Summary
Wir beschreiben hier, wie man Knochen-konditionierten Medium (BCM) vorbereiten und testen ihre Aktivität in vitro.
Abstract
Autologe Knochentransplantate sind weit verbreitet in der MKG-Chirurgie, Orthopädie, Traumatologie und verwendet. Autologe Knochentransplantate nicht nur fehlenden Knochen zu ersetzen, sie unterstützen auch den komplexen Prozess der Knochenregeneration. Dieses günstige Verhalten des Autografts ist mit den drei Eigenschaften zugeschrieben: Osteokonduktivität, osteogenicity und Osteoinduktivität. Es besteht jedoch ein weiterer Aspekt: Knochentransplantate setzen eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren, die mesenchymalen Zellen in der Knochenregeneration beteiligten Ziel kann. Die parakrine Eigenschaften von Knochentransplantaten in vitro durch die Verwendung von Knochen-konditionierten Mediums (BCM) untersucht werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, wie man Knochen-konditioniertes Medium von einheimischen Schweine kortikalen Knochen vorzubereiten und Knochen, die thermische Verarbeitung oder Entsalzung unterzogen. Zellen können direkt an BCM ausgesetzt oder auf Biomaterialien, wie Kollagen Membranen, die zuvor mit BCM getränkt ausgesät werden. Wir geben Beispiele für die in vitro bioassays mit mesenchymalen Zellen auf die Expression von TGF-β reguliert Gene. Die vorgestellten Protokolle sollten ermutigen, die parakrine Wirkung von Knochentransplantaten weiter enthüllen während die Knochenregeneration und öffnen Sie einen Pfad für die translationale Forschung auf dem weiten Feld der rekonstruktiven Chirurgie.
Introduction
Autologem Knochen wird häufig eingesetzt, um Mängel, die als Folge der Fehlbildung, resektive Chirurgie, Rekonstruktive Unfallchirurgie, und vor der Implantation 1,2 aufgetreten brücken. Das Verständnis der biologischen Grundlagen, wie Knochentransplantate unterstützen den Prozess der Konsolidierung Transplantat ist nicht nur Schlüssel, um zu verstehen, warum Autotransplantate gelten als der Goldstandard in der rekonstruktiven Chirurgie, ist es auch bionic der verbesserten Gestaltung von Knochenersatz 3. Dennoch ist Transplantat Konsolidierung schneller mit autologem Knochen im Vergleich zu Knochenersatz 4,5. Daher ist es zwingend notwendig, um die molekularen und zellulären Mechanismen, die autologe Knochen so wirksam ist, um die Knochenregeneration zu unterstützen offenbaren.
Es gibt drei Lehrbuch Merkmale der Autotransplantate, die berücksichtigt werden, um den Konsolidierungsprozess 6,7 unterstützt. Zunächst wird autologen Knochen ist osteokonduktive, die Beratung für den neu gebildeten Knochen zu wachsenin den Defekt. Zweitens ist die autologe Knochen osteogenen, dh es mesenchymalen Zellen, zu Osteoblasten differenzieren können 8 enthält. Drittens autologem Knochen osteoinduktiven Wachstumsfaktoren wie bone morphogenetic proteins in der Matrix vergraben können den Prozess der enchondralen oder sogar intramembranous Knochenbildung 9 einzuleiten. Es ist ein weiterer Aspekt: frisch hergestellten Knochenchips halten eine parakrine Funktion auf der Grundlage der in vitro-Beobachtungen mit "Knochen-konditioniertes Medium" 10-15. Auch die Auswirkungen der Myelopoese sollte erwähnt 16 werden. Ein ähnlicher Begriff "demineralisierte Knochenmatrix-konditioniertes Medium" wurde bereits 1996 geprägt und unterstützt das Gesamtkonzept einer parakrinen Funktion von Knochen, selbst wenn sie durch Demineralisierung 17 verarbeitet. Für unsere Zwecke können BCM von frischem Schweinefleisch hergestellt werden Mandibeln 10,11. Proteom-Analysen von BCM zeigte die komplexe Zusammensetzung, einschließlich des Wachstums der Tators und Bestandteile der extrazellulären Matrix 10, der sich auch das vorhandene Wissen auf dem Proteasom der ganzen Knochen 18,19. So sollte BCM spiegeln die Freigabe Aktivität verschiedener Modifikationen von Knochentransplantaten in vitro.
Was passiert, wenn mesenchymalen Zellen, beispielsweise die aus Knochenspäne oder von oralen Weichgewebe isoliert, ausgesetzt sind BCM? In vitro, BCM verringert osteogene und adipogenen Differenzierung und provoziert eine starke Zunahme der IL11 Ausdruck 11. Genomweite Mikroarray ergab mehr Gene differentiell in mesenchymalen Zellen in Reaktion auf BCM ausgedrückt werden. Unter diesen Genen sind Adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH-Oxidase-4 (NOX4), Proteoglycan 4 (PRG4 oder lubricin) und Pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM autoklaviert Knochenspänen erhalten konnte die Expression der jeweiligen Gene 14 ändern. BCM von Knochenchips, die Pasteurisierung unterzogen und das Einfrieren der Lage war,ändern Genexpression 14. Auch konditionierte Medium demineralisierte Knochenmatrix (DBM-CM) verändert die Expression von TGF-β-regulierte Gene 20. Interessanterweise Kollagen Barrieremembranen verwendet, um die Knochenspäne aus dem umgebenden Weichgewebe 21,22 abzuschirmen, adsorbiert die Teile des BCM, das für die Veränderungen in der Genexpression, 23 verantwortlich sind. BCM Forschung kann auf andere in der Knochenregeneration beteiligt wie Knochen-Osteoklasten und Endothelzellen Zelltypen erweitert werden, um einige zu nennen. Insgesamt sind die anfallenden in-vitro-Daten liefern die wissenschaftliche Grundlage für die Gestaltung einer präklinischen Studie.
Dieses Protokoll ist zweifach: Erstens zeigt es, wie man BCM vorzubereiten. Zweitens zeigt sie, wie seine biologische Aktivität getestet anhand von mesenchymalen Zellen in vitro.
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Protocol
1. BCM Vorbereitung
- Erhalten Schweinekiefer aus dem lokalen Metzger so frisch wie möglich. Legen Sie die Mandibeln auf eine feste Oberfläche und lassen eine vollständige Dicke Klappe besondere Aufmerksamkeit, keine Weichteile lassen oder Periost bis auf die Knochen befestigt. Arbeiten Sie in einer sauberen Umgebung ohne die Notwendigkeit, im Rahmen des Flow-Haube arbeiten.
- Sobald eine volle Dicke Klappe freigegeben wird, verwenden Sie einen Knochenschaber, um die Knochenspäne aus der bukkalen Seite zu ernten. Bitte beachten Sie, dass die Knochenschaber hat scharf sein. Griff fest das Knochenschaber und mit langen Bewegungen sammeln die Knochen. Entsorgen Knochenchips kleiner als 1 mm.
- Nativen Knochenchips zu erhalten, setzen Sie sich direkt die Knochenspäne in Plastikschalen von 10 cm Durchmesser mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 1% Antibiotika und Antimykotika lassen sie nicht austrocknen, ergänzt.
- Um die Auswirkungen der thermischen Verarbeitung zu bewerten, unterliegt Knochenspänen für 30 min bei 80 ° C Pasteurisierung oderAutoklav für 20 Minuten bei 121 ° C.
- Zur Bewertung der Auswirkungen der Entmineralisierung, schütteln Knochenspäne in 1 M HCL für 4-6 Stunden bei 4 ° C und immer wieder abwaschen mit Kulturmedium, bis der pH-Wert neutral.
- Zeigen insgesamt 5 g Knochenchips pro 10 ml frischem DMEM mit 1% Antibiotika und Antimykotika ergänzt in eine neue Kunststoffschale.
- Setzen Sie die Kunststoffschalen in einer feuchten Atmosphäre bei 37 ° C für 24 Stunden. Dann Ernte BCM. Zentrifugieren Sie die BCM bei 200 × g für 10 min, um Ablagerungen zu entfernen, zu filtern sterile (0,2 nm), und halten Aliquots bei -80 ° C eingefroren.
- Auftauen BCM Lager unmittelbar vor der Verwendung und zur Vermeidung von wiederholten Zyklen von Einfrieren und Auftauen.
- Für Experimente angegeben, tränken Kollagenmembranen mit BCM oder Serum-freien Medium für 1 h bei RT. Waschen Sie kräftig die Membranen mit PBS und legen Sie sie in 96-Well-Platten. Nassen Membranen werden mit Zellen beimpft.
- BCM Herstellverfahren ist in 1 zusammengefasst.
2. Bioassays Basierend auf mesenchymale Zellen
- Samen humanen mesenchymalen Zellen (zB Knochenzellen, gingivalen und Parodontalligament Fibroblasten) in eine Platte mit 12 Vertiefungen mit einer Konzentration von 30.000 Zellen / cm 2. Auf Saatgut, die Zellen verwenden, Wachstumsmedium, bestehend aus DMEM, das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika. Lassen Sie die Zellen heften sich an die Platte O / N.
- Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten PBS bei 37 ° C. Stimulieren die Zellen durch Zugabe von vorgewärmten serumfreien Kulturmedium mit und ohne 20% BCM. Platzieren Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C für 24 Std.
- Entsorgen Sie das Kulturmedium, spülen Sie die Zellen mit vorgewärmten PBS und extrahieren Sie die RNA nach Ihren bevorzugten Protokoll.
- Einstellen der Konzentration von RNA, um die gleiche Menge an RNA in jeder Probe zu haben. Bereiten cDNAs und führen Sie eine qRT-PCR, um die ausgewählten Gene unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Primer zu analysieren.
Hinweis: Dies sind die Verdünnungen der einzelnen Komponenten: 2x SYBR Green, 20x Primer nach vorn, 20x Primer Reverse, 5x sterile DD Wasser, 5x cDNA. Die qRT-PCR wird in 40 Zyklen bei 95 ° C 15 sec und 60 ° C 1 min lang durchgeführt. - Berechnen der relativen Expressionsniveaus durch Normierung auf die Haushaltsgens GAPDH mit der Δ (ACt) Verfahren, bei dem ACt ist CT Ziel - CT GAPDH und Δ (ACt) ist ACt stimulierten - ACt Kontrolle.
- Nach dieser Qualitätskontrolle, hinzuzufügen BCM zum Kulturmedium, um alle Arten von Zellen, einschließlich mesenchymalen Zellen, hämatopoetischen Zellen oder endotheliale Zellen zu stimulieren.
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Representative Results
Knochen konditionierte Medium wird aus frischen Schweineknochenspänen hergestellt. Allgemeine Übersicht über den Prozess zu BCM vorzubereiten und Biomaterialien in Verbindung mit BCM Verwendung wird in Abbildung 1 und 2 dargestellt. Während des BCM Vorbereitung, ist es wichtig, große Knochenchips mit langen Bewegungen so kurz Bewegungen oder sehr kleine Knochensplitter zu erhalten können die Qualität des endgültigen BCM beeinflussen. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 und PRG4 (Abbildung 3): Qualität des BCM kann durch Analyse der Genexpression von Zielgenen BCM gesteuert werden. ADM und PTX3 werden bis auf 0,4-fach herunterreguliert und IL11, IL33, NOX4 und PRG4 kann bis 200-fach hochreguliert. Wenn oral Fibroblasten nicht BCM Zielgene exprimieren an der gezeigten Ebene, überprüfen Sie die Gesundheit der Zellen oder bereiten neue BCM aus neuen Unterkiefer dar. 4 zeigt typische Ergebnisse der Expression von Zielgenen in BCM oral Fibroblasten auf eine Kollagen-Barrieremembran geimpft. Oral Fibroblasten mit 20% konditioniertem Medium aus pasteurisierter Knochenspänen und konditioniertes Medium von demineralisiertem Knochenspäne stimuliert, zeigten ähnliche Genexpression Zellen mit BCM (Tabelle 2 und Tabelle 3) stimuliert. Allerdings Genexpression von oralen Fibroblasten konditioniertes Medium aus sterilisiert (121 ° C) Knochenspänen ausgesetzt, war vergleichbar mit un-stimulierte Kontrollen.
Abbildung 1. Zusammenfassung der verwendet wird, um Knochen-konditionierten Mediums aus frischen Schweinekiefer vorzubereiten Prozess. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zusammenfassungder Bioassays auf Basis von mesenchymalen Zellen mit BCM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Genexpression von Knochen-konditionierten Mediums Zielgene in oralen Fibroblasten. Typische Ergebnisse von sechs Genen verwendet werden, um die Qualität des BCM. Genes ADM und PTX3 steuern, werden herunterreguliert (A) und IL11, IL33, NOX4, PRG4 sind hochreguliert (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Genexpression von Knochen-conditioned Medium Zielgene in oralen Fibroblasten auf einem Kollagenbarrieremembran ausgesät. Typische Ergebnisse von sechs Genen verwendet werden, um die Qualität des BCM steuern. Gene ADM und PTX3 werden herunterreguliert (A) und IL11, NOX4, PRG4 hochreguliert sind (B). Abhängig von dem Biomaterial verwendet wird, kann die Absorption des Wachstumsfaktoren unterscheiden. Kollagenmembranen nicht zu Faktoren, die IL33 Ausdruck daher IL33 Ausdruck wird in dieser Einstellung geregelt steuern zu absorbieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Abkürzung | Primer nach vorne | Primer Reverse |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tabelle 1: Primer Sequenz der 6 Genen verwendet.
| Gene | 80 ° C Mittelwert ± SD | 121 ° C Mittelwert ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1.8 ± 1 |
Tabelle 2: Typische Genexpression von ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 und PRG4 in oralen Fibroblasten mit 20% konditioniertes Medium aus wärmebehandelter Knochenchips stimuliert.
| Gene | Mittelwert ± Standardabweichung |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tabelle 3: Typische Genexpression von ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 und PRG4 in oralen Fibroblasten mit 20% konditioniertes Medium aus entmineralisierten Knochenchips stimuliert.
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Discussion
Knochen-konditionierten Medium reflektiert die Freigabe Aktivität von Knochentransplantaten in den frühen Phasen der Knochenregeneration. Das hier beschriebene Protokoll angepasst ist, die Reaktion der verschiedenen Arten von Zellen in der Knochenregeneration zu studieren. Darüber hinaus kann das Protokoll, mit dem konditionierten Medium von verarbeiteten Knochen oder Knochen Füllstoffe verwendet werden. Die Methoden sind einfach durchzuführen und sich auf ein einfaches Konzept: der Faktoren aus verschiedenen einheimischen und verarbeitete Knochen freigesetzt. Zu verstehen, wie BCM wirkt mesenchymalen Zellen kann helfen, mehr über Transplantat Konsolidierung und Eigenschaften von Knochentransplantaten zu lernen. Basierend auf diesem Konzept haben wir Wissen über die Auswirkungen der BCM aus nativen 11,15 und verarbeitete Knochen 14,20 auf die Genexpression von mesenchymalen Zellen erhalten angesammelt haben, aber auch auf die Proliferation, Migration und Differenzierung in die drei Hauptlinien; Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten 11. BCM wurde auch für seine Fähigkeit, ta geprüftRGET hämatopoetischen Zellen, beispielsweise in bezug auf die Modulation der Osteoklastogenese 13. Viele potentielle Zielzellen darauf warten, an BCM in vitro reagieren, können die Protokolle hier dargestellten, als Primer für diese Forschung.
Die vorgestellten Protokolle sollten auch animieren, weiter zu offenbaren, die molekularen Mechanismen, wie BCM aktiviert besonders TGF-β-regulierte Gene in mesenchymalen Zellen. Zum Beispiel kann die TGF-β-Rezeptor I Antagonist SB431542 blockiert die Wirkung von BCM auf die Expression des Gens Platte ADM, IL-11, NOX4, PRG4 und PTX3 11,15. Interessanterweise wurden alkalische Phosphatase und IL33 nicht von SB431542 11,15 vertauscht nahelegt, daß andere noch unbekannte Wege werden durch BCM geregelt. Eine weitere offene Frage ist, was sind die Moleküle in BCM ist für die zelluläre Reaktion verantwortlich? BCM enthält TGF-β ist aber nicht die komplexen zellulären Reaktionen 10,11 erklären. Neben dem invitro zellulären Aspekte, bleibt die Gesamt Frage: in welchem Ausmaß funktioniert die Freigabe Aktivität von Knochentransplantaten, wie durch BCM reflektiert wird, einen Einfluss auf die in vivo-Verfahren der Knochenregeneration? Die Protokolle und Daten von Biotests sollten Forschung in dieser Richtung vor.
Dieses Protokoll hat Grenzen. BCM nicht vollständig aufgrund von Abweichungen zwischen Gebern und Ernteverfahren vereinheitlicht werden. Darüber hinaus, wie in vivo vorhandenen Enzyme kann die Zusammensetzung oder die Aktivität von BCM beeinflussen bleibt unbekannt. Künftige Studien sollten zum Beispiel darauf konzentrieren, wie Erntetechniken Einfluss auf die "biologische Aktivität" des BCM. Die Rolle von Osteozyten von der Zusammensetzung des BCM sollte auch im Detail untersucht werden. BCM enthält Sclerostin, ein Molekül, fast ausschließlich von Osteozyten 12 freigegeben. Einschränkungen jedoch vorsehen, die Inspiration für die nächsten Schritte in der Forschung. Auch wenn die klinische Bedeutung der Forschung mit BCM bleibt hypothetical unsere Protokolle unterstützen die langjährige Konzept, dass Knochentransplantate, entweder nativ oder nach Verarbeitung, lassen eine "biologische Aktivität". Zu verstehen, wie BCM-Zellen in vitro beeinflussen kann vermutlich helfen, zu verstehen, wie Knochentransplantaten wird in vivo zu arbeiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren. Jordi Caballé-Serrano erhielt ein Stipendium der Stiftung of Dental Research und Education, Basel, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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