Abstract
timik seçim etkinliğini düzenleyen mekanizmalar kötü tanımlanmış kalır. in vivo kendi kendine ve yabancı antijenleri için spesifik T hücrelerinin gelişmesine ve seçim analizleri burada sunulan yöntem sağlar. yaklaşım immünyetmezligi scid alıcıların içine çeşitli yaşlı farelerde türetilen timik greft implantasyonu gerektirir. Süresi nispeten kısa bir süre boyunca alıcı tam implante timus greft türetilen T hücreleri ile yeniden oluşturulmuştur. Sadece timositler, izolasyon anında timus tohum seçimi geçmesi ve olgun T hücreleri dönüşür. Bu nedenle, yaşa bağlı timik olayların bir fonksiyonu olarak aşılanan T hücrelerinin yapısı ve özgüllük değişiklikler değerlendirilebilir. Teknik uzmanlık başarılı timik transplantasyonu için gerekli olsa da, bu yöntem, in vivo olarak anormal timik fonksiyonu ve / veya homeostas sonucunda ya da bağlı olan patolojilerin geniş bir çalışma için benzersiz bir strateji sağlarolduğunu.
Introduction
Timus T hücre gelişiminde kritik olaylar 1 meydana geldiği bir organdır. Yerleşik timositleri, T hücresi reseptörü (TCR) α ve β genlerin tekrar düzenlenmesi üzerine timus 2 kortikal ve medüller bölgelerde lymphostromal ve antijen sunan hücreler (APC) ile etkileşimlerin, bir dizi geçer. Timus pozitif seçim ana majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I ve II moleküllerinin 2-3 bağlamında antijenik peptitleri tanıyan timositleri üretilmesi için kortikal timik epitelyum hücreleri (TEC) aracılık eder. Daha sonra timik negatif seçim medüller TEC veya dendritik hücrelerin (DC), MHC sınıf I ve II moleküllerinin 3 ile bağlanmış kendi proteinlerinden türetilen bu, mevcut peptidler ile bir etkileşim ile tahrik edilen reaktif timositlerin tasfiye gerektirir. Bu işlemlerin bir sonucudur geniş bir yelpazede cevap verebilmek olgun CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir havuz kurulmasıyabancı antijenlere kendi kendine proteinlerin 4 minimal reaktiviteye sahip iken.
timik seçim olayları verimliliği timus olgunlaşması, meduller ve kortikal TEC, timik DC alt kümesi bileşiminin sıklığı ve timik öncüleri 3 kaynağı gibi faktörlerin, bir dizi etkilenir. Özellikle, anormal timik seçim sırasıyla, bozulmuş negatif veya pozitif seçimden kaynaklanan otoimmun 5 veya immünyetmezligi patolojiler, neden olabilir. timik seçimi düzenleyen moleküler olaylar, ancak tam olarak anlaşılamamıştır. In vitro böyle reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) 6 olarak yaklaşımları, timik seçimi ile ilgili temel olayları analiz etmek için yararlı olabilir, ancak tam sürmekte dinamiklerini recapitulate başarısız kanıtlanmıştır in vivo olaylarda. Sonuç olarak, bu timik transplantasyon dayalı yaklaşım, in vivo 7 daha iyi çalışma timosit seçim olayları için kurulmuştur
Bu protokol bağışık yetmezliği scid alıcı farelere yenidoğan ve yetişkin donör farelerin Thymi nakli açıklanır. Bu teknik, pozitif ve negatif timik seçimi, hem de ontogeny sırasında çeşitli T hücresi alt kümelerinin timik çıkış düzenleyen mekanizmaların çalışmasına izin verir. En son olarak, bu yaklaşım, timik Seçimin verimi, erken otoreaktif T hücrelerinin artan gelişmesine yol açan, farelerde doğumdan sonra sınırlı olduğunu göstermek için kullanılır ve yabancı antijenlere 7 için azaltılmış T hücresi repertuarı spesifik edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
kemirgen çalışmalar Kuzey Carolina Chapel Hill Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve tüm hayvan bakımı IACUC kurallarına uygun olarak yapıldı.
Yenidoğan ve Erişkin Thymi 1. Hazırlanması
- Önce donör fareler euthanizing tüm reaktifler ve donanımları hazırlayın.
- Otoklav veya diğer uygun yöntemlerle cerrahi aletler sterilize edin. Tüm cerrahi prosedürler, steril koşullar korumak ve kirlenmeyi önlemek için bir laminar akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Donör farelerden alınan Thymi çıkarılması için gerekli araçları birleştirin.
- Steril 1x PBS (pH 7.4) 60 mm çanak doldurun ve başlık içindeki buz üzerine yerleştirin. Bu transplantasyondan önce donör farelerden kesilmiş kısa deposu Thymi için kullanılacaktır.
- Etik kurallar gereğince, CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 boğulma decapitation ve yetişkin donör fareler tarafından yenidoğan donör fareler euthanize.
- Rtimus emoval: Steril bir emici kağıt havlu üzerine dorsal yaslanmış pozisyonda fare Lay ve bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile sprey.
- Deri yoluyla orta hat kesi yaparak karın ve göğüs boşluğu Açığa. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs ve ön ayakları üzerinde cildi katlayın.
- Üstün mediasten ortaya çıkarmak ve göğüs boşluğu anterior diyafram ve göğüs kafesi üzerinden iki yanal kesiler olun. timus hemen üstünde iki beyaz lob olarak görünür ve kalp bitişik olmalıdır.
- Kapsülü bozmak için değil bazı yapım, ince forseps ile timus çevreleyen bağ dokusu dışında tease. Forseps ile göğüs kafesi geri tutarken, organ altında kavisli bir forseps konumlandırma ve dikey çekerek timus iki lobunun ayıklamak için forseps ikinci bir çift kullanın. Bu yeni doğmuş farelerden Thymi ayrılması için bir kesme kapsamı kullanılarak yapılabilir.
- 60 mm di timus yerleştirinsh bağ berzah ile keserek buz ve ayrı timik lobları üzerinde steril 1x PBS (pH 7.4) içeren. Kapsül zarar vermemek için bazı yapım timik lob herhangi enkaz kaldırmak ve transplantasyon için bölümlere uygun sayıda içine timus kesti.
- Yeni doğmuş farelerden elde edilen Thymi manipüle etmeyin.
NOT: İki alıcı farelere (alıcı başına 1 lob) en fazla kullanılır. - 4-6 alıcı farelerin maksimum olarak, yetişkin farelerden elde edilen Thymi nakli. Şekil 1'de gösterildiği gibi dikkatle, bir yetişkin timik lobunu kavramak, forseps bir çift kullanarak, cerrahi makas kullanarak üç eşit parçaya timus kesti.
- Yineleyin her donör fare için 1.3-1.4 adımları. Maruz Thymi zamanı sınırlamak amacıyla, bir defada 1 donör timus hazırlar.
Böbrek Kapsül altında 2. Thymus İmplantasyonu
- Tablo 1 'de listelenen önceden sterilize edilmiş donanım bir araya getirin. Uygun aseptikteknik, kontamine araç veya reaktif transplant-alıcıları açığa önlemek için prosedür sırasında kullanılmalıdır.
- Transplantasyon öncesinde, tartmak ve her alıcı fare etiketleyin.
- Laminer akış kaputu diseksiyon mikroskobu ve anestezi devresi ayarlayın.
- Bir elektrik ustura kullanarak, alıcı farenin sol tarafını tıraş ve hiçbir saç kesi yapmak için kullanılan alanı çevresinde kalmasını sağlamak.
- Isofluorane buharlaştırıcı açın ve 1-2 arasındaki% bir doz kullanılarak fare uyutmak. Önce ayak tutam aşağıdaki refleksinin yokluğu kontrol ederek cerrahi prosedürü başlamadan uygun anesthetization tespit.
- Fare düzgün uyuşturulduktan sonra, kuruluk önlemek ve şöyle nakli için fareyi hazırlamak için fare gözlerine veteriner merhem uygulayın:
- Traş yüzü yukarı bakacak şekilde sağ yanal yaslanmış pozisyonda mikroskop altında fare yerleştirin. Starting cerrahi alanın merkezinde, povidon-iyot (betadin) takip atılan bir aktarım pipet% 70 etanol kullanarak dairesel hareketlerle dağıtmak. Bir kesi yapmadan önce 3 kez etanol / betadine tedavi tekrarlayın.
- Kullanımı diseksiyon makas doğrudan böbrek üstünde 1-2 cm kanat kesi yapmak.
- Böbrek bitişik bağ dokusu kavramak ve kas üstüne yatıyor şekilde hafifçe kaldırın böbreği orta forseps kullanarak. Kas üzerinde maruz böbrek ve yerinde tutmak için, böbrek iliyum bozmaya değil özel dikkat, böbrek altında orta forseps bir kolunu yerleştirin.
- Doku kurumayı önlemek amacıyla, böbrek ve böbrek kapsülü manipülasyonu tamamlanana kadar her adım sırasında steril 1 x PBS (pH 7.4) böbrek yıkayın.
- Ince forseps tutam ve böbrek ayırmak için böbreküstü bezlerinin en uzak böbrek kenarına yakın kapsülü kaldırın kullanma.
- 18 ölçeri kullanınİğne donör timus (Şekil 2A) Hazırlanan parça eklemek için yeterince büyük bir kesi yapmak. Zaman içinde greft çıkık önlemek için mümkün olduğu kadar küçük kapsüler kesi tutmak için emin olun.
- Kapsülü tutarak böbrek uzağa çekti ederken, kapsül altında greft yerleştirin ve mümkün (Şekil 2B) olarak kapsül kesiden kadar ileri timus itmek için ince forseps ikinci bir çift kullanın.
- Böbrek altından forseps kaldırın ve yavaşça kesiden yerine geri böbrek dönün.
- Periton duvarını dikilmesi ve bir kez kapalı betadin uygulayarak kas kapatın. Dikiş tamamlandıktan sonra, dermis kapatın ve çevredeki betadin uygulamak için yara klipleri geçerlidir.
- Bir ısı lambası kullanarak ısındı edilmiş bir kafes fare dönün.
- Tam bilinç ve hareketlilik kavuşur kadar her post-operatif fare izleyin ve fareler tha koymayınt diğer hayvanlarla bir kafesin içine anestezi aşağıdaki kurtarıldı değil.
- Gerektiği gibi post-operatif ağrı yönetimi ilaçlarla fareler davranın. Örneğin 1.6 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, içme suyu içinde asetaminofen gibi ameliyat sonrası analjezikler ile fareler sağlar.
- Yineleyin her alıcı fare için 2,3-2,9 adımları.
- 1 saat sonrası ameliyat içinde normal aktivitesine bu fareler dönüşünü sağlayın. Nakli prosedürünün bir sonucu olarak ortaya çıkan komplikasyonları belirlemek için post-operatif ağırlık, motor becerileri, yanı sıra, her fare içme ve beslenme etkinliğini izlemek.
NOT: pre-operatif ağırlık yanı sıra değişmiş hareketlilik ya da yemek ya da içmek komplikasyonları gösterebilir başarısızlık kıyasla Ameliyat sonrası kilo kaybı,. - Kuyruk nick üreticinin talimatlarına göre limpholite hücre ayırma medyayı kullanarak lenfositlerin ayrılması ardından yoluyla farelerin kanama ile periferik kan T hücre sulandırılması izleyin. T hücresi characteriza başarmakBöyle bir floresan aktive sukkinimidil ester 8 gibi T hücre belirteçleri, CD3, CD4, CD8, hem de canlı ölü diskriminatör özgü floresan konjuge antikor ile lenfositlerin boyanarak tion. Şekil 3 'de gösterildiği gibi analiz tekli, canlı hücreler ve CD3 pozitif hücreler üzerinde geçiş yoluyla gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedürün başarısı az cerrahi travma gibi böbrek kapsülü altından greft doğru konumlandırma bağlıdır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, timik greft uygun temin müteakip transplantasyon için timik bölümleri boyutlu şekilde kesilmelidir. Şekil 1' de şematik sonra, yeni doğan veya yetişkin farelerden Thymi tutarlı ve tekrarlanabilir bir T hücre nakli sonuçları ile başarılı bir subkapsüler nakli için de kullanılabilir. Belirtildiği gibi, böbrek kapsülü altında greft uygun konumlandırma greft, uzun vadeli hayatta kalma, fonksiyon ve vaskülarizasyon sürdürülmesinde önemlidir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, timik greft böbrek, kapsüler insizyon zıt ucunda, böbrek üstü bezleri (böbrek anterior) en yakın (böbrek posterior) üstüne yerleştirilir. Başarılı timik nakli uygun bir hematopoetik çevre ile birleştiğinde, can r30 hafta 7 aşan üretken Emain.
Nakli takiben, melezleme periferal kan T-hücrelerinin akış sitometrik analizi ile değerlendirilir. Şekil 3 ve Tablo 2, bir organ nakli alıcısında 6 hafta transplantasyon sonrası organ ve periferik kanda gözlenen T hücre nakli tipik seviyesini göstermektedir. Bu teknik kullanılarak, grubumuz, daha önce yeni doğmuş ve yetişkin Thymi nakli alıcılarında zamanla periferik kan CD4 + ve CD8 + T hücre sulandırma kinetiklerini göstermektedir. Kısaca, dolaşımdaki T hücreleri, bir hafta sonra ameliyat içinde çevre gözlemlenebilir ve CD4 + ve CD8 + T hücre sayıları periferal T hücresi bölmesi tam 5-6 hafta sonra nakli 7 de yeniden kadar artmaya devam etmektedir.
Şekil 2:. Kapsüler insizyon ve timik graft yerleştirme Pozisyon verici timus hazırlanmış bir uygun boyutta bir bölümü böbrek (A) arka ucunda, böbrek kapsülü küçük bir insizyon tarafından oluşturulan subkapsüler boşluğa sokulur. Böbrek anterior, böbrek üstü bezlerinin yakın (değil) resimde ve kapsül kesi zıt ucunda, (B) 'de gösterildiği gibi kapsül altına yerleştirilir greft için en uygun pozisyondur.
Periferik kan ve lenfoid organlarda T hücre sulandırma yoluyla başarılı engraftman belirlenmesi Şekil 3.. Akış sitometrik verileri T hücre sulandırma temsilcisi NB timik greft bir scid alıcıda 6 haftalar sonrası nakli gözlenen vardır. T hücre nakli benzer seviyeleri, çevresel kan, dalak, pankreas, lenf düğümü (PLN) gözlenir ve mezenterik lenf düğümü (MLN) bir timüs greft başarılı bir şekilde nakletmenin takip.
| İnce Diseksiyon forseps |
| Orta Diseksiyon forseps (2) |
| İnce diseksiyon forseps (kavisli ucu) |
| Betadine Çözümü |
| % 70 Etanol |
| 18 gauge iğne |
| / Işık kaynağı w Diseksiyon mikroskobu |
| Disposable transferi pipetler (2) |
| Ağrı tedavisi için ilaçlar: asetaminofen |
| Steril mendil |
| Isı lambası |
| Tıraş makinesi |
| Izofluran ve izofluran buharlaştırıcı |
| Dikişler (hızlı emici, düz bağırsak) |
| Makas Kesme |
| 9 mm Paslanmaz Çelik Yara klipler |
| Yara klip temizleme aracı |
| Steril 1x PBS |
| 60 mm Bulaşık |
Tablo 1:. Alıcı fare böbrek kapsülü altında timus implant kullanılan gerekli malzemelerin cerrahi timus nakli sırasında ihtiyaç duyulan malzemeler listesi. Belirtilen maddelerin miktarı parantez içinde yer almaktadır.
| TotaCD4 T hücrelerinin l sayısı | CD8 T hücrelerinin toplam sayısı | |
| Kan | 1652 hücre / υl | 351 hücre / υl |
| Dalak | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364.918 |
| MLN | 2182266 | 532.059 |
Bir timüs nakli alıcısında periferik kan ve lenfoid organlarda bulunan T hücrelerinin Tablo 2. sayısı., CD4 + ve CD8 + T organlardan kazanılan toplam hücre sayıları ve yeni doğan bir timik nakli alıcısında periferik kan 6 hafta sonrası nakli. Bu sayı genelde başarılı yenidoğan ve yetişkin timik nakli görülmektedir, CD4 + ve CD8 + T hücre selülarite temsilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
