Abstract
Os mecanismos que regulam a eficácia da selecção do timo permanecem mal definidos. O método aqui apresentado permite em análises in vivo do desenvolvimento e selecção das células T específicas para auto-antigénios e estrangeiras. A abordagem implica o implante de enxertos de timo derivados de várias ratos envelhecidos em recipientes SCID imunodeficientes. Ao longo de um período relativamente curto de tempo, os destinatários são completamente reconstituído com células T derivadas do enxerto de timo implantado. Apenas timócitos semeando o timo no momento de isolamento submetidos a selecção e se desenvolvem em células T maduras. Como tal, as alterações na natureza e especificidade das células T enxertadas como uma função do timo de eventos dependentes da idade, pode ser avaliada. Embora perícia técnica é necessária para o transplante bem sucedido do timo, este método proporciona uma estratégia única para o estudo in vivo, uma vasta gama de patologias que são devido a um resultado ou de função e / ou aberrante do timo homeostasé.
Introduction
O timo é um órgão em que os eventos críticos no desenvolvimento de células T ocorrem 1. Timócitos residente, mediante rearranjo do receptor de células T (TCR) e dos genes α β, passam por uma série de interacções com lymphostromal e células apresentadoras de antigénio (APC) nas regiões corticais e medulares do timo 2. Selecção positiva tímico é mediada por células epiteliais tímicas corticais (TEC) para produzir timócitos que reconhecem péptidos antigénicos no contexto do complexo de histocompatibilidade principal hospedeiro (MHC) de classe I e moléculas II 2-3. Subsequente selecção tímica negativa envolve purga de timócitos auto-reactivas, impulsionado por uma interacção com a TEC medular ou células dendríticas (DC) que apresentam péptidos derivados de auto-proteínas ligadas por MHC de classe I e moléculas 3 II. O resultado final destes processos é o estabelecimento de uma pool de células maduras CD4 + e CD8 + T capazes de responder a um espectro amplode antigénios estranhos enquanto exibem reactividade mínima para auto-proteínas 4.
A eficiência de eventos de selecção do timo é influenciada por uma série de factores, incluindo maturação do timo, a frequência de medular e cortical do TCE, composição subconjunto de DC timo, e a fonte de precursores do timo 3. Notavelmente, a seleção do timo aberrante pode resultar em auto-imunes 5 ou imunodeficientes patologias, que surgem a partir de selecção negativa ou positiva prejudicada, respectivamente. Os eventos moleculares que regulam a selecção tímica, no entanto, são pouco compreendidos. Em abordagens in vitro, tais como culturas de órgãos tímicos reaggregate (RTOC) 6, têm provado ser úteis para analisar os acontecimentos básicos associados com a selecção tímica, mas não totalmente recapitular a dinâmica do curso em eventos in vivo. Como resultado, esta abordagem baseada em transplante de timo foi criada para melhores eventos estudo de seleção de timócitos in vivo 7
Este protocolo descreve o transplante thymi de camundongos recém-nascidos e adultos doadores em ratinhos receptores SCID imunodeficientes. Esta técnica permite o estudo de mecanismos que regulam a selecção tímica positiva e negativa, bem como a saída do timo de vários subconjuntos de células T durante a ontogenia. Mais recentemente, esta abordagem tem sido utilizado para demonstrar que a eficácia de selecção tímica é limitado logo depois do nascimento em ratinhos conduz a um aumento do desenvolvimento de células T auto-reactivas, e um reduzido repertório de células T específicas para antigenes estranhos 7.
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Protocol
Os estudos de murino foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de North Carolina em Chapel Hill e todos os cuidados com os animais estava em conformidade com as orientações IACUC.
1. Preparação do recém-nascido e Adulto Thymi
- Prepare todos os reagentes e equipamentos antes da eutanásia de ratos doadores.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos por autoclavagem ou outros métodos apropriados. Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados sob uma câmara de fluxo laminar, para manter as condições estéreis e evitar a contaminação. Monte as ferramentas necessárias para a extração de thymi de camundongos doadores.
- Encha um prato de 60 milímetros com estéril 1x PBS (pH 7,4) e colocar no gelo no interior do exaustor. Isto será usado para armazenar brevemente timos excisado a partir de ratinhos dadores antes do transplante.
- De acordo com as orientações éticas, sacrificar os ratinhos dadores recém-nascidos e adultos por decapitação ratos doadores por asfixia com CO2, seguido por deslocação cervical.
- Para removal do timo: Coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma toalha de papel absorvente estéril e spray com etanol 70% antes de fazer uma incisão.
- Expor a cavidade torácica e abdominal, fazendo uma incisão na linha média através da pele. Dobrar a pele sobre o peito e os membros anteriores para revelar a cavidade torácica.
- Faça duas incisões laterais através do diafragma e da caixa torácica para expor o mediastino superior e anterior cavidade torácica. O timo deve ser visível como dois lóbulos branco imediatamente acima e adjacente ao coração.
- Desmembrar o tecido conjuntivo em torno do timo com uma pinça fina, tornando certas para não perturbar a cápsula. Embora retendo o tórax com uma pinça, utilizar um segundo par de fórceps para extrair os dois lóbulos do timo posicionando pinças curvas por baixo do órgão e puxando verticalmente. Isto pode ser feito usando um escopo de dissecação para a extracção de timos de ratos recém-nascidos.
- Inserir o timo no 60 milímetros dish estéril contendo 1x PBS (pH 7,4) em gelo e lóbulos tímicos separadas por corte através do istmo conjuntivo. Remover todos os detritos dos lobos do timo tornando certas para não danificar a cápsula, e cortar o timo para o número adequado de secções para transplante.
- Não manipular o thymi obtidos a partir de ratos recém-nascidos.
NOTA: Usado para um máximo de dois ratinhos receptores (1 lobo por beneficiário). - Transplantar a thymi obtidos a partir de ratos adultos, até um máximo de 4-6 ratinhos receptores. Utilizando um par de pinças, cuidadosamente compreender um adulto lóbulo do timo, como mostrado na Figura 1, o corte timo em três partes iguais, usando tesouras cirúrgicas.
- Repita os passos de 1,3-1,4 para cada camundongo doador. A fim de limitar o tempo timos estão expostos, preparar um doador de timo de cada vez.
2. Thymus implantação sob a cápsula renal
- Montagem do equipamento de pré-esterilizado listados na Tabela 1. Assépticastécnica deve ser utilizada durante o decurso do processo, para prevenir a exposição a receptores de transplantes-ferramentas ou reagentes contaminados.
- Antes do transplante, pesar e etiquetar cada rato destinatário.
- Configure o microscópio de dissecação e circuito de anestesia na capela de fluxo laminar.
- Usando um barbeador elétrico, raspar o lado esquerdo do mouse destinatário e garantir que não haja cabelo permanece ao redor da área usada para fazer a incisão.
- Ligue vaporizador isofluorano e anestesiar o rato usando uma dose de entre 1-2%. Verificar anesthetization adequada antes de iniciar o procedimento cirúrgico através da verificação de uma ausência de reflexo seguinte toe pitada.
- Após o mouse está devidamente anestesiados, aplique pomada veterinária aos olhos do mouse para prevenir o ressecamento e preparar o mouse para o transplante da seguinte forma:
- Posicione o mouse sob o microscópio de dissecação em posição de decúbito lateral direito, de modo que o lado raspada está voltado para cima. Starting no centro da área cirúrgica, dispensar em um movimento circular usando uma pipeta de transferência descartável etanol a 70%, seguido de povidona-iodo (Betadine). Repita o tratamento de etanol / betadine 3 vezes antes de fazer uma incisão.
- Usando uma tesoura de dissecção fazer uma incisão flanco 1-2 cm diretamente acima do rim.
- Usando fórceps médias agarrar tecido conjuntivo adjacente ao rim e suavemente levantar o rim de modo a que ela se encontra no topo da musculatura. Para manter o rim exposta e no lugar sobre a musculatura, insira um braço de fórceps médio debaixo do rim, com especial atenção para não perturbar o ílio renal.
- A fim de evitar a dessecação do tecido, irrigar o rim com estéril 1x PBS (pH 7,4) durante cada passo até que a manipulação do rim e rim cápsula é completa.
- Usando fórceps finos apertar e levantar a cápsula perto da borda do rim mais distai para as glândulas supra-renais para separá-lo do rim.
- Utilize um calibre 18agulha para fazer uma incisão grande o suficiente para inserir a peça preparada de timo do doador (Figura 2A). Certifique-se de manter a incisão capsular tão pequeno quanto possível para impedir a deslocação do enxerto ao longo do tempo.
- Mantendo a cápsula puxada para fora do rim, utilizar um segundo par de uma pinça fina para inserir o enxerto por baixo da cápsula e empurrar o timo o mais à frente a partir da incisão capsular quanto possível (Figura 2B).
- Remover a pinça de debaixo do rim, e retornar suavemente o rim de volta no lugar através da incisão.
- Fechar a musculatura suturando a parede peritoneal e aplicando betadine uma vez fechada. Após a sutura está completa, aplicar agrafos para fechar a derme e aplicar betadine para a área circundante.
- Devolver o mouse para uma gaiola que foi aquecido usando uma lâmpada de calor.
- Monitorar cada rato pós-operatório até que recupere a consciência plena e mobilidade e não coloque ratos that não se recuperaram após anestesia em uma gaiola com outros animais.
- Tratar ratos com pós-operatório drogas de gerenciamento de dor, conforme necessário. Fornecer ratinhos com analgésicos pós-operatórias tais como acetaminofeno na água de beber numa concentração de 1,6 mg / ml.
- Repita os passos de 2,3-2,9 para cada rato destinatário.
- Certifique-se de que o retorno ratos para atividades normais dentro de 1 hora de pós-operatório. Monitorar o peso pós-operatório, as habilidades motoras, assim como a actividade de beber e a alimentação de cada murganho para determinar as complicações que surgem como um resultado do procedimento de transplante.
NOTA: perda de peso no pós-operatório, quando comparado ao peso pré-operatório, bem como a mobilidade alterada ou falha para comer ou beber pode indicar complicações. - Monitorar a reconstituição de células T no sangue periférico por sangramento através de ratinhos cauda entalhe seguido de separação de linfócitos, utilizando Lympholyte meios de separação de células de acordo com as especificações do fabricante. Realizar T caracteriz celularção através de coloração de linfócitos com anticorpos conjugados fluorescentes específicos para os marcadores de células T CD3, CD4, e CD8, bem como um discriminador morto vivo, tais como um éster de succinimidilo activado por fluorescência 8. Análise conforme mostrado na Figura 3 pode ser conseguido por meio de propagação em singuletos, células vivas e células CD3 positivas.
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Representative Results
O sucesso deste procedimento é dependente de trauma cirúrgico mínima, bem como o posicionamento preciso do enxerto por baixo da cápsula do rim. O enxerto de timo deve ser cortado para assegurar tamanho adequado secções do timo para transplante subsequente, como mostrado na Figura 1. Seguindo o esquema na Figura 1, timos de ratos recém-nascidos ou adultos podem ser utilizadas para transplante subcapsular com sucesso o enxerto de células T resultados consistentes e reproduzíveis. Como mencionado, o posicionamento apropriado do enxerto por baixo da cápsula do rim é importante na manutenção da sobrevivência a longo prazo, função, e vascularização do enxerto. Como pode ser visto na Figura 2, o enxerto de timo deve ser colocada no topo do rim, mais próxima das glândulas supra-renais (anterior de rim), na extremidade oposta a partir da incisão capsular (posterior do rim). Um transplante de timo bem sucedido, quando combinada com um ambiente hematopoiético adequado, pode remain produtiva em excesso de 30 semanas 7.
Após o transplante, o enxerto é avaliada por análise de citometria de fluxo de células T obtidas a partir de sangue periférico. Figura 3 e na Tabela 2, demonstram o nível típico de enxerto de células T observada em órgãos e sangue periférico num receptor de transplante de seis semanas pós-transplante. Usando esta técnica, o nosso grupo anteriormente mostrado a cinética das células T CD4 + e CD8 + a reconstituição de células no sangue periférico ao longo do tempo em receptores de transplante de timos recém-nascido e adulto. Resumidamente, as células T circulantes podem ser observados na periferia dentro de uma semana após a cirurgia e os números de células CD4 + e CD8 + continuar a aumentar até que o compartimento de células T periféricas, é completamente reconstituído em 5-6 semanas pós transplante 7.
Figura 2:. Posição de incisão capsular e colocação do enxerto tímico Uma secção de tamanho apropriado preparado a partir do timo do doador é inserido no espaço subcapsular criado por uma pequena incisão na cápsula renal na extremidade posterior do rim (A). Anterior ao rim, mais próxima das glândulas supra-renais (não representado) e na extremidade oposta a partir da incisão capsular, é a posição óptima para o enxerto que é inserida por baixo da cápsula, como mostrado em (B).
Figura 3. Determinar o enxerto bem sucedido via T reconstituição de células em sangue e órgãos linfóides periféricos. Citometria de fluxo de dados são representativos de células T reconstituição observada 6 semanas pós-transplante em um destinatário scid de um enxerto de timo NB. Níveis semelhantes de enxerto de células T são observados no sangue periférico, baço, nódulo linfático pancreático (PLN), e o nódulo linfático mesentérico (MLN) após o transplante com sucesso de um enxerto de timo.
| Uma pinça fina Dissecting |
| Dissecting forceps Médio (2) |
| Fórceps de dissecação finas (ponta curvada) |
| Solução Betadine |
| 70% Etanol |
| Agulha de calibre 18 |
| Dissecando microscópio w / fonte de luz |
| Disposable pipetas de transferência (2) |
| Medicamentos para o manejo da dor: Acetaminophen |
| Toalhetes estéreis |
| Lâmpada de calor |
| Barbeador elétrico |
| Isoflurano e isoflurano vaporizador |
| Suturas (rápida absorção, intestino liso) |
| Dissecando Scissors |
| 9 clipes mm de aço inoxidável ferida |
| Ferida ferramenta de remoção de clipe |
| Estéril 1x PBS |
| 60 milímetros Dish |
Tabela 1:. Materiais necessários durante o transplante de timo cirúrgica Lista de materiais necessários usados para implantar o timo por baixo da cápsula renal do mouse destinatário. A quantidade de materiais especificados está listado em parênteses.
| Total Número de células T CD4 | Número total de células T CD8 | |
| Sangue | 1.652 células / υl | 351 células / υl |
| Baço | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
Tabela 2. número total de células T presentes no sangue e órgãos linfóides periféricos de um receptor de transplante de timo. Os números totais de células recuperadas a partir dos órgãos de CD4 + e CD8 +, bem como de sangue periférico de um receptor de transplante de timo recém-nascido seis semanas pós- transplante. Estes números são representativos das células T CD4 + e CD8 + T celularidade célula que é tipicamente observado em receptores de transplante de timo de recém-nascidos e adultos bem sucedidos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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