Abstract
ولا تزال الآليات التي تنظم فعالية اختيار الغدة الصعترية سيئة التحديد. الطريقة المعروضة هنا يسمح في التحليلات المجراة من تطوير واختيار خلايا T معينة للدفاع عن النفس والمستضدات الأجنبية. النهج ينطوي زرع الطعوم الغدة الصعترية المستمدة من مختلف الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المستفيدين في SCID العوز المناعي. خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن وأعيد المستلمين تماما مع خلايا T المستمدة من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية مزروع. بذر thymocytes فقط الغدة الصعترية في وقت العزلة الخضوع اختيار وتتطور إلى خلايا T الناضجة. على هذا النحو، يمكن تقييم التغيرات في طبيعة وخصوصية الخلايا T المغروسة بوصفها وظيفة من الأحداث الغدة الصعترية التي تعتمد على العمر. على الرغم من الخبرة الفنية اللازمة لزرع الغدة الصعترية ناجحة، وهذه الطريقة توفر استراتيجية فريدة من نوعها للدراسة في الجسم الحي مجموعة واسعة من الأمراض التي ترجع إلى نتيجة أو وظيفة و / أو homeostas الغدة الصعترية الشاذةهو.
Introduction
الغدة الصعترية هي الجهاز الذي الأحداث الهامة في تطوير الخلايا T تحدث 1. thymocytes المقيمين، على إعادة ترتيب الخلايا التائية مستقبلات (TCR) α و β الجينات، الخضوع لسلسلة من التفاعلات مع الخلايا lymphostromal ومقدمة للمستضد (APC) في المناطق القشرية والنخاعية من الغدة الصعترية 2. وتتوسط التوتة اختيار إيجابية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (TEC) لإنتاج thymocytes التي تعترف الببتيدات المستضدات في سياق المضيفة الرئيسية معقد التوافق النسيجي (MHC) الصف الأول والثاني جزيئات 2-3. اللاحقة اختيار السلبية الغدة الصعترية تستلزم تطهير thymocytes autoreactive، يقودها التفاعل مع TEC النخاع أو الخلايا الجذعية (DC) أن الببتيدات الحالية المستمدة من البروتينات الذاتي ملزمة MHC من الدرجة الأولى والثانية الجزيئات 3. النتيجة النهائية لهذه العمليات هو إنشاء مجموعة من خلايا CD4 + ناضجة وCD8 + T قادرة على الرد على طيف واسعمن المستضدات الأجنبية، وفى نفس الوقت الحد الأدنى من التفاعل للبروتينات الذاتي 4.
ويتأثر كفاءة أحداث اختيار الغدة الصعترية من قبل مجموعة من العوامل، بما في ذلك نضج الغدة الصعترية، وتواتر النخاع وTEC القشرية، وتكوين فرعية من الغدة الصعترية DC، ومصدر السلائف الغدة الصعترية 3. والجدير بالذكر، أن اختيار الغدة الصعترية الشاذة يؤدي في المناعة الذاتية 5 أو العوز المناعي الأمراض التي تنشأ من ضعف اختيار سلبية أو إيجابية، على التوالي. الأحداث الجزيئية التي تنظم اختيار الغدة الصعترية، ومع ذلك، غير مفهومة. في المختبر النهج مثل reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) 6، وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحليل الأحداث الأساسية المرتبطة اختيار الغدة الصعترية، لكنه يفشل في ألخص تماما ديناميكية مستمرة في أحداث الجسم الحي. ونتيجة لذلك، تم إنشاء هذا النهج القائم على زرع الغدة الصعترية إلى أفضل الأحداث الدراسة اختيار خلية توتية في الجسم الحي 7
يصف هذا البروتوكول زرع التوتة من الفئران المانحة حديثي الولادة وتعليم الكبار في الفئران المتلقي SCID العوز المناعي. تسمح هذه التقنية على دراسة الآليات التي تنظم اختيار الغدة الصعترية الإيجابية والسلبية، وكذلك انتاج الغدة الصعترية من مختلف مجموعات فرعية الخلايا T أثناء تطور الجنين. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدم هذا النهج لإثبات أن كفاءة اختيار الغدة الصعترية يقتصر في وقت مبكر بعد الولادة لدى الفئران مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا T autoreactive، وانخفاض الخلايا التائية ذخيرة محددة لمستضدات الخارجية 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسات الفئران من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة نورث كارولينا تشابل هيل، وكان كل رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC.
1. إعداد الوليد والكبار التوتة
- إعداد جميع الكواشف والمعدات قبل القتل الرحيم الفئران المانحة.
- تعقيم الأدوات الجراحية قبل التعقيم أو طرق أخرى مناسبة. يجب إجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على ظروف معقمة وتجنب التلوث. تجميع الأدوات اللازمة لاستخراج التوتة من الفئران المانحة.
- ملء طبق 60 ملم مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) ووضع على الجليد داخل غطاء محرك السيارة. وسوف تستخدم هذه لتخزين لفترة وجيزة التوتة رفعه من الفئران المانحة قبل الزرع.
- وفقا لمبادئ توجيهية أخلاقية، الموت ببطء الفئران حديثي الولادة المانحة بقطع الرأس والمانحين الكبار الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم.
- لصemoval من الغدة الصعترية: وضع الماوس في موقف الظهرية راقد على منشفة ورقية معقمة ماصة ورذاذ مع الايثانول 70٪ قبل اتخاذ شق.
- فضح تجويف البطن والصدر من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد. أضعاف الجلد فوق الصدر والأطراف الأمامية للكشف عن تجويف الصدر.
- جعل اثنين من الشقوق الجانبية من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري لفضح المنصف العلوي والأمامي التجويف الصدري. يجب أن تكون الغدة الصعترية مرئية كما فصين البيضاء مباشرة فوق والمتاخمة للقلب.
- ندف بصرف النظر الأنسجة الضامة المحيطة الغدة الصعترية مع ملقط غرامة، والتأكد من عدم تعطيل كبسولة. في حين تحجم القفص الصدري مع ملقط، واستخدام الزوج الثاني من ملقط لاستخراج اثنين من فصوص الغدة الصعترية عن طريق وضع ملقط المنحني تحت الجهاز وسحب عموديا. ويمكن القيام بذلك باستخدام نطاق تشريح لاستخراج التوتة من الفئران حديثي الولادة.
- وضع الغدة الصعترية في 60 مم ديش تحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) على الجليد وفصوص الغدة الصعترية منفصلة من خلال قطع البرزخ الضام. إزالة أي حطام من فصوص الغدة الصعترية التأكد من عدم تلف كبسولة، وقطع الغدة الصعترية إلى العدد المناسب من أقسام للزرع.
- لا تلاعب في التوتة تم الحصول عليها من الفئران حديثي الولادة.
ملاحظة: يستخدم لمدة أقصاها اثنين من الفئران المتلقي (1 الفص في المتلقي). - زرع التوتة تم الحصول عليها من فئران بالغة في مدة أقصاها 4-6 الفئران المتلقي. باستخدام زوج من الملقط، فهم بعناية شخص بالغ واحد فص الغدة الصعترية، كما هو مبين في الشكل رقم 1، وقطع الغدة الصعترية إلى ثلاثة أقسام متساوية باستخدام مقص جراحي.
- كرر الخطوات من 1،3-1،4 لكل الماوس المانحة. من أجل أن يحدد الوقت الذي تتعرض التوتة، وإعداد الغدة الصعترية 1 المانحة في وقت واحد.
2. الغدة الصعترية زرع تحت كبسولة الكلى
- تجميع المعدات المعقمة قبل المدرجة في الجدول 1. العقيم السليموينبغي الاستفادة من تقنية أثناء الإجراء لمنع تعريض الزرع المتلقين لأدوات أو الكواشف الملوثة.
- قبل الزرع، تزن كل وعلامة الماوس المتلقي.
- إعداد المجهر تشريح ودائرة التخدير في غطاء تدفق الصفحي.
- باستخدام الحلاقة الكهربائية، حلق الجانب الأيسر من الفأرة المستفيدة وضمان عدم وجود الشعر يبقى في جميع أنحاء المنطقة التي استخدمت لصنع شق.
- بدوره على المرذاذ isofluorane وتخدير الماوس باستخدام جرعة بين 1-2٪. تأكد التخدير المناسب قبل البدء في إجراء العمليات الجراحية عن طريق التحقق من عدم وجود رد الفعل التالية قرصة أخمص قدميه.
- بعد تخدير الماوس بشكل صحيح، وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف وإعداد الماوس لزرع على النحو التالي:
- ضع الماوس تحت المجهر تشريح في وضعية الاضطجاع الجانبي الأيمن بحيث الجانب حلق يكون مواجها لها. Startiنانوغرام في وسط منطقة العمليات الجراحية، موزعة بشكل دائري باستخدام ماصة نقل القابل للتصرف 70٪ من الإيثانول، تليها بوفيدون اليود (betadine). تكرار العلاج الايثانول / betadine 3 مرات قبل اتخاذ شق.
- باستخدام مقص تشريح جعل 1-2 سم الجناح شق مباشرة فوق الكلى.
- باستخدام ملقط المتوسطة فهم النسيج الضام المتاخمة للالكلى ورفع بلطف الكلى بحيث انها تقع على قمة الجهاز العضلي. للحفاظ على الكلى المكشوفة وفي مكان على الجهاز العضلي، إدراج ذراع واحدة من الملقط المتوسطة تحت الكلى، مع إيلاء اهتمام خاص عدم تعطيل إليوم الكلوي.
- من أجل منع جفاف الأنسجة، ري الكلى العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) خلال كل خطوة حتى التلاعب في الكلى والكلى كبسولة كاملة.
- باستخدام ملقط غرامة قرصة ورفع الكبسولة بالقرب من حافة الكلى الأكثر القاصي إلى الغدد الكظرية لفصلها عن الكلى.
- استخدام مقياس 18الإبرة إلى إجراء شق كبير بما فيه الكفاية لادخال قطعة استعداد لالغدة الصعترية المانحة (الشكل 2A). تأكد للحفاظ على شق المحفظة صغيرة قدر الإمكان لمنع الخلع من الكسب غير المشروع مع مرور الوقت.
- مع الحفاظ على كبسولة ابتعد من الكلى، واستخدام الزوج الثاني من ملقط غرامة لإدراج الكسب غير المشروع تحت الكبسولة ودفع الغدة الصعترية بقدر إلى الأمام من شق المحفظة ممكن (الشكل 2B).
- إزالة ملقط من تحت الكلى، والعودة برفق الكلى مرة أخرى إلى مكان من خلال شق.
- إغلاق الجهاز العضلي من قبل خياطة الجدار البريتوني وتطبيق betadine مرة واحدة مغلقة. بعد خياطة كاملة، وتطبيق مقاطع الجرح لإغلاق الأدمة وتطبيق betadine إلى المنطقة المحيطة.
- عودة الماوس إلى القفص الذي تم تسخينه باستخدام مصباح الحرارة.
- رصد كل فأر بعد العملية حتى يستعيد وعيه الكامل والتنقل وعدم وضع الفئران ثاور لم يشف بعد التخدير في قفص مع غيرها من الحيوانات.
- علاج الفئران مع أدوية علاج الألم بعد العمليات الجراحية حسب الحاجة. توفير الفئران مع المسكنات بعد الجراحة مثل اسيتامينوفين في مياه الشرب بتركيز 1.6 ملغ / مل.
- كرر الخطوات من 2،3-2،9 لكل الماوس المستفيدة.
- ضمان عودة الفئران إلى النشاط العادي في حدود 1 ساعة بعد الجراحة. مراقبة الوزن بعد الجراحة، المهارات الحركية، وكذلك الشرب والتغذية نشاط كل الماوس لتحديد المضاعفات التي تنشأ نتيجة لإجراء عملية زرع.
ملاحظة: فقدان الوزن بعد العملية، بالمقارنة مع الوزن قبل العملية، وكذلك التنقل تغييرها أو عدم تناول الطعام أو الشراب قد يشير مضاعفات. - مراقبة T إعادة الخلايا في الدم المحيطي النزيف الفئران عن طريق الذيل نيك يليه فصل الخلايا اللمفية باستخدام Lympholyte وسائل الاعلام فصل الخلايا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. إنجاز T خلية characterizaنشوئها قبل تلطيخ الخلايا الليمفاوية الأجسام المضادة مترافق fluorescently محددة للعلامات الخلايا التائية CD3، CD4، وCD8، فضلا عن الممي ميت يعيش مثل succinimidyl استر تنشيط fluorescently 8. التحليل كما هو مبين في الشكل (3) ويمكن تحقيق ذلك عن طريق النابضة على singlets، والخلايا الحية، وخلايا إيجابية CD3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نجاح هذا الإجراء يعتمد على الحد الأدنى من الصدمة الجراحية فضلا عن دقة تحديد المواقع من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى. يجب أن تقطع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية لضمان الحجم أقسام الغدة الصعترية لزرع احقا بشكل مناسب كما هو مبين في الشكل 1. وبعد التخطيطي في الشكل 1، التوتة من الفئران حديثي الولادة أو الكبار يمكن استخدامها لنجاح زرع تحت المحفظة مع نتائج engraftment الخلايا T متناسقة وقابلة للتكرار. كما ذكر، وتحديد المواقع المناسبة من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى مهم في الحفاظ على البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، وظيفة، والأوعية الدموية من الكسب غير المشروع. كما رأينا في الشكل 2، يجب وضع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية فوق الكلى، والأقرب إلى الغدد الكظرية (الأمامي من الكلى)، على الطرف الآخر من شق المحفظة (الخلفي من الكلى). عملية زرع الغدة الصعترية ناجحة، عندما يقترن مع بيئة مناسبة للدم، ويمكن صemain إنتاجية تزيد عن 30 أسبوعا 7.
بعد الزرع، ويتم تقييم engraftment من قبل تدفق cytometric يحلل خلايا T تم الحصول عليها من الدم المحيطي الشكل 3 والجدول 2 تدليل على مستوى نموذجي من الخلايا التائية engraftment لوحظ في الأجهزة والدم المحيطي في المتلقي زرع 6 أسابيع بعد الزرع. باستخدام هذه التقنية، لدينا مجموعة قد أظهرت سابقا حركية CD4 + CD8 + T وإعادة الخلايا في الدم المحيطي مع مرور الوقت في متلقى من التوتة حديثي الولادة وتعليم الكبار. لفترة وجيزة، وتعميم خلايا T ويمكن ملاحظة في محيط خلال أسبوع واحد بعد الجراحة وتستمر أعداد الخلايا CD4 + CD8 + T وزيادة حتى يتم إعادة تشكيل الطرفية مقصورة الخلايا T بالكامل في 5-6 أسابيع بعد زرع 7.
الشكل 2: موقف شق المحفظة ووضع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية يتم إدراج المقطع بحجم مناسب أعدت من الغدة الصعترية المانحة في الفضاء تحت المحفظة التي تم إنشاؤها بواسطة شق صغير في الكبسولة الكلى في نهاية الخلفي من الكلى (A). الأمامي إلى الكلى، والأقرب إلى الغدد الكظرية (ليس في الصورة) وعلى الطرف المقابل من شق المحفظة، هو الموقف الأمثل للالكسب غير المشروع التي يتم إدراجها تحت الكبسولة كما هو مبين في (B).
الشكل 3. تحديد engraftment ناجحة عن طريق T إعادة خلية في الطرفية أجهزة الدم واللمفاوية. تدفق البيانات cytometric هي احظ ممثل الخلايا التائية إعادة 6 أسابيع بعد الزرع في المتلقي SCID من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية NB. ولوحظت مستويات مماثلة من الخلايا التائية engraftment في الدم المحيطي، الطحال، العقدة الليمفاوية البنكرياس (PLN)، والعقدة الليمفاوية المساريقي (MLN) بعد زرع بنجاح من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية.
| ملقط تشريح غرامة |
| ملقط تشريح المتوسطة (2) |
| ملقط تشريح غرامة (تلميح منحنية) |
| Betadine الحل |
| 70٪ من الإيثانول |
| 18 إبرة قياس |
| تشريح المجهر ث / مصدر الضوء |
| ديماصات نقل sposable (2) |
| أدوية لعلاج الألم: أسيتامينوفين |
| مناديل معقمة |
| مصباح الحرارة |
| الحلاقة الكهربائية |
| الأيزوفلورين والمرذاذ isoflurane |
| الغرز (سريع الامتصاص، الأمعاء عادي) |
| تشريح مقص |
| 9 مقاطع مم الفولاذ المقاوم للصدأ الجرح |
| الجرح كليب أداة إزالة |
| العقيمة برنامج تلفزيوني 1X |
| 60 ملم صحن |
الجدول 1: المواد اللازمة خلال زرع الغدة الصعترية الجراحي قائمة المواد الضرورية المستخدمة لزرع الغدة الصعترية تحت كبسولة الكلى من الماوس المتلقي. يتم سرد كمية من المواد المحددة بين قوسين.
| توتال عدد خلايا CD4 T | إجمالي عدد خلايا CD8 T | |
| دم | 1652 خلية / υl | 351 خلية / υl |
| طحال | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
الجدول 2. إجمالي عدد خلايا T الحالية في الطرفية الدم واللمفاوية أجهزة لعملية زرع المتلقي الغدة الصعترية. مجموع عدد CD4 + CD8 + T والخلايا المستخرجة من الأجهزة وكذلك الدم المحيطي من حديثي الولادة الغدة الصعترية زرع المتلقي لما بعد 6 أسابيع الزرع. هذه الأرقام هي تمثيلية من CD4 + CD8 + T والخلايا الخلوية التي عادة ما لوحظ في متلقى الغدة الصعترية حديثي الولادة والبالغين ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H.
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J.
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A.
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
