Summary
Nous décrivons ici comment préparer milieu de l'os de la climatisation (BCM) et de tester son activité in vitro.
Abstract
Greffes osseuses autologues sont largement utilisés dans la chirurgie orale et maxillo-faciale, orthopédie, traumatologie et. Greffes osseuses autologues ne remplacent pas seulement os manquant, ils soutiennent également le processus complexe de la régénération osseuse. Ce comportement favorable des autogreffes est attribuée aux trois caractéristiques: ostéoconductivité, osteogenicity et ostéoinductivité. Cependant, il est un autre aspect: Greffons osseux libérer une multitude de molécules, y compris les facteurs de croissance, qui peuvent cibler des cellules mésenchymateuses impliquées dans la régénération osseuse. Les propriétés paracrines des greffes osseuses peuvent être étudiés in vitro par l'utilisation du support d'os conditionné (BCM). Ici, nous présentons un protocole sur la façon de préparer le milieu de l'os cortical conditionné à partir natif de porc os et l'os qui a subi un traitement thermique ou déminéralisation. Les cellules peuvent être directement exposés à la BCM ou ensemencées sur les biomatériaux, tels que les membranes de collagène, préalablement trempées avec BCM. Nous donnons des exemples pour in vitro bioassays avec des cellules mésenchymateuses sur l'expression des gènes régulés par le TGF-β. Les protocoles présentés devraient inciter à révéler davantage les effets paracrines de greffes osseuses pendant la régénération osseuse et ouvrir un chemin pour la recherche translationnelle dans le vaste domaine de la chirurgie reconstructive.
Introduction
Osseuse autologue est largement utilisé pour combler les défauts qui ont eu lieu à la suite d'une malformation, une chirurgie d'exérèse, la chirurgie traumatologique reconstructive, et avant le placement de l'implant 1,2. Comprendre les principes biologiques de la façon dont les greffons osseux soutenir le processus de consolidation de la greffe est non seulement la clé pour comprendre pourquoi autogreffes sont considérés comme l'étalon-or en chirurgie reconstructive, il est également bionique pour améliorer la conception des substituts osseux 3. Pourtant, la consolidation de la greffe est plus rapide avec de l'os autologue par rapport à 4,5 substituts osseux. Ainsi, il est impératif de révéler les mécanismes moléculaires et cellulaires qui font osseuse autologue si efficace pour soutenir la régénération osseuse.
Il ya trois caractéristiques de manuels de autogreffes qui sont considérés pour soutenir le 6,7 de processus de consolidation. Tout d'abord, l'os autologue est ostéoconducteur, fournissant des orientations pour l'os nouvellement formé à croîtredans le défaut. Deuxièmement, l'os autologue est ostéogénique, ce qui signifie qu'il contient des cellules mésenchymateuses qui peuvent se différencier en ostéoblastes 8. Troisièmement, l'os autologue est ostéoinductrice comme des facteurs de croissance comme les protéines morphogénétiques osseuses ensevelis dans la matrice peuvent initier le processus de endochondral ou même intramembranaire formation osseuse 9. Il ya un autre aspect: éclats d'os fraîchement préparés détiennent une fonction paracrine sur la base des observations in vitro avec «milieu de l'os-conditionné" 10-15. De plus l'impact de la myélopoïèse 16 convient de mentionner. Un terme similaire "milieu de la matrice osseuse déminéralisée conditionné" a déjà été inventé en 1996 et soutient le concept global d'une fonction paracrine de l'os, même lorsque traité par déminéralisation 17. Pour nos fins, BCM peut être préparé à partir de porc fraîche mandibules 10,11. Analyses protéomiques de BCM a révélé la composition complexe, y compris effet de la croissanceors et constituants de la matrice extracellulaire 10, étendant également les connaissances actuelles sur le protéasome de l'os ensemble 18,19. Ainsi, BCM devrait refléter l'activité libéré de diverses modifications de greffes osseuses in vitro.
Qu'est-ce qui se passe lorsque les cellules mésenchymateuses, par exemple celles qui sont isolées à partir de fragments d'os ou de tissus mous de la bouche, sont exposés à BCM? In vitro, BCM réduit ostéogénique et la différenciation adipocytaire, et provoque une forte augmentation de l'expression de 11 IL11. Génome large microréseau a révélé plusieurs gènes d'être exprimés de manière différentielle dans des cellules mésenchymateuses en réponse à BCM. Parmi ces gènes sont adrénomédulline (ADM), IL11, IL33, la NADPH oxydase 4 (NOX4), des protéoglycanes 4 (PRG4 ou lubricin) et pentraxine 3 (PTX3) 15. BCM obtenu à partir de copeaux d'os autoclave n'a pas réussi à modifier l'expression des gènes respectifs 14. BCM à partir de fragments d'os qui ont subi la pasteurisation et de congélation a pumodifier l'expression des gènes 14. Aussi milieu conditionné de la matrice osseuse déminéralisée (DBM-CM) modifie l'expression du TGF-β gènes régulés 20. Fait intéressant, les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les copeaux d'os du tissu mou environnant 21,22, adsorbés les parties de BCM qui sont responsables de l'évolution de l'expression du gène 23. la recherche de BCM peut être étendu à d'autres types de cellules impliquées dans la régénération osseuse tels que les ostéoclastes de résorption osseuse et les cellules endothéliales, pour ne nommer que quelques-uns. Globalement, les données d'accumulation in vitro fournissent la base scientifique pour la conception d'une étude préclinique.
Le présent protocole est double: d'abord, il montre comment préparer BCM. Deuxièmement, il montre comment tester son activité biologique à base de cellules mésenchymateuses in vitro.
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Protocol
1. Préparation BCM
- Obtenir mandibules de porcs du boucher local aussi frais que possible. Placez les mandibules sur une surface ferme et libérer un lambeau de pleine épaisseur accordant une attention particulière à ne pas laisser tout tissu doux ou périoste fixé à l'os. Travailler dans un environnement propre, sans la nécessité de travailler sous la hotte à flux.
- Une fois un lambeau de pleine épaisseur est libéré, utiliser un grattoir osseuse pour récolter les éclats d'os du côté buccal. S'il vous plaît noter que le grattoir osseuse doit être forte. Poignée fermement le grattoir osseuse et avec de longs mouvements recueillent l'os. Jeter éclats d'os plus petits que de 1mm.
- Pour maintenir les éclats d'os natifs, placer directement les éclats d'os dans les plats en plastique de 10 cm de diamètre avec un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 1% d'antibiotiques et antimycosiques ne pas les laisser se dessécher.
- Pour évaluer l'impact du traitement thermique, éclats d'os soumis à une pasteurisation pendant 30 min à 80 ° C ouautoclave pendant 20 min à 121 ° C.
- Pour évaluer l'impact de la déminéralisation, secouez éclats d'os dans 1 M de HCL pour 4-6 heures à 4 ° C et les laver à plusieurs reprises avec un milieu de culture jusqu'à ce que le pH est neutre.
- Placez un total de 5 g de copeaux d'os par 10 ml de DMEM frais complété avec 1% d'antibiotiques et antimycosiques dans un nouveau récipient de plastique.
- Placez les plats en plastique dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures. Ensuite, la récolte BCM. Centrifugeuse la BCM à 200 g pendant 10 min pour éliminer les débris, filtrer stérile (0,2 nm), et de garder aliquotes congelées à -80 ° C.
- Décongeler le BCM de stock immédiatement avant utilisation et d'éviter les cycles de gel et dégel.
- Pour les expériences indiquées, faire tremper les membranes de collagène avec le milieu BCM ou sans sérum pendant 1 heure à température ambiante. Laver vigoureusement les membranes avec du PBS et les placer dans des plaques 96 puits. Membranes humides sont ensemencées avec des cellules.
- processus de préparation du BCM est résumé dans la figure 1.
2. Bioassays à base de cellules mésenchymateuses
- les cellules mésenchymateuses humaines graines (par exemple des cellules osseuses, gingivale et les fibroblastes du ligament parodontal) dans une plaque à 12 puits avec une concentration de 30 000 cellules / cm 2. Pour ensemencer les cellules utilisent un milieu de croissance constitué de DMEM, 10% de sérum de veau foetal et des antibiotiques. Laissez les cellules attachent à la plaque O / N.
- Jeter le milieu de culture et laver les cellules avec PBS préchauffé à 37 ° C. Stimuler les cellules en ajoutant préchauffé milieu de culture sans sérum avec et sans 20% BCM. Placer les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures.
- Jeter le milieu de culture, rincer les cellules avec PBS préchauffé et extraire l'ARN selon votre protocole préféré.
- Ajuster la concentration de l'ARN afin d'avoir la même quantité d'ARN dans chaque échantillon. Préparer des ADNc et effectuer une qRT-PCR pour analyser les gènes sélectionnés en utilisant les amorces indiquées dans le tableau 1.
NOTE: Ce sont les dilutions de chaque composant: 2x SYBR Green, 20x amorce avant, 20x amorce inverse, 5x eau DD stérile, 5x ADNc. Le qRT-PCR est réalisée en 40 cycles de 95 ° C 15 s et 60 ° C 1 min. - Calculer les niveaux d'expression relatifs en normalisant la GAPDH de gène de ménage en utilisant la méthode Δ (ACt) où ACt est la cible de CT - CT GAPDH et Δ (ACt) est stimulée ACt - ACt contrôle.
- Après ce contrôle de la qualité, BCM ajouter au milieu de culture pour stimuler tous les types de cellules comprenant des cellules mésenchymateuses, des cellules hématopoïétiques ou des cellules endothéliales.
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Representative Results
Os milieu conditionné est préparé à partir de frites fraîches d'os de porc. Aperçu général du processus pour préparer BCM et à utiliser en combinaison avec des biomatériaux BCM est illustré à la figure 1 et la figure 2, respectivement. Lors de la préparation de la BCM, il est important d'obtenir de grandes éclats d'os avec de longs mouvements que les mouvements de courte durée ou de très petits éclats d'os peut affecter la qualité de la BCM finale. Qualité de BCM peut être contrôlée par l'analyse de l'expression génique de gènes cibles de BCM: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 et PRG4 (Figure 3). ADM et PTX3 sont régulés à la baisse jusqu'à 0,4 fois et IL11, IL33, NOX4 et PRG4 peuvent être régulés à la hausse à 200 fois. Si fibroblastes orales ne reflètent pas les gènes cibles de BCM au niveau indiqué, vérifier la santé des cellules ou de préparer une nouvelle BCM de nouveaux mandibules. Figure 4 affiche des résultats typiques de l'expression de gènes cibles de BCM dans les fibroblastes orales ensemencées sur une membrane de collagène de barrière. Des fibroblastes stimulés par voie orale avec 20% de milieu conditionné à partir de copeaux d'os et pasteurisés milieu conditionné à partir de copeaux d'os déminéralisé, a montré l'expression génique similaire aux cellules stimulées avec BCM (tableau 2 et tableau 3). Toutefois, l'expression du gène de fibroblastes orales exposé au milieu conditionné à partir de stérilisés (121 ° C) des copeaux d'os, était comparable aux témoins un-stimulée.
Figure 1. Résumé du processus utilisé pour préparer le milieu de l'os de la climatisation de mandibules de porcs frais. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Sommairedes essais biologiques basés sur les cellules mésenchymateuses avec BCM. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Gene expression de gènes cibles à moyen os conditionné dans les fibroblastes orales. Les résultats typiques de six gènes utilisés pour contrôler la qualité de la BCM. Gènes ADM et PTX3 sont régulés à la baisse (A) et IL11, IL33, NOX4, PRG4 sont régulés à la hausse (B). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Expression des gènes de l'os conditioned gènes cibles moyennes dans les fibroblastes orales ensemencées sur une membrane de collagène de la barrière. Les résultats typiques de six gènes utilisés pour contrôler la qualité de la BCM. Gènes ADM et PTX3 sont régulés à la baisse (A) et IL11, NOX4, PRG4 sont régulés à la hausse (B). Selon le biomatériau utilisé, l'absorption de facteurs de croissance peuvent différer. membranes de collagène ont échoué à absorber les facteurs qui contrôlent l'expression de IL33, donc l'expression d'IL33 est pas réglementé dans ce cadre. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Abréviation | L'amorce | Amorce antisens |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| NOX4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
Tableau 1: séquence d'amorce des six gènes utilisés.
| Genes | 80 ° C de moyenne ± SD | 121 ° C moyenne ± SD |
| ADM | 0,2 ± 0,1 | 1,1 ± 0,2 |
| PTX3 | 0,1 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 |
| IL11 | 20 ± 10 | 1,5 ± 1 |
| IL33 | 15 ± 5 | 1,2 ± 4 |
| NOX4 | 35 ± 15 | 2 ± 1 |
| PRG4 | 40 ± 10 | 1,8 ± 1 |
Tableau 2: l'expression du gène typique d'ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 et PRG4 dans les fibroblastes stimulées par voie orale avec 20% de milieu conditionné à partir de copeaux osseux traités thermiquement.
| Genes | Moyenne ± SD |
| ADM | 0,1 ± 0,1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15 ± 5 |
| IL33 | 20 ± 10 |
| NOX4 | 60 ± 15 |
| PRG4 | 50 ± 20 |
Tableau 3: l'expression du gène typique d'ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 et PRG4 dans les fibroblastes stimulées par voie orale avec 20% de milieu conditionné à partir de copeaux d'os déminéralisé.
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Discussion
Support d'os conditionné reflète l'activité libéré de greffons osseux au cours des premiers stades de la régénération osseuse. Le protocole décrit ici peut être adapté à étudier la réponse de différents types de cellules impliquées dans la régénération osseuse. En outre, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu conditionné à partir de transformés os ou des charges. Les méthodes sont faciles à réaliser et de compter sur un concept simple: les facteurs libérés à partir de divers os natif et traitées. Comprendre comment BCM affecte les cellules mésenchymateuses peuvent aider à en savoir plus sur la consolidation et les propriétés des autogreffes de greffe osseuse. Basé sur ce concept, nous avons accumulé des connaissances sur l'impact du BCM obtenu de l'os natif 11,15 et 14,20 traitées sur l'expression génique des cellules mésenchymateuses, mais aussi sur la prolifération, la migration et la différenciation dans les trois lignées principales; les ostéoblastes, les adipocytes et des chondrocytes 11. BCM a également été examinée pour sa capacité à taTARGET cellules hématopoïétiques, par exemple en ce qui concerne la modulation de l'ostéoclastogenèse 13. Beaucoup de cellules cibles potentielles sont en attente pour répondre à BCM in vitro, les protocoles présentés ici, peuvent servir d'amorce pour cette recherche.
Les protocoles présentés devraient également animer de révéler davantage les mécanismes moléculaires de la façon dont BCM active les gènes TGF-β particulièrement réglementés dans les cellules mésenchymateuses. Par exemple, le récepteur de TGF-β je antagoniste SB431542 bloqué l'effet de la BCM sur l'expression du panneau ADM génique, IL-11, NOX4, PRG4 et PTX3 11,15. Fait intéressant, la phosphatase alcaline et IL33 ont pas été inversés par SB431542 11,15 suggérant que d'autres voies encore inconnues sont réglementés par BCM. Une autre question ouverte est ce que sont les molécules dans BCM étant responsables de la réponse cellulaire? BCM contient TGF-β mais ne pas expliquer les réactions cellulaires complexes 10,11. En plus de l'envitro aspects cellulaires, la question globale demeure: à qui fait étendre l'activité rejetée de greffons osseux comme reflété par BCM, avoir un impact sur le processus in vivo de la régénération osseuse? Les protocoles et les résultats d'essais biologiques devraient introduire des recherches dans ce sens.
Ce protocole a ses limites. BCM ne peut pas être entièrement normalisée en raison des variations entre les donateurs et les techniques de récolte. En outre, comment les enzymes présents in vivo peuvent affecter la composition ou l'activité de BCM reste inconnu. Les études futures devraient, par exemple, se concentrer sur la façon dont les techniques de récolte affectent la "activité biologique" du BCM. Le rôle des ostéocytes sur la composition du BCM devrait également être étudiée en détail. BCM contient sclérostine, une molécule libérée presque exclusivement par les ostéocytes 12. Limitations, cependant, fournissent l'inspiration pour les prochaines étapes de la recherche. Même si la pertinence clinique de la recherche avec BCM reste hypothetical, nos protocoles prennent en charge le concept de longue date que les greffes osseuses, soit indigène ou après transformation, libèrent une "activité biologique". Comprendre comment BCM affecte des cellules in vitro peut vraisemblablement aider à comprendre comment les autogreffes osseuses vont travailler in vivo.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler. Jordi Caballé-Serrano a reçu une bourse de la Fondation de la recherche dentaire et de l'éducation, de Bâle, Suisse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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