Summary
Vi beskriver här hur man förbereder ben konditionerat medium (BCM) och testa dess aktivitet in vitro.
Abstract
Autolog bentransplantat används ofta i muntlig och käkkirurgi, ortopedi och traumatologi. Autolog bentransplantat inte bara ersätta saknade ben, de stöder också den komplexa processen för benuppbyggnad. Denna positiva beteendet hos autotillskrivs de tre egenskaper: osteokonduktivitet, osteogenicity och osteoinduktivitet. Det finns emellertid en annan aspekt: bone grafts släppa en myriad av molekyler, inklusive tillväxtfaktorer, vilka kan rikta mesenkymala celler som är involverade i benåterbildning. De parakrina egenskaper bentransplantat kan studeras in vitro genom användning av ben-konditionerat medium (BCM). Här presenterar vi ett protokoll om hur man förbereder ben konditionerat medium från inhemska gris kortikalt ben och ben som genomgick värmebehandling eller demineralisering. Celler kan direkt utsättas för BCM eller ympas på biomaterial, såsom kollagenmembran, tidigare indränkt med BCM. Vi ger exempel på in vitro bioassays med mesenkymala celler på uttrycket av TGF-β-reglerade gener. De presenterade protokoll bör uppmuntra till ytterligare avslöja parakrina effekterna av bentransplantat under benuppbyggnad och öppna en väg för translationell forskning inom det breda området rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Autolog ben används ofta för att överbrygga brister som uppstått till följd av missbildning, resektiv kirurgi, rekonstruktiv traumakirurgi, och innan implantatet 1,2. Förstå de biologiska principerna för hur benimplantat stödja konsolideringsprocessen transplantat är inte bara nyckeln till att förstå varför auto anses vara guldmyntfoten i rekonstruktiv kirurgi, är det också bionic för förbättrad utformning av bensubstitut 3. Ändå är konsolidering transplantat snabbare med autolog ben jämfört med ben ersätter 4,5. Sålunda är det absolut nödvändigt att avslöja de molekylära och cellulära mekanismer som gör autologt ben så effektiv för att stödja benregenerering.
Det finns tre lärobok egenskaper hos auto som anses stödja konsolideringsprocessen 6,7. Först autolog ben är osteokonduktivt, ge vägledning för det nybildade benet att växai defekten. För det andra är autologt ben osteogen, vilket betyder att det innehåller mesenkymala celler som kan differentiera till osteoblaster 8. Tredje, autolog ben är osteoinduktiv som tillväxtfaktorer som benmorfogenetiska proteiner entombed i matrisen kan inleda processen av endokondral eller ens intramembranös benbildning 9. Det finns en annan aspekt: nylagade benbitar hålla en parakrin funktion baserad på observationer in vitro med "ben konditionerat medium" 10-15. Även effekterna av myelopoes bör nämnas 16. En liknande termen "demineraliserat benmatris-konditionerat medium" var redan myntades 1996 och stöder det övergripande konceptet av en parakrin funktion av ben, även när de behandlas av demineralisering 17. För våra syften, kan BCM framställas av färsk svin mandibles 10,11. Proteomik analyser av BCM avslöjade komplex sammansättning, inklusive tillväxt faktumyttersta randområdena och beståndsdelar i den extracellulära matrisen 10, som sträcker sig även befintlig kunskap om proteasomet av hela ben 18,19. Sålunda bör BCM spegla den frisatta aktiviteten av olika modifikationer av bentransplantat in vitro.
Vad händer när mesenkymala celler, till exempel sådana som isolerats från benbitar eller från oral mjukvävnad, utsätts för BCM? In vitro minskar BCM osteogen och adipogena differentiering, och framkallar en kraftig ökning av IL11 uttryck 11. Genome breda mikromatris avslöjade flera gener som skall differentiellt uttryckt i mesenkymala celler som svar på BCM. Bland dessa gener är adrenomeduUin (ADM), IL11, IL33, NADPH-oxidas 4 (NOX4), proteoglykan 4 (PRG4 eller lubricin) och pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM erhållits från autoklave benbitar inte ändra uttrycket av respektive gener 14. BCM från benbitar som genomgick pastörisering och frysning kundeändra genexpression 14. Också konditionerat medium av demineraliserat benmatris (DBM-CM) ändrar expressionen av TGF-β-reglerade gener 20. Intressant, kollagenbarriärmembran som används för att skydda de benbitar från den omgivande mjuka vävnaden 21,22, adsorberat de delar av BCM som är ansvariga för de förändringar i genuttryck 23. BCM forskning kan utvidgas till andra celltyper som är involverade i benuppbyggnad såsom benresorberande osteoklaster och endotelceller, för att nämna några. Sammantaget ackumulerande in vitro-data ger en vetenskaplig grund för utformningen av en preklinisk studie.
Den nuvarande protokollet är tvåfaldigt: För det första visar det hur man förbereder BCM. För det andra visar det hur man testar sin biologiska aktivitet baserad på mesenkymala celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BCM Framställning
- Skaffa gris mandibles från den lokala slaktaren så färsk som möjligt. Placera mandibles till fast underlag och släppa en full tjocklek klaff särskild uppmärksamhet att inte lämna någon mjuk vävnad eller periosthärstammande fäst vid benet. Arbeta i en ren miljö utan att behöva arbeta under flöde huva.
- När en full tjocklek flik släpps, använder ett ben skrapa för att skörda benbitar från den buckala sidan. Observera att benet skrapan måste vara skarp. Handtag fast benet skrapan och med långa rörelser samlar benet. Kasta benbitar mindre att 1 mm.
- För att upprätthålla inhemska benbitar, placera direkt de benbitar i plastskålar med 10 cm diameter med Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 1% antibiotika och antimykotika inte låta dem torka ut.
- För att utvärdera effekten av termisk behandling, att ämnes benflisor pastörisering under 30 min vid 80 ° C ellerautoklav under 20 minuter vid 121 ° C.
- För att utvärdera effekterna av avsaltning, skaka benbitar i 1 M HCL för 4-6 timmar vid 4 ° C och tvätta upprepade gånger med odlingsmedium tills pH är neutralt.
- Placera en totalt 5 g benbitar per 10 ml färsk DMEM kompletterat med 1% antibiotika och antimykotika i en ny plastskål.
- Placera plastskålar i en fuktad atmosfär vid 37 ° C under 24 h. Därefter, skörd BCM. Centrifugera BCM vid 200 xg under 10 minuter för att avlägsna skräp, filtrera det steril (0,2 nm), och hålla alikvoter frystes vid -80 ° C.
- Tina BCM lager omedelbart före användning och undvika upprepade cykler av frysning och upptining.
- För angivna experiment, blöt kollagenmembran med BCM eller serumfritt medium under en timme vid RT. Tvätta kraftfullt membranen med PBS och placera dem i 96-hålsplattor. Våta membran ympas med celler.
- BCM beredningsprocessen sammanfattas i figur 1.
2. Bioanalyser Baserat på mesenkymala celler
- Seed humana mesenkymala celler (exempelvis benceller, gingivala och parodontala ligament fibroblaster) i en 12-brunnsplatta med en koncentration på 30.000 celler / cm 2. Att ympa cellerna använda tillväxtmedium bestående av DMEM, 10% fetalt kalvserum och antibiotika. Låt cellerna fäster till plattan O / N.
- Kassera odlingsmediet och tvätta cellerna med förvärmda PBS vid 37 ° C. Stimulera cellerna genom tillsats av förvärmda serumfritt odlingsmedium med och utan 20% BCM. Placera cellerna i en fuktad atmosfär vid 37 ° C under 24 h.
- Kasta odlingsmediet, skölj cellerna med förvärmda PBS och extrahera RNA enligt önskat protokoll.
- Justera koncentrationen av RNA i syfte att ha samma mängd av RNA i varje prov. Förbered cDNA och utföra en QRT-PCR för att analysera de utvalda generna med användning av de primrar som visas i tabell 1.
OBS: Detta är utspädningar av varje komponent: 2x SYBR Green, 20x primer framåt, 20x primer bakåt, 5x sterilt DD vatten, 5x cDNA. Den QRT-PCR utförs i 40 cykler av 95 ° C 15 sek och 60 ° C 1 minut. - Beräkna den relativa expressionsnivåerna genom att normalisera hushållning genen GAPDH använder Δ (ΔCt) metod där ΔCT är CT mål - CT GAPDH och Δ (ΔCT) är ΔCT stimulerat - ΔCT kontroll.
- Efter denna kvalitetskontroll, lägga BCM till odlingsmedium för att stimulera alla typer av celler, inklusive mesenkymala celler, hematopoetiska celler eller endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bone medium framställs från färska svin benbitar. Allmän översikt av processen för framställning av BCM och att använda biomaterial i kombination med BCM visas i figur 1 och figur 2 respektive. Under BCM förberedelser, är det viktigt att få stora benbitar med långa rörelser som korta rörelser eller mycket små benbitar kan påverka kvaliteten på slut BCM. Kvalitet på BCM kan kontrolleras genom att analysera genuttrycket av BCM målgener: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 och PRG4 (Figur 3). ADM och PTX3 är nedregleras ner till 0,4 gånger och IL11, IL33, NOX4 och PRG4 kan vara upp-regleras till 200-faldigt. Om orala fibroblaster inte uttrycker BCM målgener på den nivå som visas, kontrollera hälsan hos cellerna eller förbereda ny BCM från nya mandibles. Figur 4 visar typiska resultat från uttrycket av BCM målgener i orala fibroblaster ympade på en kollagenbarriärmembran. Orala fibroblaster stimulerade med 20% av konditionerat medium från pastöriserad benchips och konditionerat medium från avmineraliserade benflisor, uppvisade liknande genexpression till celler stimulerade med BCM (tabell 2 och tabell 3). Emellertid genuttryck av orala fibroblaster exponerade för konditionerat medium från steriliserade (121 ° C) benchips, var jämförbar med un-stimulerade kontroller.
Figur 1. Sammanfattning av den process som används för att framställa ben konditionerat medium från färska gris mandibles. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sammanfattningav bioanalyser baserat på mesenkymala celler med BCM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Gene expression av ben konditionerat medium målgener i orala fibroblaster. Typiska resultat av sex gener som används för att kontrollera kvaliteten på BCM. Gener ADM och PTX3 är nedregleras (A) och IL11, IL33, NOX4, PRG4 uppregleras (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Genuttryck av ben-conditioned medel målgener i orala fibroblaster ympade på en kollagenbarriärmembran. Typiska resultat av sex gener som används för att kontrollera kvaliteten på BCM. Gener ADM och PTX3 är nedregleras (A) och IL11, NOX4, PRG4 uppregleras (B). Beroende på biomaterialet används kan absorptionen av tillväxtfaktorer skiljer sig åt. Kollagenmembran misslyckats att absorbera faktorer som styr IL33 uttryck, därför IL33 uttryck inte är reglerat i den här inställningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förkortning | Primer framåt | Primer omvänt |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabell 1: Primer sekvensen för de sex gener som används.
| Gener | 80 ° C Medelvärde ± SD | 121 ° C Medelvärde ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tabell 2: Typisk genuttryck av ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 och PRG4 i orala fibroblaster stimulerade med 20% av konditionerat medium från värmebehandlade benbitar.
| Gener | Medelvärde ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabell 3: Typisk genuttryck av ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 och PRG4 i orala fibroblaster stimulerade med 20% av konditionerat medium från avmineraliserade benbitar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone-konditionerat medium speglar släppt aktivitet bentransplantat under de tidiga stadierna av benuppbyggnad. Protokollet som beskrivs här kan anpassas för att studera svaret hos olika typer av celler som är involverade i benåterbildning. Vidare kan protokollet användas för att framställa konditionerat medium från bearbetade ben- eller skelettfyllmedel. Metoderna är lätta att utföra och förlita sig på ett enkelt koncept: de faktorer som frigörs från olika inhemska och bearbetat ben. Att förstå hur BCM påverkar mesenkymala celler kan bidra till att lära sig mer om transplantat konsolidering och egenskaperna hos ben auto. Baserat på detta koncept har vi samlat kunskap om effekterna av BCM erhållits från infödda 11,15 och behandlas ben 14,20 på genuttryck av mesenkymala celler, utan även på spridning, migration och differentiering i de tre viktigaste linjerna; osteoblaster, adipocyter och kondrocyter 11. BCM undersöktes också för sin förmåga att target hematopoietiska celler, exempelvis med avseende på modulering av osteoklastogenes 13. Många potentiella målceller väntar på att svara på BCM in vitro, kan de protokoll som presenteras här, tjäna som en primer för denna forskning.
De presenterade protokoll bör också animera att ytterligare avslöja de molekylära mekanismerna för hur BCM aktiverar särskilt TGF-β-reglerade gener i mesenkymala celler. Exempelvis TGF-β-receptorn jag antagonist SB431542 blockerade effekten av BCM på expressionen av genen panelens ADM, IL-11, NOX4, PRG4 och PTX3 11,15. Intressant nog var alkaliskt fosfatas och IL33 återförs inte av SB431542 11,15 vilket tyder på att andra ännu okända vägar regleras av BCM. En annan öppen fråga är vad är molekylerna i BCM är ansvarig för den cellulära responsen? BCM innehåller TGF-β men är inte förklara komplexa cellulära reaktioner 10,11. Förutom ivitro cellulära aspekter, förblir den övergripande frågan: som sträcker gör släppt aktivitet bentransplantat som reflekteras av BCM, har en effekt på in vivo-processen för benuppbyggnad? Protokollen och data från bioanalyser bör införa forskning i denna riktning.
Detta protokoll har begränsningar. BCM inte helt standardiserade på grund av variationer mellan givare och skördeteknik. Dessutom, hur enzymer som är närvarande in vivo kan inverka på sammansättningen eller aktiviteten hos BCM förblir okänd. Framtida studier bör till exempel fokusera på hur skördeteknik påverkar "biologisk aktivitet" av BCM. Bör också studeras roll osteocyter om sammansättningen av BCM i detalj. BCM innehåller sclerostin, en molekyl släpptes nästan uteslutande av osteocyter 12. Begränsningar dock ge inspiration till nästa steg i forskningen. Även om den kliniska relevansen av forskning med BCM förblir hypothetical våra protokoll stöder den långvariga koncept som bentransplantat, antingen nativt eller efter bearbetning, släppa en "biologisk aktivitet". Att förstå hur BCM påverkar celler in vitro kan antagligen bidra till att förstå hur ben auto fungerar in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut. Jordi Caballé-Serrano fått ett stipendium från Stiftelsen för Dental forskning och utbildning, Basel, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
