Abstract
Механизмы, которые регулируют эффективность тимуса выбора остаются плохо определены. Метод, представленный здесь позволяет в естественных условиях анализов разработки и отбора Т-клеток, специфичных для себя и чужеродных антигенов. Подход влечет за собой имплантацию тимуса трансплантатов, полученных от различных старых мышей в иммунодефицитных SCID получателей. За сравнительно короткий период времени получатели полностью восстанавливают Т-клеток, полученных из тимуса имплантированного трансплантата. Только тимоцитов посева тимус во время изоляции испытывают выбор и развиваться в зрелые Т-клеток. Таким образом, изменения в природе и специфичность Т-клеток привитых в зависимости от возрастных тимуса событий может быть оценена. Хотя техническая экспертиза необходима для успешного тимуса трансплантации, этот метод обеспечивает уникальную стратегию для изучения в естественных условиях широкий спектр патологий, которые из-за или в результате аномальной функции тимуса и / или гомеостазесть.
Introduction
Тимус является органом, в котором критические события в развитии Т-клеток происходят 1. Резиденты тимоциты, на перестройкой Т-клеточного рецептора (TCR) α и β генов, пройти серию взаимодействий с lymphostromal и антиген-представляющих клеток (APC) в коркового и мозгового регионов тимуса 2. Тимуса позитивной селекции опосредуется корковых эпителиальных клеток тимуса (TEC) для получения тимоцитов, которые распознают антигенные пептиды в контексте принимающей главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и II молекул 2-3. После тимуса влечет за собой негативный отбор очистку аутореактивных тимоцитов, приводимый от взаимодействия с медуллярной TEC или дендритных клеток (ДК), которые представляют пептидов, полученных из собственных белков, связанных с МНС класса I и II молекул 3. Конечным результатом этих процессов является создание пула клеток зрелой CD4 + и CD8 + Т способны реагировать на широкий спектрчужеродных антигенов время экспонирования минимальный реактивность собственных белков 4.
Эффективность тимуса событий отбора зависит от целого ряда факторов, в том числе тимуса созревания, частота мозгового и коркового TEC, подмножества состава тимуса, округ Колумбия, и источник тимуса прекурсоров 3. Следует отметить, что аберрантных тимуса выбор может привести к аутоиммунных 5 или иммунодефицитных патологий, возникающих из нарушенной отрицательной или положительной селекции, соответственно. Молекулярные события, регулирующие тимуса выбор, однако, плохо изучены. В пробирке подходов, таких как перегруппировываться тимуса культур органов (РИПЦ) 6, оказались полезны для анализа основных событий, связанных с вилочковой выбора, но не в полной мере воспроизводят динамику продолжается в естественных событий. В результате, это тимуса трансплантации подход был создан для более событий исследование отбора тимоцитов в естественных условиях 7
Этот протокол описывает пересадки thymi от новорожденных и взрослых мышей-доноров в иммунодефицитных SCID мышей-реципиентов. Эта методика позволяет исследовать механизмы, которые регулируют положительные и отрицательные тимуса выбор, а также в тимусе различных Т-клеточных подмножеств в онтогенезе. Совсем недавно этот подход был использован, чтобы продемонстрировать, что эффективность отбора тимуса ограничена в ранние сроки после рождения у мышей приводит к увеличению развития аутореактивных Т-клеток, и снижение Т-клеток репертуар специфичен для чужеродных антигенов 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышиные исследования были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл и все по уходу за животными была в соответствии с руководящими принципами IACUC.
1. Подготовка новорожденных и взрослых Thymi
- Подготовьте все реагенты и оборудования перед эвтаназии мышей-доноров.
- Стерилизовать хирургических инструментов в автоклаве или других соответствующих методов. Все хирургические процедуры должны выполняться под колпаком с ламинарным потоком для поддержания стерильных условиях и избежать загрязнения. Соберите необходимые инструменты для извлечения из thymi мышей-доноров.
- Заполните 60 мм блюдо с стерильных 1x PBS (рН 7,4) и поместите на лед внутри капюшона. Это будет использоваться, чтобы кратко магазина thymi вырезали из мышей-доноров до трансплантации.
- По этических принципов, усыпить новорожденных мышей-доноров путем обезглавливания и взрослых доноров мышей CO 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Для гemoval тимуса: Положите мышь в спинной лежачем положении на стерильной впитывающей бумажной салфеткой и спрей с 70% этанола до принятия разрез.
- Expose брюшной и грудной полости, делая срединный разрез через кожу. Сложите кожи на груди и передних конечностей, чтобы выявить грудной полости.
- Сделайте две боковые разрезы через диафрагму и грудную клетку, чтобы разоблачить превосходную средостение и передней грудной полости. Тимус должна быть видна в виде двух белых лепестков непосредственно над и рядом с сердцем.
- Дразнить кроме соединительной ткани, окружающей тимус с тонким пинцетом, убедившись, что не нарушить капсулу. В то время как сдерживает грудную клетку с пинцетом, используйте вторую пару щипцов извлечь две доли тимуса путем размещения изогнутые щипцы под орган и потянув вертикально. Это может быть сделано с помощью рассекает возможности для извлечения thymi от новорожденных мышей.
- Поместите тимус в 60 мм диш, содержащий стерильный 1x PBS (рН 7,4) на льду и отдельных тимуса долях путем перерезания соединительной перешейка. Удалите мусор из тимуса долях убедившись, чтобы не повредить капсулу, и сократить тимус в соответствующее число секций для трансплантации.
- Не манипулировать thymi полученную от новорожденных мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используется для максимум двух мышей-реципиентов (1 лепестков каждого получателя). - Пересадка в thymi полученной от взрослых мышей в максимум 4-6 мышей-реципиентов. Используя пару щипцов, тщательно понять одного взрослого тимуса лепесток, как показано на рисунке 1, вырезать тимус на три равные части, используя хирургические ножницы.
- Повторите шаги 1.3-1.4 для каждого донора мыши. Для того, чтобы ограничить время thymi подвергаются, подготовить 1 донорской тимус одновременно.
2. Тимус Имплантация Под почки Capsule
- Соберите заранее стерилизовать оборудование, перечисленное в таблице 1. Правильное асептическийТехника должна быть использована в течение процедуры, чтобы предотвратить разоблачение пересадкой получателей загрязненных инструментов или реагентов.
- До трансплантации, взвесить и маркировать каждый получатель мышь.
- Настройка рассекает микроскоп и анестезии замыкание в ламинарный.
- Использование электрической бритвой, бритье левую сторону мыши получателя и убедиться в отсутствии волос не остается вокруг области, используемой для изготовления разрез.
- Включите изофлуораном испаритель и обезболить мышь, используя дозу между 1-2%. Определить правильную обезболивания перед началом хирургической процедуры по проверке на отсутствие рефлекса следующей ног крайнем случае.
- После мышь правильно наркозом, применять мазь ветеринарная для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость и подготовить мышь для трансплантации следующим образом:
- Расположите курсор под микроскопом рассекает в правой боковой лежачем положении, так что побрился стороной вверх. ЗАПУСКнг в центре хирургической области, обойтись в круговом движении с использованием одноразовые пипетки 70% этанола, а затем повидон-йода (бетадин). Повторите этанол / бетадин лечение 3 раза до принятия разрез.
- Использование рассечения ножницами сделать 1-2 см фланговый разрез непосредственно над почкой.
- Использование средних щипцов понять соединительной ткани, прилегающих к почке и осторожно поднимите почку так, что она лежит на вершине мускулатуры. Чтобы сохранить почку подвергается и в месте над мускулатурой, вставить одну руку из средних щипцов под почкой, уделяя особое внимание, чтобы не нарушить почечную подвздошной кости.
- Для того чтобы предотвратить высыхание ткани, орошают почку стерильной 1x PBS (рН 7,4) в течение каждой стадии до манипуляций с почек и почечную капсулу завершена.
- Использование тонких щипцов зажать и поднять капсулу на краю почки наиболее дистальной в надпочечники, чтобы отделить его от почки.
- Используйте 18 калибриглы, чтобы сделать надрез, достаточно большой, чтобы вставить подготовленную часть донорской тимуса (рис 2А). Убедитесь, чтобы капсульный разрез как можно меньше, чтобы предотвратить смещение имплантата в течение долгого времени.
- Держа капсулу оторвался от почки, использовать вторую пару тонких щипцов для вставки трансплантата под капсулой и нажать тимус, как далеко вперед от капсульного разреза, насколько возможно (фиг.2В).
- Удалите пинцетом из-под почки, и осторожно вернуть почку на место через разрез.
- Закройте мускулатуру путем наложения швов в брюшную стенку и применения бетадин раз закрыт. После наложения швов завершена, применяются раны клипы, чтобы закрыть дермы и применять бетадин в окрестностях.
- Верните мышь в клетку, которая была подогретой с помощью тепла лампы.
- Монитор каждый послеоперационную мышь, пока он не восстановит полное сознание и подвижность и не ставьте мышей ТНАт не восстанавливается следующим анестезии в клетку с другими животными.
- Лечить мышей с послеоперационными наркотиков управления боль по мере необходимости. Обеспечение мышей послеоперационных анальгетиков, таких как ацетаминофен в питьевой воде в концентрации 1,6 мг / мл.
- Повторите шаги 2.3-2.9 для каждой мыши-реципиента.
- Убедитесь, что у мышей, возвращение к нормальной деятельности в течение 1 ч после операции. Монитор послеоперационную вес, двигательные навыки, а также питьевой и кормления активность каждой мыши, чтобы определить, осложнения, возникающие в результате процедуры трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационный потеря веса, по сравнению с дооперационной веса, а также измененной подвижностью или отказа, чтобы поесть или напиток может указывать осложнений. - Монитор Т-клеток воссоздание в периферической крови кровотечение мышей с помощью хвоста ник с последующим разделением лимфоцитов с использованием Lympholyte разделения клеток СМИ в соответствии с требованиями завода-изготовителя. Осуществлять Т-клеток characterizaции лимфоцитов окрашиванием с флуоресцентно конъюгированных антител, специфичных к Т-клеток маркеров CD3, CD4, и CD8, а также живой мертвой дискриминатора, таких как флуоресцентно активированным сукцинимидил эфира 8. Анализ, как показано на рисунке 3 может быть достигнуто с помощью стробирования на синглеты, живых клеток и CD3-положительных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех этой процедуры зависит от минимальной хирургической травмы, а также точного позиционирования трансплантата под почечную капсулу. Тимуса трансплантата должны быть сокращены, чтобы обеспечить соответствующего размера тимуса разделы для последующей трансплантации, как показано на рисунке 1. После схеме на рисунке 1, thymi от новорожденных или взрослых мышей могут быть использованы для успешной пересадки субкапсулярной с последовательной и воспроизводимые результаты приживления Т-клеток. Как уже упоминалось, соответствующее расположение трансплантата под почечную капсулу играет важную роль в поддержании долгосрочное выживание, функции и васкуляризации трансплантата. Как показано на фиг.2, тимуса трансплантата должен быть помещен на вершине почки, ближайшей к надпочечников (передний почки), на противоположном конце от капсульного разреза (задней почки). Успешное тимуса трансплантации, в сочетании с соответствующим кроветворной среде, может гEmain продуктивным свыше 30 недель 7.
После трансплантации, приживления оценивали с помощью проточной цитометрии анализ Т-клеток, полученных из периферической крови. Фиг.3 и в таблице 2 показывают типичный уровень Т приживления клеток, наблюдаемой в органах и периферической крови у реципиента трансплантата 6 недель после трансплантации. Используя эту технику, наша группа ранее показано на кинетику CD4 + и CD8 + Т-восстановления клеток в периферической крови с течением времени в трансплантации получателей новорожденных и взрослых thymi. Вкратце, циркулирующие Т-клетки можно наблюдать на периферии в течение одной недели после операции и числа CD4 + и CD8 + Т-клеток продолжать расти до тех пор, периферическая Т-клеток отсека не будет полностью восстановлена в после трансплантации 5-6 недель 7.
Рисунок 2:. Положение капсульного разреза и размещение трансплантата тимуса соответствующего размера раздела получают из донорской тимуса вставляется в субкапсулярной пространство, созданное небольшой разрез в капсулу почки у заднего конца почки (A). Впереди почки, ближайшей к надпочечников (не показано) и на противоположном конце от капсульного разреза, это оптимальное положение для трансплантата, который вставляется под капсулу, как показано в позиции (В).
Рисунок 3. Определение успешного приживления помощью Т-клеток восстановления в периферической крови и лимфоидных органах. Цитометрии потока данных являются репрезентативными восстановления Т-клеток наблюдается через 6 недель после трансплантации в SCID получателю NB тимуса трансплантата. Аналогичные уровни Т приживления клеток наблюдаются в периферической крови, селезенки, поджелудочной железы лимфатический узел (PLN), и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) после успешной трансплантации из вилочковой трансплантата.
| Изобразительное щипцы Препаровальный |
| Средние Режущая щипцы (2) |
| Изобразительное щипцы Режущая (изогнутые кончик) |
| Бетадин Решение |
| 70% этанола |
| 18 игла |
| Пройдя микроскоп ж / источника света |
| Диsposable пипетки передачи (2) |
| Препараты для лечения боли: ацетаминофен |
| Стерильные салфетки |
| Тепло лампы |
| Электробритва |
| Изофлюран и ИФ испаритель |
| Швы (быстро поглощающий, простой кишка) |
| Анатомические ножницы |
| 9 мм из нержавеющей стали раны клипы |
| Рана инструмент для удаления клипа |
| Стерильные 1x PBS, |
| 60 мм блюдо |
Таблица 1:. Материалы, необходимые при хирургической трансплантации тимуса Перечень необходимых материалов, используемых для имплантации тимус под почечную капсулу мыши-реципиента. Количество указанных материалов указаны в скобках.
| Тотал Количество CD4 Т-клеток | Общее количество CD8 Т-клеток | |
| Кровь | 1652 клеток / υl | 351 клеток / υl |
| Селезенка | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| МЛН | 2182266 | 532059 |
Таблица 2. Общее количество Т-клеток, присутствующих в периферической крови и лимфоидных органов реципиента трансплантата вилочковой. Всего числа клеток, выделенных из органов CD4 + и CD8 + Т-а также периферической крови новорожденного получателя вилочковой трансплантата 6 недель пост- Трансплантация. Эти цифры представитель CD4 + и CD8 + Т-клеток клетками, которые, как правило, наблюдается в успешных новорожденных и взрослых тимуса реципиентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
