Abstract
Les mécanismes qui régulent l'efficacité de la sélection thymique restent mal définis. La méthode présentée ici permet dans les analyses in vivo du développement et de la sélection des cellules T spécifiques de soi et des antigènes étrangers. L'approche implique l'implantation de greffes de thymus provenant de souris âgées dans divers destinataires SCID immunodéficientes. Au cours d'une période relativement courte de temps les destinataires sont entièrement reconstituées avec des cellules T dérivées du thymus greffon implanté. Ensemencement Seulement thymocytes le thymus au moment de la sélection et de l'isolement subissent développer en cellules T matures. En tant que tel, les changements dans la nature et la spécificité des cellules T greffées en fonction de l'âge thymiques événements dépendants peuvent être évaluées. Bien que l'expertise technique est nécessaire pour la transplantation thymique succès, cette méthode fournit une stratégie unique d'étudier in vivo un large éventail de pathologies qui sont dues à un ou résultat de la fonction et / ou homeostas thymique aberranteest.
Introduction
Le thymus est un organe dans lequel les événements critiques dans le développement des cellules T se produisent 1. Thymocytes résidents, sur réarrangement du récepteur des cellules T (TCR) α et β gènes, sont soumis à une série d'interactions avec des cellules de lymphostromal et présentant l'antigène (APC) dans les régions corticales et médullaires du thymus 2. Sélection positive thymique est médiée par les cellules épithéliales thymiques corticales (TEC) pour produire thymocytes qui reconnaissent des peptides antigéniques dans le contexte de l'hôte du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II molécules 2-3. Après sélection négative thymique implique purge des thymocytes autoréactifs, entraînée par une interaction avec TEC médullaire ou des cellules dendritiques (DC) que les peptides présents dérivés de protéines du soi liés par le CMH de classe I et II 3 molécules. Le résultat de ces processus final est la création d'un pool de cellules matures CD4 + et CD8 + T en mesure de répondre à un large éventaildes antigènes étrangers tout en présentant une réactivité minimale de quatre protéines du soi.
L'efficacité des événements de sélection thymiques est influencée par une multitude de facteurs, y compris la maturation thymique, la fréquence des médullaire et corticale TEC, la composition de sous-ensemble de thymique DC, et la source des précurseurs thymiques 3. Notamment, la sélection thymique aberrante peut entraîner des auto-immunes 5 ou immunodéficientes pathologies, qui découlent de la sélection négative ou positive avec facultés affaiblies, respectivement. Les événements moléculaires régulant la sélection thymique, cependant, sont mal comprises. Approches in vitro tels que des cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) 6, se sont avérées utiles pour l'analyse des événements de base associés à la sélection thymique, mais ne parviennent pas à récapituler pleinement la dynamique des cours dans les événements vivo. En conséquence, cette approche basée sur la transplantation-thymique a été créé afin de mieux les événements de sélection des thymocytes d'étude in vivo 7
Ce protocole décrit la transplantation thymus de souris donneuses nouveau-nés et les adultes dans des souris immunodéficientes SCID bénéficiaires. Cette technique permet l'étude des mécanismes qui régissent la sélection thymique positive et négative, ainsi que la sortie du thymus de différents sous-ensembles de cellules T au cours de l'ontogenèse. Plus récemment, cette approche a été utilisée pour démontrer que l'efficacité de la sélection thymique est limitée tôt après la naissance chez la souris conduit à un développement accru de lymphocytes T auto-réactifs, et un répertoire des cellules T réduite spécifiques pour des antigènes étrangers 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les études murins ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et de tous les soins des animaux était en conformité avec les lignes directrices du IACUC.
1. Préparation du nouveau-né et de l'adulte Thymi
- Préparer tous les réactifs et le matériel avant l'euthanasie souris donneuses.
- Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclavage ou d'autres méthodes appropriées. Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions stériles et éviter la contamination. Assemblez les outils nécessaires pour l'extraction de thymus de souris donneuses.
- Remplir une boîte de 60 mm avec stérile 1x PBS (pH 7,4) et le placer sur la glace à l'intérieur du capot. Il sera utilisé pour stocker brièvement thymus excisé de souris donneuses avant la transplantation.
- Conformément aux lignes directrices éthiques, euthanasier souris donneuses nouveau-nés par des souris de décapitation et donneurs adultes par le CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale.
- Pour ra suppression du thymus: Posez la souris dans une position couchée dorsale sur une serviette de papier absorbant stérile et pulvériser avec 70% d'éthanol avant de faire une incision.
- Exposer la cavité abdominale et thoracique en faisant une incision de ligne médiane à travers la peau. Pliez la peau sur la poitrine et les pattes avant de révéler la cavité thoracique.
- Faire deux incisions latérales à travers le diaphragme et la cage thoracique pour exposer le médiastin supérieur et antérieur cavité thoracique. Le thymus doit être visible sous forme de deux lobes blanc immédiatement au-dessus et à côté du coeur.
- Démêler le tissu conjonctif qui entoure le thymus avec des pinces fines, afin d'être certain de ne pas perturber la capsule. Tout en maintenant la cage thoracique arrière avec une pince, utiliser une deuxième paire de pinces pour extraire les deux lobes du thymus par le positionnement des pinces incurvées sous l'organe de traction et verticalement. Cela peut être fait en utilisant un microscope à dissection pour extraire thymus de souris nouveau-nés.
- Placez le thymus dans le 60 mm dish contient 1x PBS stérile (pH 7,4) sur de la glace et des lobes thymiques séparés en coupant à travers l'isthme conjonctif. Enlevez les débris des lobes thymiques faisant certain de ne pas endommager la capsule, et couper le thymus dans le nombre approprié de sections pour la transplantation.
- Ne pas manipuler le thymus obtenu à partir de souris nouveau-nés.
NOTE: Utilisé pour un maximum de deux souris receveuses (1 lobe par bénéficiaire). - Transplanter le thymus obtenu à partir de souris adultes en un maximum de 4-6 souris receveuses. En utilisant une paire de pinces, saisir attentivement un adulte lobe thymique, comme le montre la figure 1, couper le thymus en trois parties égales à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
- Répétez les étapes 1.3 à 1.4 pour chaque souris donneuse. Afin de limiter le temps de thymus sont exposés, préparer 1 donateurs thymus à la fois.
2. Thymus implantation sous la capsule du rein
- Assembler le matériel pré-stérilisé énumérés dans le tableau 1. Aseptique appropriéetechnique devrait être utilisée au cours de la procédure pour éviter d'exposer transplantation bénéficiaires à des outils ou des réactifs contaminés.
- Avant la transplantation, peser et marquer chaque souris receveuse.
- Mettre en place le microscope à dissection et le circuit d'anesthésie dans la hotte à flux laminaire.
- Utiliser un rasoir électrique, de se raser le côté gauche de la souris receveuse et assurer pas de cheveux reste autour de la zone utilisée pour réaliser l'incision.
- Activer le vaporisateur isofluorane et anesthésier la souris en utilisant une dose comprise entre 1 à 2%. Déterminer anesthésie appropriée avant de commencer la procédure chirurgicale en vérifiant l'absence de réflexe suivante pincement de l'orteil.
- Après la souris est correctement anesthésié, appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de la souris pour prévenir la sécheresse et de préparer la souris pour la transplantation comme suit:
- Placez la souris sous le microscope de dissection dans une position couchée sur le côté droit de sorte que le côté rasé est orientée vers le haut. Starting dans le centre de la zone chirurgicale, passer dans un mouvement circulaire en utilisant une pipette de transfert jetable éthanol à 70%, suivie par la povidone iodée (Bétadine). Répéter le traitement éthanol / bétadine 3 fois avant de faire une incision.
- L'aide de ciseaux de dissection font un flanc incision de 1-2 cm au-dessus du rein.
- En utilisant des pinces moyennes saisir tissu conjonctif adjacent au rein et soulevez doucement le rein sorte qu'il se trouve au sommet de la musculature. Pour garder le rein exposé et mis en place au cours de la musculature, insérez un bras de pinces moyennes sous le rein, en accordant une attention particulière à ne pas perturber l'os iliaque rénale.
- Afin d'éviter la dessiccation du tissu, irriguer le rein avec PBS 1x stérile (pH 7,4) pendant chaque étape jusqu'à ce que la manipulation de la capsule rénale du rein et est terminée.
- En utilisant des pinces fines pincer et soulever la capsule à proximité du bord du rein la plus distale vers les glandes surrénales pour la séparer du rein.
- Utilisez une jauge 18aiguille pour faire une incision assez grand pour insérer la pièce préparée de donateurs thymus (figure 2A). Assurez-vous de maintenir l'incision capsulaire aussi faible que possible pour empêcher la dislocation de la greffe au cours du temps.
- Tout en maintenant la capsule arrachée de rein, en utilisant une deuxième paire de pinces fines pour insérer la greffe en dessous de la capsule et appuyer sur le thymus le plus en avant à partir de l'incision capsulaire que possible (figure 2B).
- Retirer les pinces de dessous le rein, et retourner doucement le rein en place à travers l'incision.
- Fermez la musculature en suturant la paroi péritonéale et l'application de la bétadine fois fermé. Après suture terminée, appliquer des agrafes pour fermer le derme et appliquer la bétadine à la zone environnante.
- Retourner la souris dans une cage qui a été chauffé en utilisant une lampe chauffante.
- Surveiller chaque souris post-opératoire jusqu'à ce qu'il retrouve la pleine conscience et la mobilité et ne placez pas la souris that ont pas récupéré après une anesthésie dans une cage avec d'autres animaux.
- Traiter les souris avec des médicaments de traitement de la douleur post-opératoire si nécessaire. Fournir des souris avec des analgésiques post-opératoires comme l'acétaminophène dans l'eau potable à une concentration de 1,6 mg / ml.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.9 pour chaque souris receveuse.
- Veiller à ce que les souris retour à une activité normale dans les 1 h post-chirurgie. Surveiller le poids post-opératoire, de la motricité, ainsi que l'activité de boisson et de l'alimentation de chaque souris pour déterminer les complications découlant de la procédure de transplantation.
REMARQUE: la perte de poids post-opératoire, par rapport à un poids pré-opératoire, ainsi que la mobilité altérée ou l'échec de manger ou de boire peut indiquer complications. - Surveiller T reconstitution de cellules dans le sang périphérique par des souris saignements via queue nick suivie d'une séparation des lymphocytes en utilisant Lympholyte médias de séparation des cellules selon les spécifications du fabricant. Accomplir T Établissement des caractéristiques de cellulestion par coloration des lymphocytes avec des anticorps conjugués à des marqueurs par fluorescence spécifiques de cellules T CD3, CD4, CD8 et, ainsi que d'un discriminateur mort direct tel qu'un ester de succinimidyle activé par fluorescence 8. Analyse comme représenté sur la figure 3 peut être réalisé par l'intermédiaire de déclenchement sur maillots de corps, des cellules vivantes et des cellules positives pour CD3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le succès de ce procédé dépend de traumatisme chirurgical minimal, ainsi que le positionnement précis de la greffe sous la capsule du rein. Le greffon thymique doit être coupé afin d'assurer convenablement dimensionné sections thymiques pour une transplantation subséquente comme représenté sur la Figure 1. En suivant le schéma de la figure 1, thymus de souris nouveau-nés ou les adultes peut être utilisé pour la réussite de la transplantation de sous-capsulaire avec les résultats de la prise de greffe des cellules T constants et reproductibles. Comme mentionné précédemment, le positionnement approprié de la greffe sous la capsule du rein est important dans le maintien de la survie à long terme, la fonction et la vascularisation du greffon. Comme on le voit sur la figure 2, le greffon thymique doit être placé au-dessus du rein, le plus proche des glandes surrénales (antérieures de rein), sur l'extrémité opposée de l'incision capsulaire postérieur (de rein). Une greffe réussie thymique, lorsqu'il est couplé avec un environnement hématopoïétique appropriée, peut rEmain productive au-delà de 30 semaines 7.
À la suite de la transplantation, la prise de greffe est évalué par analyse cytométrique en flux de cellules T obtenues à partir de sang périphérique. La figure 3 et le tableau 2 montrent le niveau typique de la prise de greffe de cellules T observé dans les organes et le sang périphérique chez un receveur de greffe 6 semaines après transplantation. En utilisant cette technique, notre groupe a déjà montré la cinétique de CD4 + et CD8 + T reconstitution de cellules dans le sang périphérique au fil du temps chez les receveurs de greffe de thymus nouveau-né et l'adulte. Brièvement, les cellules T circulantes peuvent être observées dans la périphérie en une semaine post-opératoire et le nombre de cellules CD4 + et CD8 + T continuent à augmenter jusqu'à ce que le compartiment des cellules T périphérique est entièrement reconstitué à 5-6 semaines après la transplantation 7.
Figure 2:. Position d'incision capsulaire et de placement d'un greffon thymique section de taille appropriée préparée à partir du thymus de donneur est introduit dans l'espace sous-capsulaire créé par une petite incision dans la capsule du rein à l'extrémité postérieure du rein (A). Antérieur, le rein, le plus proche des glandes surrénales (non représenté) et à l'extrémité opposée de l'incision capsulaire, est la position optimale pour le greffage qui est inséré au-dessous de la capsule, comme illustré dans (B).
Figure 3. Détermination de la prise de greffe réussie via T reconstitution de cellules dans le sang et les organes lymphoïdes périphériques. Flux de données de cytométrie sont représentatifs de T reconstitution cellulaire observée 6 semaines après la transplantation chez un receveur d'une greffe scid thymique NB. Des niveaux similaires de la prise de greffe de cellules T sont observées dans le sang périphérique, la rate, les ganglions lymphatiques pancréatiques (PLN), et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) à la suite d'une transplantation réussie greffon thymique.
| Pinces fines de dissection |
| Forceps moyennes de dissection (2) |
| Forceps de dissection fine (de pointe recourbée) |
| Solution de Bétadine |
| 70% d'éthanol |
| Aiguille de calibre 18 |
| Microscope de dissection w / source lumineuse |
| Dipipettes de transfert sposable (2) |
| Médicaments pour la gestion de la douleur: acétaminophène |
| Lingettes stériles |
| Lampe chauffante |
| Rasoir électrique |
| Isoflurane et de l'isoflurane vaporisateur |
| Sutures (absorption rapide, intestin plaine) |
| Ciseaux de dissection |
| 9 clips mm en acier inoxydable plaies |
| Outil de suppression du clip plaies |
| PBS 1x stérile |
| 60 mm Lave- |
Tableau 1:. Matériel nécessaire lors de la transplantation chirurgicale thymique Liste des matériaux nécessaires utilisées pour implanter le thymus sous la capsule du rein de la souris receveuse. La quantité de matériaux spécifiés est listé dans la parenthèse.
| Total Nombre de cellules T CD4 | Nombre total de cellules T CD8 | |
| Sang | 1652 cellules / υl | 351 cellules / υl |
| Rate | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
Tableau 2. Nombre total de lymphocytes T présents dans le sang et les organes lymphoïdes périphériques d'un receveur de greffe du thymus. Le nombre total de cellules récupérées à partir des organes de CD4 + et CD8 + T ainsi que le sang périphérique d'un receveur de greffe du thymus nouveau-né six semaines post- transplantation. Ces chiffres sont représentatifs de CD4 + et CD8 + T cellularité de la cellule qui est généralement observé chez les receveurs nouveau-nés et les adultes transplantation réussie thymiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
