनन की जटिल प्रक्रिया का समर्थन है। Autografts का यह अनुकूल व्यवहार तीन विशेषताओं के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है: osteoconductivity, osteogenicity, और osteoinductivity। बहरहाल, एक अन्य पहलू है: अस्थि हड्डी पुनर्जनन में शामिल mesenchymal कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं जो वृद्धि कारकों, सहित अणुओं के असंख्य जारी grafts। हड्डी grafts के पैराक्राइन गुण हड्डी वातानुकूलित मध्यम (बीसीएम) के उपयोग से इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है। यहाँ हम थर्मल प्रसंस्करण या विखनिजीकरण कराना पड़ा कि एक देशी सुअर cortical हड्डी से हड्डी वातानुकूलित मध्यम तैयार करने के बारे में प्रोटोकॉल, और हड्डी प्रस्तुत करते हैं। कोशिकाओं को सीधे बीसीएम के संपर्क में या ऐसे कोलेजन झिल्ली, पहले से बीसीएम से लथपथ के रूप में biomaterials, पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। हम इन विट्रो bioassa के लिए उदाहरण देTGF-β विनियमित जीनों की अभिव्यक्ति पर mesenchymal कोशिकाओं के साथ वाईएस। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आगे हड्डी उत्थान के दौरान हड्डी grafts के पैराक्राइन प्रभाव का पता चलता है और पुनर्निर्माण सर्जरी के व्यापक क्षेत्र में शोधों के लिए एक रास्ता खोलने के लिए प्रोत्साहित करना चाहिए।
Introduction
ऑटोलॉगस हड्डी व्यापक रूप से एक कुरूपता का परिणाम, resective सर्जरी, पुनर्निर्माण आघात सर्जरी, और पूर्व इम्प्लांट प्लेसमेंट 1,2 करने के लिए के रूप में हुई है कि दोषों को पाटने के लिए प्रयोग किया जाता है। हड्डी ग्राफ्ट भ्रष्टाचार के समेकन की प्रक्रिया का समर्थन कैसे की जैविक सिद्धांतों को समझने autografts पुनर्निर्माण सर्जरी में स्वर्ण मानक माना जाता है समझने के लिए क्यों केवल महत्वपूर्ण नहीं है, यह भी हड्डी के विकल्प 3 के बेहतर डिजाइन करने के लिए बायोनिक है। फिर भी, भ्रष्टाचार समेकन तेजी ऑटोलॉगस हड्डी के साथ हड्डी 4,5 विकल्प की तुलना में है। इस प्रकार, यह हड्डी पुनर्जनन समर्थन करने के लिए बहुत प्रभावी ऑटोलॉगस हड्डी बना है कि आणविक और सेलुलर तंत्र प्रकट करने के लिए आवश्यक है।
समेकन की प्रक्रिया 6,7 समर्थन करने के लिए माना जाता है कि autografts के तीन पाठ्यपुस्तक विशेषताएं हैं। सबसे पहले, ऑटोलॉगस हड्डी विकसित करने के लिए नवगठित हड्डी के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने, osteoconductive हैदोष में। दूसरे, ऑटोलॉगस हड्डी यह अस्थिकोरक 8 में अंतर कर सकते हैं कि mesenchymal कोशिकाओं में शामिल है जिसका अर्थ है कि osteogenic है। मैट्रिक्स में entombed हड्डी morphogenetic प्रोटीन की तरह वृद्धि कारकों endochondral या यहां तक कि intramembranous हड्डी गठन 9 की प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं के रूप में तीसरा, ऑटोलॉगस हड्डी osteoinductive है। एक और पहलू है: हौसले से तैयार हड्डी चिप्स "हड्डी वातानुकूलित मध्यम" 10-15 के साथ इन विट्रो टिप्पणियों पर आधारित एक पैराक्राइन समारोह का आयोजन करेगा। इसके अलावा myelopoiesis का प्रभाव 16 उल्लेख किया जाना चाहिए। "Demineralized हड्डी मैट्रिक्स वातानुकूलित मध्यम" एक समान अवधि पहले से ही विखनिजीकरण 17 से संसाधित, तब भी जब 1996 में गढ़ा और हड्डी के एक पैराक्राइन समारोह की समग्र अवधारणा का समर्थन किया गया था। हमारे उद्देश्यों के लिए, बीसीएम 10,11 mandibles ताजा सुअर से तैयार किया जा सकता है। बीसीएम की प्रोटिओमिक विश्लेषण के विकास तथ्य सहित जटिल संरचना का पता चलाअन्य रैंकों और बाह्य मैट्रिक्स 10 के घटक है, यह भी पूरी हड्डी 18,19 के Proteasome पर मौजूदा ज्ञान का विस्तार। इस प्रकार, बीसीएम इन विट्रो में हड्डी grafts के विभिन्न संशोधनों की जारी की गतिविधि को प्रतिबिंबित करना चाहिए।
Mesenchymal कोशिकाओं, उदाहरण के हड्डी चिप्स से या मौखिक नरम ऊतक से अलग उन लोगों के लिए, बीसीएम के लिए? इन विट्रो उजागर कर रहे हैं क्या होता है जब, बीसीएम osteogenic और adipogenic भेदभाव को कम कर देता है, और IL11 अभिव्यक्ति 11 की एक मजबूत वृद्धि भड़काती। जीनोम चौड़ा माइक्रोएरे विभिन्न बीसीएम के जवाब में mesenchymal कोशिकाओं में व्यक्त किया जा करने के लिए और अधिक जीन का पता चला। इन जीनों के बीच Adrenomedullin (एडीएम) कर रहे हैं, IL11, IL33, एनएडीपीएच ओक्सीडेस 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4, या lubricin) और 3 (PTX3) 15 pentraxin। Autoclaved हड्डी चिप्स से प्राप्त बीसीएम संबंधित जीन 14 की अभिव्यक्ति को बदलने में नाकाम रहे। Pasteurization कराना पड़ा और ठंड कि हड्डी चिप्स से बीसीएम करने में सक्षम थाजीन अभिव्यक्ति 14 बदल जाते हैं। Demineralized हड्डी मैट्रिक्स (डी बी-मुख्यमंत्री) के अलावा वातानुकूलित माध्यम TGF-β विनियमित जीन 20 की अभिव्यक्ति बदल जाता है। दिलचस्प है, आसपास के कोमल ऊतक 21,22 से हड्डी चिप्स ढाल करने के लिए इस्तेमाल किया कोलेजन बाधा झिल्ली, जीन अभिव्यक्ति 23 में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं कि बीसीएम के उन हिस्सों adsorbed। बीसीएम अनुसंधान के लिए कुछ नाम, जैसे हड्डी-resorbing osteoclasts और endothelial कोशिकाओं के रूप में हड्डी पुनर्जनन में शामिल अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है। कुल मिलाकर, जमते इन विट्रो डेटा एक पूर्व नैदानिक अध्ययन के डिजाइन के लिए वैज्ञानिक आधार प्रदान करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो गुना है: सबसे पहले, यह बीसीएम तैयार करने के लिए कैसे पता चलता है। दूसरे, यह इन विट्रो में mesenchymal कोशिकाओं के आधार पर अपने जैविक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए दिखाता है।
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Protocol
1. बीसीएम तैयारी
- संभव के रूप में के रूप में ताजा स्थानीय कसाई से सुअर mandibles प्राप्त करते हैं। एक फर्म की सतह पर mandibles प्लेस और एक पूर्ण मोटाई फ्लैप किसी भी नरम ऊतक छोड़ने के लिए या हड्डी से जुड़ी periosteum के लिए नहीं विशेष ध्यान दे छोड़ें। प्रवाह हुड के तहत काम करने के लिए आवश्यकता के बिना एक स्वच्छ वातावरण में काम।
- एक पूर्ण मोटाई फ्लैप जारी की है एक बार, मुख की ओर से हड्डी चिप्स फसल के लिए एक हड्डी खुरचनी का उपयोग करें। हड्डी खुरचनी तेज हो गया है कि कृपया ध्यान दें। मजबूती से हड्डी खुरचनी संभाल और लंबे आंदोलनों हड्डी इकट्ठा साथ। छोटे कि 1mm हड्डी चिप्स त्यागें।
- देशी हड्डी चिप्स बनाए रखने के लिए, 1% एंटीबायोटिक दवाओं और उन्हें बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं antimycotics के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 10cm व्यास के प्लास्टिक के बर्तन में सीधे हड्डी चिप्स जगह है।
- थर्मल प्रसंस्करण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विषय हड्डी चिप्स 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए pasteurization करने के लिए या121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव।
- , विखनिजीकरण के प्रभाव का मूल्यांकन 4 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए 1 एम एचसीएल में हड्डी चिप्स मिलाने और पीएच तटस्थ है जब तक संस्कृति के माध्यम से बार-बार धोने के लिए।
- एक नया प्लास्टिक डिश में 1% एंटीबायोटिक दवाओं और antimycotics के साथ पूरक 10 मिलीलीटर ताजा DMEM प्रति हड्डी चिप्स के 5 ग्राम की कुल रखें।
- 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में प्लास्टिक के बर्तन रखें। फिर, फसल बीसीएम। अपकेंद्रित्र, मलबे को हटाने यह बाँझ (0.2 एनएम) फिल्टर, और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए aliquots रखने के लिए 10 मिनट के लिए 200 XG पर बीसीएम।
- तुरंत उपयोग करने से पहले बीसीएम शेयर गला लें और ठंड और विगलन के दोहराया चक्र से बचें।
- संकेत दिया प्रयोगों के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए बीसीएम या सीरम मुक्त माध्यम से कोलेजन झिल्ली लेना। पीबीएस के साथ सख्ती झिल्ली धो लें और 96 अच्छी तरह प्लेटों में उन्हें जगह है। गीले झिल्ली कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं।
- बीसीएम तैयार करने की प्रक्रिया चित्रा 1 में संक्षेप।
Mesenchymal कोशिकाओं के आधार पर 2. bioassays
- / 2 सेमी 30,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली में (उदाहरण के अस्थि कोशिकाओं, मसूड़ों और periodontal बंधन fibroblasts के लिए) बीज मानव mesenchymal कोशिकाओं। कोशिकाओं DMEM के मिलकर विकास मध्यम, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग बीज के लिए। कोशिकाओं थाली हे / एन करने के लिए देते हैं।
- संस्कृति के माध्यम से त्यागें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। साथ और 20% बीसीएम बिना पूर्व गर्म सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम से जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में कोशिकाओं की जगह।
- , संस्कृति के माध्यम त्यागें पूर्व गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला और अपनी पसंद के प्रोटोकॉल के अनुसार शाही सेना निकालें।
- प्रत्येक नमूने में शाही सेना के एक ही राशि के क्रम में शाही सेना की एकाग्रता को समायोजित करें। CDNAs को तैयार है और तालिका 1 में दिखाया गया प्राइमरों का उपयोग चयनित जीन का विश्लेषण करने के लिए एक QRT- पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
नोट: ये हर घटक की dilutions कर रहे हैं: 2x SYBR ग्रीन, 20x प्राइमर आगे, 20x प्राइमर रिवर्स, 5x बाँझ डीडी पानी, 5x सीडीएनए। QRT- पीसीआर 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड के 40 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट में किया जाता है। - सीटी GAPDH और Δ (ΔCT) ΔCT प्रेरित है - - ΔCT नियंत्रण ΔCT सीटी लक्ष्य है जहां Δ (ΔCt) पद्धति का उपयोग करके गृह व्यवस्था जीन GAPDH के लिए सामान्य से रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की गणना।
- इस गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, mesenchymal कोशिकाओं, hematopoietic कोशिकाओं या endothelial कोशिकाओं सहित कोशिकाओं के सभी प्रकार प्रोत्साहित करने के लिए संस्कृति के माध्यम से बीसीएम जोड़ें।
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Representative Results
अस्थि वातानुकूलित माध्यम ताजा सुअर का हड्डी चिप्स से तैयार किया जाता है। प्रक्रिया की सामान्य अवलोकन बीसीएम तैयार करने के लिए और बीसीएम के साथ संयोजन में biomaterials के उपयोग करने के लिए चित्रा 1 और क्रमशः चित्रा 2 में दिखाया गया है। बीसीएम तैयारी के दौरान, यह अंतिम बीसीएम की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं कम आंदोलनों या बहुत छोटी हड्डी चिप्स के रूप में लंबे समय के आंदोलनों के साथ बड़े हड्डी चिप्स प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एडीएम, PTX3, IL11, IL33, NOX4 और PRG4 (चित्रा 3): बीसीएम की गुणवत्ता बीसीएम लक्ष्य जीन के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके नियंत्रित किया जा सकता है। एडीएम और PTX3 0.4 गुना करने के लिए नीचे नीचे विनियमित कर रहे हैं और 200 गुना तक नियंत्रित अप-IL11, IL33, NOX4 और PRG4 हो सकता है। मौखिक fibroblasts दिखाया स्तर पर बीसीएम लक्ष्य जीन व्यक्त नहीं करते हैं, कोशिकाओं के स्वास्थ्य की जाँच करें या नया mandibles से नए बीसीएम तैयार करते हैं। एक कोलेजन बाधा झिल्ली पर वरीयता प्राप्त मौखिक fibroblasts में बीसीएम लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति से 4 दिखाता ठेठ परिणाम चित्रा। ओरल fibroblasts के pasteurized हड्डी चिप्स से वातानुकूलित मध्यम और Demineralized हड्डी चिप्स से वातानुकूलित माध्यम के 20% के साथ प्रेरित, बीसीएम (तालिका 2 और 3 टेबल) के साथ प्रेरित कोशिकाओं के समान जीन अभिव्यक्ति दिखाया। हालांकि, मौखिक fibroblasts की जीन अभिव्यक्ति निष्फल (121 डिग्री सेल्सियस) हड्डी चिप्स से वातानुकूलित माध्यम से अवगत कराया, संयुक्त राष्ट्र प्रेरित नियंत्रण करने के लिए बराबर था।
चित्रा 1. ताजा सुअर mandibles से हड्डी वातानुकूलित मध्यम तैयार करने के लिए इस्तेमाल की प्रक्रिया का सारांश। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. सारांशबीसीएम साथ mesenchymal कोशिकाओं पर आधारित bioassays की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मौखिक fibroblasts में हड्डी वातानुकूलित मध्यम लक्ष्य जीन 3. जीन अभिव्यक्ति चित्रा। बीसीएम। जीन एडीएम और PTX3 की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता छह जीनों की विशिष्ट परिणामों downregulated कर रहे हैं (ए) और IL11, IL33, NOX4, PRG4 (बी) upregulated कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. हड्डी-conditione के जीन की अभिव्यक्तिएक कोलेजन बाधा झिल्ली पर वरीयता प्राप्त मौखिक fibroblasts में डी मध्यम लक्ष्य जीन। बीसीएम की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता छह जीनों की विशिष्ट परिणाम है। जीन एडीएम और PTX3 downregulated कर रहे हैं (ए) और IL11, NOX4, PRG4 (बी) upregulated कर रहे हैं। इस्तेमाल किया biomaterial पर निर्भर करता है, वृद्धि कारकों के अवशोषण को अलग कर सकते हैं। कोलेजन झिल्ली इसलिए IL33 अभिव्यक्ति इस सेटिंग में विनियमित नहीं है IL33 अभिव्यक्ति, कि नियंत्रण कारकों को अवशोषित करने में विफल रहा है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| संक्षिप्त | प्राइमर आगे | प्राइमर रिवर्स |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| एडीएम | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
तालिका 1: प्रयोग किया जाता 6 जीन की प्राइमर अनुक्रम।
| जीन | 80 डिग्री सेल्सियस मीन ± एसडी | 121 डिग्री सेल्सियस मीन ± एसडी |
| एडीएम | 0.2 ± 0.1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0.1 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
तालिका 2: एडीएम, PTX3, IL11, IL33, गर्मी का इलाज हड्डी चिप्स से वातानुकूलित माध्यम के 20% के साथ प्रेरित मौखिक fibroblasts में NOX4 और PRG4 की विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति।
| जीन | ± एसडी मीन |
| एडीएम | 0.1 ± 0.1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
तालिका 3: एडीएम, PTX3, IL11, IL33, Demineralized हड्डी चिप्स से वातानुकूलित माध्यम के 20% के साथ प्रेरित मौखिक fibroblasts में NOX4 और PRG4 की विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति।
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Discussion
अस्थि-वातानुकूलित माध्यम हड्डी उत्थान के प्रारंभिक दौर के दौरान हड्डी ग्राफ्ट की जारी की गतिविधि को दर्शाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हड्डी पुनर्जनन में शामिल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल संसाधित हड्डी या हड्डी का fillers से वातानुकूलित माध्यम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विभिन्न देशी और प्रसंस्कृत हड्डी से रिहा कारक: विधियों प्रदर्शन और एक सरल अवधारणा पर भरोसा करने के लिए आसान कर रहे हैं। कैसे बीसीएम को समझना mesenchymal कोशिकाओं भ्रष्टाचार के समेकन और हड्डी autografts के गुणों के बारे में अधिक जानने के लिए मदद कर सकते हैं प्रभावित करता है। हम भी है लेकिन तीन मुख्य प्रजातियों में प्रसार, प्रवास, और भेदभाव पर, mesenchymal कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति पर 11,15 देशी और प्रसंस्कृत हड्डी 14,20 से प्राप्त बीसीएम के प्रभाव पर ज्ञान जमा है इस अवधारणा के आधार पर; अस्थिकोरक, adipocytes और chondrocytes 11। बीसीएम भी टा करने के लिए अपनी क्षमता के लिए जांच की गई थीosteoclastogenesis 13 के मॉडुलन के लिए सम्मान के साथ उदाहरण के लिए hematopoietic कोशिकाओं, rget। कई संभावित लक्ष्य कोशिकाओं इन विट्रो में बीसीएम करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए इंतजार कर रहे हैं, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल, इस शोध के लिए एक किताब के रूप में सेवा कर सकते हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी आगे बीसीएम mesenchymal कोशिकाओं में विशेष रूप से TGF-β विनियमित जीनों को सक्रिय करता है कि कैसे की आणविक तंत्र प्रकट करने के लिए चेतन चाहिए। उदाहरण के लिए, मैं SB431542 प्रतिपक्षी TGF-β रिसेप्टर जीन पैनल एडीएम की अभिव्यक्ति पर बीसीएम के प्रभाव को अवरुद्ध, आईएल 11, NOX4, PRG4, और PTX3 11,15। दिलचस्प बात यह है alkaline फॉस्फेट और IL33 अन्य के रूप में अभी तक अज्ञात रास्ते बीसीएम द्वारा विनियमित रहे हैं सुझाव है कि SB431542 11,15 से उलट नहीं कर रहे थे। एक और खुला प्रश्न बीसीएम में अणुओं सेलुलर प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार जा रहा है कर रहे हैं क्या है? बीसीएम TGF-β हैं लेकिन जटिल सेलुलर प्रतिक्रियाओं 10,11 व्याख्या नहीं करता है। में इसके अलावासेलुलर पहलुओं इन विट्रो, समग्र सवाल है: जो करने के लिए हड्डी के उत्थान के vivo प्रक्रिया पर प्रभाव पड़ता है, बीसीएम से परिलक्षित के रूप में हड्डी ग्राफ्ट की जारी की गतिविधि करता है विस्तार? bioassays से प्रोटोकॉल और डेटा इस दिशा में अनुसंधान का परिचय देना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल सीमाएँ हैं। बीसीएम पूरी तरह क्योंकि दाताओं और संचयन तकनीक के बीच की विविधताओं का मानकीकरण नहीं किया जा सकता। इसके अलावा, विवो में मौजूद एंजाइमों संरचना या बीसीएम की गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे अनजान बनी हुई है। भविष्य के अध्ययन, उदाहरण के लिए, संचयन तकनीक बीसीएम की "जैविक गतिविधि" कैसे प्रभावित पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। बीसीएम की संरचना पर osteocytes की भूमिका भी विस्तार से अध्ययन किया जाना चाहिए। बीसीएम sclerostin, osteocytes 12 से लगभग विशेष रूप से जारी एक अणु होते हैं। सीमाओं, हालांकि, अनुसंधान के क्षेत्र में अगले कदम के लिए प्रेरणा प्रदान करते हैं। यहां तक कि अरब घन मीटर के साथ अनुसंधान के नैदानिक प्रासंगिकता हरियाणा बनी हुई है, हालांकिpothetical, हमारे प्रोटोकॉल हड्डी grafts, देशी या प्रसंस्करण के बाद, या तो एक "जैविक गतिविधि" रिलीज है कि लंबे समय से चली आ रही इस अवधारणा का समर्थन है। इन विट्रो में कोशिकाओं को प्रभावित बीसीएम समझौता कैसे मुमकिन है हड्डी autografts विवो में काम करेंगे समझने के लिए कैसे मदद कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है। जोर्डी Caballé-सेरानो चिकित्सकीय अनुसंधान और शिक्षा, बेसल, स्विट्जरलैंड के फाउंडेशन से एक छात्रवृत्ति प्राप्त की।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
