Summary
Descriviamo qui come preparare a medio-bone condizionata (BCM) e testare la sua attività in vitro.
Abstract
Innesti ossei autologhi sono ampiamente utilizzati in chirurgia orale e maxillofacciale, ortopedia, traumatologia e. Innesti ossei autologhi non solo sostituire l'osso mancante, ma anche sostenere il complesso processo di rigenerazione ossea. Questo comportamento favorevole autoinnesti è attribuita a tre caratteristiche: osteoconduttività, osteogenicity e osteoinduttività. Tuttavia, c'è un altro aspetto: Bone Innesti rilasciare una miriade di molecole, tra cui i fattori di crescita, che può indirizzare le cellule mesenchimali coinvolte nella rigenerazione ossea. Le proprietà paracrini di innesti ossei possono essere studiati in vitro con l'uso del mezzo-bone condizionata (BCM). Qui vi presentiamo un protocollo su come preparare medie osso condizionata da nativo corticale maiale osso, e l'osso che ha subito trattamenti termici o demineralizzazione. Le celle possono essere direttamente esposti alla BCM o seminate su biomateriali, come membrane di collagene, precedentemente ammollati con BCM. Noi diamo esempi in vitro bioassays con cellule mesenchimali sull'espressione di TGF-β geni regolati. I protocolli presentati dovrebbero incoraggiare a rivelare ulteriormente gli effetti paracrini di innesti ossei durante la rigenerazione ossea e aprire un percorso per la ricerca traslazionale nel vasto campo della chirurgia ricostruttiva.
Introduction
Osso autologo è ampiamente utilizzato per colmare difetti che si sono verificati in conseguenza di malformazioni, resezione chirurgica, chirurgia ricostruttiva trauma, e prima dell'impianto posizionamento 1,2. Comprendere i principi biologici di come innesti ossei sostenere il processo di consolidamento del trapianto non è solo la chiave per capire il motivo per cui autologhi sono considerati il gold standard in chirurgia ricostruttiva, è anche bionico per la migliore progettazione di sostituti ossei 3. Eppure, il consolidamento del trapianto è più veloce con osso autologo rispetto alle sostituti ossei 4,5. Pertanto, è imperativo rivelare i meccanismi cellulari e molecolari che rendono osso autologo in modo efficace per sostenere la rigenerazione ossea.
Tre sono le caratteristiche da manuale di autoinnesti che sono considerati a sostenere il processo di consolidamento 6,7. In primo luogo, osso autologo è osteoconduttivo, fornendo una guida per l'osso neoformato di crescerenel difetto. In secondo luogo, osso autologo è osteogenico, il che significa che contiene cellule mesenchimali che possono differenziarsi in osteoblasti 8. In terzo luogo, osso autologo è osteoinduttiva come fattori di crescita come le proteine morfogenetiche ossee sepolti nella matrice possono avviare il processo di endocondrale o addirittura la formazione di osso intramembranosa 9. C'è un altro aspetto: frammenti ossei preparati al momento in possesso di una funzione paracrina sulla base delle osservazioni in vitro con "medio-bone condizionata" 10-15. Inoltre l'impatto di mielopoiesi va detto 16. Un termine simile "medio-matrice ossea demineralizzata condizionata" è già coniato nel 1996 e sostiene il concetto generale di una funzione paracrina di osso, anche se elaborati da demineralizzazione 17. Per i nostri scopi, BCM può essere preparato da maiale fresca mandibole 10,11. Analisi proteomica di BCM ha rivelato la composizione complessa, tra cui effetti di crescitaors e componenti della matrice extracellulare 10, estendendo anche la conoscenza esistente sulla proteasoma di osso intero 18,19. Così, BCM dovrebbe riflettere l'attività rilasciata di varie modifiche di innesti ossei in vitro.
Cosa accade quando le cellule mesenchimali, per esempio quelli isolati da frammenti ossei o da tessuto molle orale, sono esposti a BCM? In vitro, BCM riduce osteogenico e differenziazione adipogenico, e provoca un forte aumento di espressione IL11 11. Genomica microarray rivelato più geni da esprimere differenziale in cellule mesenchimali in risposta a BCM. Tra questi geni sono adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH ossidasi 4 (NOX4), proteoglicani 4 (PRG4, o lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM ottenuto da frammenti ossei autoclave riuscito a cambiare l'espressione dei rispettivi geni 14. BCM da frammenti ossei sottoposti a pastorizzazione e di congelamento è stato in grado dimodificare l'espressione genica 14. Mezzo anche condizionata di matrice ossea demineralizzata (DBM-CM) cambia l'espressione di TGF-β-regolati geni 20. È interessante notare che, membrane barriera di collagene usato per schermare i frammenti ossei dal tessuto molle circostante 21,22, assorbiti dalle parti del BCM che sono responsabili per i cambiamenti nell'espressione genica 23. Ricerca BCM può essere estesa ad altri tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea come osteoclasti riassorbono l'osso e le cellule endoteliali, per citarne alcuni. Nel complesso, i dati di accumulo in vitro forniscono la base scientifica per la progettazione di uno studio preclinico.
Il presente protocollo è duplice: in primo luogo, si mostra come preparare BCM. In secondo luogo, mostra come testare la sua attività biologica a base di cellule mesenchimali in vitro.
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Protocol
1. BCM Preparazione
- Ottenere mandibole maiale dal macellaio locale più fresco possibile. Mettere le mandibole su una superficie stabile e rilasciare un lembo a spessore completo con particolare attenzione a non lasciare alcuna tessuti molli o periostio attaccato all'osso. Lavorare in un ambiente pulito senza la necessità di lavorare sotto cappa a flusso.
- Una volta che un lembo a spessore completo viene rilasciato, utilizzare un raschietto osso per raccogliere i frammenti ossei dal lato vestibolare. Si prega di notare che il raschietto osso deve essere forte. Maneggiare con forza il raschietto osso e con lunghi movimenti raccogliere l'osso. Eliminare frammenti ossei più piccoli che 1 mm.
- Per mantenere frammenti ossei nativi, inserire direttamente i frammenti ossei in piatti di plastica di 10cm di diametro medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 1% antibiotici e antimicotici, non consentendo loro di asciugarsi.
- Per valutare l'impatto di trattamento termico, frammenti ossei soggette alla pastorizzazione per 30 minuti a 80 ° C oautoclave per 20 minuti a 121 ° C.
- Per valutare l'impatto di demineralizzazione, agitare frammenti ossei in 1 M HCl per 4-6 ore a 4 ° C e lavare ripetutamente con terreno di coltura fino a pH neutro.
- Inserire un totale di 5 g di schegge ossee per 10 ml DMEM fresco supplementato con 1% di antibiotici e antimicotici in un nuovo piatto di plastica.
- Porre le capsule in plastica in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore. Poi, vendemmia BCM. Centrifugare il BCM a 200 g per 10 minuti per rimuovere i detriti, filtrarlo sterile (0,2 nm), e mantenere aliquote congelate a -80 ° C.
- Scongelare il BCM azione immediatamente prima dell'uso ed evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
- Per gli esperimenti indicati, immergere membrane di collagene con terreno BCM o privo di siero per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare vigorosamente le membrane con PBS e metterli in piastre da 96 pozzetti. Le membrane Wet sono seminati con le cellule.
- Processo di preparazione BCM è riassunto in Figura 1.
2. Bioassays Sulla base di cellule mesenchimali
- Cellule mesenchimali umane seme (per esempio cellule ossee, gengivale e fibroblasti legamento periodontale) in un 12-pozzetti con una concentrazione di 30.000 cellule / cm 2. Per seminare le cellule utilizzano terreno di coltura costituito da DMEM, siero fetale bovino al 10% e antibiotici. Lasciate che le cellule si attaccano alla piastra O / N.
- Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Stimolare le cellule aggiungendo pre-riscaldato terreno privo di siero coltura con e senza il 20% BCM. Collocare le celle in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore.
- Eliminare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldata ed estrarre l'RNA secondo il vostro protocollo preferito.
- Regolare la concentrazione di RNA in modo da avere la stessa quantità di RNA in ciascun campione. Preparare cDNA ed eseguire una qRT-PCR per analizzare i geni selezionati utilizzando i primers riportati in Tabella 1.
NOTA: Queste sono le diluizioni di ogni componente: 2x SYBR verdi, 20x primer forward, 20x primer reverse, 5x acqua DD sterile, 5x cDNA. Il qRT-PCR viene eseguita in 40 cicli di 95 ° C 15 sec e 60 ° C 1 min. - Calcolare i livelli di espressione relativi normalizzando al gene housekeeping GAPDH utilizzando il metodo Δ (ΔCt) dove ΔCT è bersaglio CT - CT GAPDH e Δ (ΔCT) è ΔCT stimolata - ΔCT controllo.
- Dopo questo controllo di qualità, aggiungere BCM al terreno di coltura per stimolare tutti i tipi di cellule, incluse le cellule mesenchimali, cellule ematopoietiche o cellule endoteliali.
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Representative Results
Bone media condizionata è preparato da freschi frammenti ossei suina. Panoramica generale del processo per preparare BCM e utilizzare biomateriali in combinazione con BCM è mostrato in Figura 1 e Figura 2 rispettivamente. Durante la preparazione BCM, è importante ottenere grandi frammenti ossei con movimenti lunghi come brevi movimenti o molto piccoli frammenti ossei può influenzare la qualità del BCM finale. Qualità di BCM può essere controllata analizzando l'espressione genica di geni bersaglio BCM: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 e PRG4 (Figura 3). ADM e PTX3 sono down-regolati fino a 0,4 volte e IL11, IL33, NOX4 e PRG4 possono essere up-regolata a 200 volte. Se fibroblasti orali non esprimono geni bersaglio BCM al livello indicato, controllare la salute delle cellule o preparare nuovo BCM dalle nuove mandibole. Figura 4 mostra i risultati tipici della espressione di geni bersaglio BCM in fibroblasti orali seminati su una membrana di collagene di barriera. Fibroblasti orali stimolati con il 20% di terreno condizionato da frammenti ossei pastorizzati e mezzo condizionato da trucioli ossea demineralizzata, hanno mostrato l'espressione genica simile a cellule stimolate con BCM (tabelle 2 e 3). Tuttavia, l'espressione genica dei fibroblasti orali esposto a mezzo condizionato da sterilizzati (121 ° C) frammenti ossei, era paragonabile ai controlli non-stimolata.
Figura 1. Sintesi del processo utilizzato per preparare medie osso condizionata da mandibole di suino fresche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sintesidei test biologici a base di cellule mesenchimali con BCM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'espressione genica di geni bersaglio medio-bone condizionata nei fibroblasti orali. I risultati tipici di sei geni utilizzati per controllare la qualità di BCM. Geni ADM e PTX3 sono inibiti (A) e IL11, IL33, NOX4, PRG4 sono sovraregolati (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. espressione genica di osso-conditioned geni bersaglio medie in fibroblasti orali seminati su una membrana di collagene barriera. I risultati tipici di sei geni usati per controllare la qualità di BCM. Geni ADM e PTX3 sono inibiti (A) e IL11, NOX4, PRG4 sono sovraregolati (B). A seconda del biomateriale utilizzato, l'assorbimento di fattori di crescita possono differire. Membrane di collagene non sono riusciti ad assorbire i fattori che controllano l'espressione IL33, quindi espressione IL33 non è regolamentata in questa impostazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Abbreviazione | Avanti Primer | Inversione Primer |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabella 1: Sequenza Primer dei 6 geni utilizzati.
| Geni | 80 ° C Media ± DS | 121 ° C Media ± DS |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1.1 ± 0.2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0.9 ± 0.2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1.5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1.2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
Tabella 2: l'espressione del gene tipico di ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 e PRG4 in fibroblasti orali stimolati con il 20% di mezzo condizionato da frammenti ossei sottoposti a trattamento termico.
| Geni | Media ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabella 3: espressione genica tipica di ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 e PRG4 in fibroblasti orali stimolati con il 20% di mezzo condizionato da frammenti ossei demineralizzata.
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Discussion
Medio-Bone condizionata riflette l'attività rilasciata di innesti ossei durante le prime fasi di rigenerazione ossea. Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare medium condizionato da riempitivi osso o osso trasformati. I metodi sono facili da eseguire e si basano su un concetto semplice: i fattori rilasciati da varie all'osso autologo ed elaborati. Capire come BCM colpisce le cellule mesenchimali possono aiutare a saperne di più su di consolidamento e le proprietà di autologhi innesto osseo. Sulla base di questo concetto abbiamo accumulato conoscenze sull'impatto di BCM ottenuto da nativo 11,15 ed elaborati osso 14,20 sull'espressione genica di cellule mesenchimali, ma anche sulla proliferazione, migrazione e differenziazione nelle tre linee principali; osteoblasti, adipociti e condrociti 11. BCM è stata esaminata anche per la sua capacità di target cellule ematopoietiche, per esempio rispetto alla modulazione di osteoclastogenesis 13. Molti potenziali cellule bersaglio sono in attesa di rispondere a BCM in vitro, i protocolli qui presentati, possono servire come primer per questa ricerca.
I protocolli presentati dovrebbero animare a rivelare ulteriormente i meccanismi molecolari di come BCM attiva i geni particolarmente TGF-β-regolate in cellule mesenchimali. Per esempio, il recettore TGF-β I Antagonista SB431542 bloccato l'effetto di BCM sull'espressione del pannello ADM gene, IL-11, NOX4, PRG4 e PTX3 11,15. È interessante notare che, fosfatasi alcalina e IL33 non si sono invertiti da SB431542 11,15 suggerendo che altre vie ancora sconosciute sono regolati da BCM. Un'altra questione aperta è quello che sono le molecole di BCM essendo responsabile della risposta cellulare? BCM contiene TGF-β ma non spiega le reazioni cellulari complesse 10,11. Oltre avitro aspetti cellulari, la domanda generale rimane: a cui fa estendere l'attività rilasciata di innesti ossei come risulta dalla BCM, hanno un impatto sul processo in vivo della rigenerazione ossea? I protocolli e dati di test biologici dovrebbero introdurre la ricerca in questa direzione.
Questo protocollo ha dei limiti. BCM non può essere completamente standardizzato a causa delle variazioni tra i donatori e le tecniche di raccolta. Inoltre, come gli enzimi presenti in vivo possono influenzare la composizione o l'attività di BCM rimane sconosciuto. Studi futuri dovrebbero, ad esempio, si concentrerà su come le tecniche di raccolta influenzano la "attività biologica" del BCM. Il ruolo del osteocytes sulla composizione del BCM dovrebbe essere studiato in dettaglio. BCM contiene sclerostina, una molecola rilasciata quasi esclusivamente da osteociti 12. Limitazioni, tuttavia, forniscono l'ispirazione per le prossime fasi della ricerca. Sebbene la rilevanza clinica di ricerche con BCM rimane hypothetical, i nostri protocolli supporta il concetto di lunga data che innesti ossei, nativa o previa trasformazione, rilasciano una "attività biologica". Capire come BCM influisce cellule in vitro può presumibilmente aiutare a capire come autoinnesti ossee lavoreranno in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare. Jordi Caballé-Serrano ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondazione of Dental Research and Education, Basilea, Svizzera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova,, H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , Bone. (2013).
- Schuldt Filho,, G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).
