We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.
Fremstilling og karakterisering af konjugerede nano-biologiske systemer grænseflade metalliske nanostrukturer på faste bærere med immobiliserede biomolekyler rapporteres. Hele sekvensen af relevante eksperimentelle trin er beskrevet, som omfatter fremstilling af nanostrukturerede substrater under anvendelse af elektronstrålelitografi, immobilisering af biomolekyler på substraterne, og deres karakterisering udnytte overflade Raman spektroskopi (SERS). Tre forskellige designs af nano-biologiske systemer anvendes, herunder protein A, glucose bindende protein, og en dopamin bindende DNA aptamer. I de to sidstnævnte tilfælde bindingen af respektive ligander, D-glucose og dopamin, er også inkluderet. De tre typer af biomolekyler immobiliseres på nanostrukturerede substrater ved forskellige metoder, og resultaterne af SERS imaging rapporteres. Funktionerne i SERS at detektere vibrationsformer fra overflade-immobiliserede proteiner, såvel som at fange protein-ligand-end aptamer-ligand binding påvises. Resultaterne illustrerer også indflydelse af overfladen nanostruktur geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman aktivitet af molekyler og tilstedeværelsen eller fraværet af ligandbinding på SERS-spektre opnået.
Kapacitet til at udvikle og karakterisere konjugerede nano-biologiske systemer grænseflade solide nanostrukturer og biologiske polymerer bliver stadig vigtigere for yderligere fremskridt i næste generations bio-sensing og bio-aktivering teknologier 1,2. Dette indebærer tværfaglige studier på tværs af en række forskningsområder, såsom fremstilling af relevante solid state-komponenter (mikro-eller nano- elektroder, nano-manipuleret belægninger, nanotråde, eller nanopartikler) 2,3,4; immobilisering af biomolekyler på overfladerne for at skabe ønskede biokonjugater 5,6,7; og overvågning nano-biologiske grænseflader 1. I de fleste tilfælde, udvælgelse af optimale fabrikation, bio-funktionalisering og karakteriseringsmetoder er stærkt indbyrdes forbundne. Det er klart, ville valget af nanoproduktionsanlæg teknikker drevet af kravene i solid state komponenter i systemet, afhænger i vid udstrækning af påvisningsmetoden, der i tuRN er bestemt af arten af de involverede biopolymerer og formålet med at overvåge interface.
Ud af en bred vifte af teknikker, der anvendes til at karakterisere Bioconjugate systemer 1,3, overflade forstærket Raman spektroskopi (SERS) har vist sig som en meget lovende metode til påvisning af kemiske og biologiske arter på overflader 8,9,10,11. SERS beskæftiger uelastisk spredning af monokromatisk lys ved overfladeaktive immobiliserede biomolekyler (figur 1), gør det muligt at fange af unikke signaturer, der svarer til molekylære vibrationer. Denne evne til at skelne mellem forskellige molekyler uden at involvere etiketter, kompleks kemi eller tidskrævende trin, gør SERS en potentielt meget effektiv metode til bio-detektion. En anden vigtig fordel af SERS er dens høje følsomhed. Den excitation af lokaliserede overfladeplasmoner ved let interagere med ædle metal nanostrukturer (SERS substrater) stiger dramatisk intensity af Raman-spredning af analytten, hvilket tillader påvisning af meget små mængder af molekyler, fra monolag ned til single-molekyle grænse 8,9,10,11. Endelig fleste biomolekyler kræver vandige opløsninger at være stabil. Fordi vand har ofte begrænset Raman aktivitet er baggrund signal fra vandige prøver minimeres 9. Anvendelser af SERS har udvist en eksponentiel stigning i det seneste årti 10. , En meget omtalt udfordring SERS er imidlertid, at den elektromagnetiske forøgelse af Raman spredning afhænger kritisk af størrelse, form, og afstanden mellem metal nanostrukturer hvor plasmoniske bølger induceres 11,12,13. For at opnå effektive og reproducerbare SERS målinger, kontrol over underlaget geometri er nødvendig på nanoskala dimensioner.
Figur 1. Schæm overfladeaktivt Raman spektroskopi.
Talrige metoder til at fabrikere SERS substrater 11,12,13 kan groft inddeles i bottom-up og top-down metoder. Metoder til den første type anvender forskellige processer i selv-samling eller styret kemisk syntese til fremstilling af nanostrukturer. Ofte behandles eksempler omfatter immobilisering af monodisperse nanopartikler på faste bærere 11,12,13, termiske, sputter eller elektrokemisk aflejring af ru metalfilm 11,12, og forskellige kemiske syntesemetoder 13. Selv om sådanne teknikker tendens til at være relativt enkel og billig, er de fleste af dem udfordret af en manglende kontrol over placeringen af de strukturer, og begrænset prøve-til-prøve reproducerbarhed.
I modsætning hertil topstyrede litografiteknikker ansætte manipulerbare instrumenter såsom partikelstråler at skabe ønskede mønstre på overflader. En af de oftest anvendtenanolithography metoder, elektronstråle litografi (EBL), tilbyder fantastisk kontrol over funktioner ned til under 10 nm og også en fleksibilitet, således at forskellige substrat design på faste bærere 11,12. I EBL, en stråle af elektroner fokuseret ned til en plet af nogle få nanometer i scanninger diameter over en overflade af en elektron følsomt materiale (modstå) forårsager en kemisk ændring i udsatte områder. For positiv tone modstår såsom polymethylmethacrylat (PMMA), elektron resulterer stråle eksponering i opdeling af polymerkæderne tilsammen udgør modstå, hvilket fører til en øget opløselighed i et passende opløsningsmiddel (bygherre). Processen med elektron-litografi omfatter spin-coating af et ensartet lag af modstå på et substrat; eksponering af det målrettede modstå materiale i et vakuumkammer med en elektronstråle; og udvikling af prøven for at fjerne de opløselige regioner.
Dielektriske understøtninger nedenunder metalliske nanostrukturer, såsom kvartsglas, har been vist at øge intensiteten i SERS grund lokalisering af plasmoniske bølger i forhold til andre materialer, såsom silicium 14,15. Men EBL mønster på dielektriske substrater, især på nanoskala, indebærer betydelige udfordringer på grund af ophobning under eksponeringen. Tidligere har vi vist 16,17, at disse vanskeligheder kan overvindes ved at placere ledende polymerlag over modstå. Figur 2 viser en skematisk afbildning af den samlede fremstillingsproces ved hjælp af EBL eksponering og udvikling efterfulgt af metal deposition og liftoff at fremstille metalliske nanostrukturer på fusioneret silica understøtter. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Skema til eLectron litografi, metal deposition, og liftoff proces trin anvendes til at fabrikere metalliske nanostrukturer på dielektriske substrater 16-19. I dette papir præsenterer vi hele sekvensen af procestrin involverer SERS substrater fabrikation af EBL, bio-funktionalisering af substraterne, og indsamling af Raman spektre. Tre designs udforsket i vores seneste værker 18,19 behandles (se figur 3 og 4, og tabel 1). I Design 1 er rekombinant protein A immobiliseret på bio-funktionaliserede Au nanostrukturer på et fusioneret silica (FS) understøtning 18, og SERS påvisning af proteinet er påvist. I Design 2, rekombinant glucose-bindende protein 21,26,27 med og uden ligand (D-glucose) immobiliseres ved hjælp af histidinmærker i mellemrum mellem Ag nanostrukturer på Ni-belagte FS, og bindingen af glucose til proteinet detekteres. I Design 3 thioleret dopamin-bindende DNEn aptamer 19,23 immobiliseres på Au nanostrukturer på FS, og bindingen af dopamin ved immobiliseret aptameren demonstreres. Inklusive alle relevante eksperimentelle trin fra forberedelse substrat til Raman spektre erhvervelse, og repræsentant for forskellige biomolekyler og strategier immobilisering, disse eksempler er nyttige for en bred vifte af applikationer, fra udforskning forskning afhøre nano-biologiske grænseflader som SERS til udviklingen af SERS biosensorer af små molekyler, der beskæftiger protein- eller aptamer-ligand binding som en anerkendelse metode. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Ordninger af tre repræsentative designs ved hjælp af forskellige biomolekyler, metoder til immobilization, og substrat materialer: (A) protein A immobiliseret på ædelmetallet nano-prikker funktionaliseret af en selv-samlet monolag (SAM) den 11.-mercaptodekansyre (MUA) i DI vand; (B) histidin-mærket glucose bindende protein (GBP) kompleksbundet med D-glucose immobiliseret på substratoverfladen mellem ædle metal nano-prikker; (C) thiol-terminerede dopamin bindende aptamer afsluttes med dopamin (DBA) immobiliseret på ædle metal nano-prikker. Se yderligere detaljer i tabel 1. I Design 2 illustreret ved panel (B) blev en prøve uden den tilsvarende ligand også forberedt til sammenligning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4.Biomolekyler ansat i tre udførelser: (A) protein A; (B) glucose bindende protein og D-glucose; (C) dopamin bindende DNA aptamer og dopamin. Protein- tertiære strukturer i (a) og (b), er taget fra Protein Data Bank, FBF ID 1BDD 20 og 2HPH 21 henholdsvis og tegnet med VMD for LINUXAMD64 version 1.9.1 22. Aptameren sekundære struktur i (c) er forudsagt fra sekvensen 23 ved hjælp ValFold 24 software og tegnet med PseudoViewer 3.0 25. Bogstaverne G, A, T og C svarer til guanin, adenin, thymin, og cytosin nukleotider, henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Design 1 </td> | Design 2 | Design 3 | |
Biopolymer | Protein A | Glucose protein (DKK) | Dopamin binding aptamer (DBA) |
Binder | 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) selv-samlet monolag (SAM) | Histidinmærker | Thiol linkere |
Ligand | Ingen | D-glucose | Dopamin |
Opløsning | Deioniseret (DI) vand | Kaliumphosphatpuffer | Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) buffer; Phosphatbufret saltvand (PBS) |
Substrat | Au strukturer på FS | Ag strukturer på Ni-overtrukket FS | Au strukturer på FS |
Mønstret area | 4 um x 10 um | 4 um x 8 um | 4 um x 10 um |
Mønster | Au prikker, 50 nm beg | Ag prikker, 40 nm beg | Au sekskanter, 200 nm banen |
Ag sekskanter, 200 nm banen | Au ustrukturerede puder | ||
Ag ustrukturerede puder | |||
Doser EBL eksponering | Dots: | Dots: 105 pC / cm2 | Sekskanter: 180 pC / cm2 |
Array I 120 pC / cm2 | Sekskanter: 170 pC / cm2 | ||
Array II 96 pC / cm2 | |||
Array III 72pC / cm2 | |||
Laser excitationsbølgelængde | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tabel 1. Tre design af nano-biologiske systemer.
SERS vinder en anerkendelse som en ekstremt kraftfuld teknik af bio-afsløring tilbyder mange unikke fordele. I forhold til molekylære vibrationer tillader selektivt at identificere "fingeraftryk" af specifikke analytter fra SERS spektre, mens den ekstremt høje følsomhed gør det muligt at detektere meget små mængder af analysanden 9,10,11,35. Endvidere SERS er en destruktiv teknik, er også relativt ufølsom over for vand, og derved er det meget velegnet til sondering af biologiske materialer i deres naturlige vandige miljø 9. Resultaterne præsenteret understrege disse fordele samt yderligere at demonstrere stort potentiale for SERS som en meget fleksibel etiket-fri teknik med bio-detektion. I tre designs beskæftiger monolag af forskellige substrat-immobiliserede biomolekyler, er blevet registreret, kan trygt tilskrives de særlige analytter Raman tilstande. At detektion af disse biomolekyler, or deres ligander, er blevet påvist at anvende plane overflader af kvartsglas som støtte til SERS substrater, gør de design, der er kompatible med de aktuelle elektronik og mikrostrømning indstillinger, lovende talrige anvendelser i forbindelse med nye bioelektronisk arkitekturer interfacing biologiske materialer med overflader af elektronisk og elektrokemiske indretninger 2,3. Vigtigere er det, i to af tre motiver SERS afsløring er påvist specifik binding af små molekyler, såsom glucose og dopamin, der anvender monolag af overfladen-immobiliserede protein og aptamer henholdsvis som genkendelseselementer.
Dog bør flere aspekter tages hånd om for at opnå en effektiv SERS bio-detektion i indstillingen "on-chip". Først og fremmest en velkendt udfordring, som er fælles for de fleste biomolekyler er deres tilbøjelighed til at nedbrydes, især når de udsættes for ikke-naturlige forhold såsom tør miljøet eller intens laserlys. I hele protokollen har vi understreget betydningen af altid at holde bio-funktionaliserede prøver nedsænket i passende løsninger under hele forsøget, fra forberedelse af prøverne til erhvervelse af Raman spektre. For sidstnævnte har en brugerdefineret vandtæt kammer konstrueret (figur 7) for at undgå fordampning af væsken under laser eksponeringer. Varigheden af eksponering og laser intensitet bør også begrænses som beskrevet i trin 5.3 i protokollen for at undgå skader af prøverne.
Resultaterne af SERS påvisning findes følsomme geometri af substratet anvendes, og især inter-feature separation af de metalliske nanostrukturer. Som det fremgår af figur 8 og 9, at SERS intensiteten af design 1 prøver afhænger meget af bredden af mellemrummene mellem Au nano-prikker på kvartsglas. Ud af tre rækker af Au nanodots testede jegn dette design (figur 8), er den højeste Raman intensitet opnås med Array I, som har de smalleste huller mellem AU funktioner, og derfor giver en mere effektiv elektromagnetisk ekstraudstyr felt. Som figur 9 viser, er styring af inter-feature separationer på niveau med 10-20 nm eller mindre påkrævet. Anvender EBL til fremstilling SERS substrater, som påvist her, giver en effektiv opløsning specielt til styring af bredder af inter-feature huller. Med en positiv tone EBL modstå såsom PMMA, kan størrelsen af huller i PMMA masker varieres ved blot at ændre de eksponeringsdoser. Efter lift-off resulterer dette i forskellige størrelser af jern- og metalvarer prikker, og bredden af mellemrum mellem prikkerne kan indstilles efter ønske ved at vælge ordentlig EBL eksponering doser 18.
Den anden udfordring er optimering af SERS substrat geometri til specifik bio-afsløring ansøgning. Selvom ekstraudstyr effekt increases med et fald på de inter-feature huller, den relativt store størrelse af biologiske molekyler pålægger begrænsninger på, hvor snævert de huller kan være. Dette er tydeligt ud fra resultaterne af Design 2, hvor immobilisering metode er sådan, at proteinet effektivt kun binder til overfladen mellem ædelmetal prikker, men ikke til de prikker selv (se figur 3B). Som det fremgår af figur 10, må det SERS spektre for ustrukturerede Ag pads ikke vise bands fra analysanden. Selvom puderne udviser en nano-krystallinsk struktur med meget tynde huller mellem øerne (se figur 6F) disse huller er for snævre til at rumme et protein molekyle. Endnu en anden dimension af kompleksitet tilsættes når protein-ligand-binding skal detekteres. I figur 10 SERS CH bånd er mere udtalt i spektrene fra ligand-bundne GBP end i ligand-fri én, som kan hypotetisk forklares ved en ændring i GBP konformationved binding af D-glucose 2 7,27, hvilket resulterer i en mere stiv struktur med forøget Raman aktivitet. Hvis man sammenligner de to nanostrukturerede substrater, CH band fra ligand-fri protein er stærkere i SERS spektre opnået med nano-prikker substrat, mens både protein og glukose CH bands fra ligand-bundet protein er mere udtalt med nano-sekskanter substrat. To faktorer forventes at føre til disse forskelle, tilgængeligheden af plads mellem Ag funktioner, hvor GBP kunne binde til Ni, og modtagelighed for ligand-bundne og ligand fri protein til den elektromagnetiske forbedring af Raman spredning i "hot spots" mellem disse funktioner. På den ene side, nano-prikker mønster giver en relativt større inter-feature, hvor Ni belægning er tilgængelig for proteinet til at binde, hvilket kan forklare en mere udtalt CH bånd observeret for glucose-free GBP på Ag nano-prikker substrat. På den anden side, på grund af deres ikke-ensartet strukturen (se figur 6D), kan Ag nano-sekskanter være tilbøjelige til at vise en stærkere elektromagnetisk forbedring i smalle mellemrum mellem Ag øer inden nano-sekskanter resulterer i stærkere CH vibrationer bands fra glucose-bundne GBP på nano-sekskanter substrat. Nogle detaljer om dette samspil kræver yderligere kontrol, og optimering af SERS substrater for komplekse analytter involverer store proteiner såsom GBP er stadig i støbeskeen.
Det er klart, er SERS detektion af ligandbinding ansætte immobiliserede biomolekyler som genkendelseselement lettere, når kun liganden er Raman aktiv i et udvalgt område, mens de øvrige komponenter ikke. Dette er tilfældet for Design 3, hvor udtalte SERS bånd af aptamer-bundne dopamin opnås (figur 11). Aptameren-dopamin par udviser fremragende specificitet og SERS spektrum omfatter markante bands uden nogen signifikant baggrund signal.
<p class="jove_content"> Fremtidig forskud på etiketten-fee SERS teknologi ville indebære omfattende test af biomolekyler 'SERS signal enhancement med en bred vifte af forskellige overflade nanostruktur designs. Brugen af direkte-write elektronstråle litografi at fabrikere forskellige nanostrukturer med en fantastisk grad af kontrol over størrelse, form, og inter-feature separation, kombineret med prøveforberedelse protokoller præsenteres her, vil gøre det lettere sammenligning og krydsvalidering af de opnåede resultater af forskellige forskergrupper. Dette ville løse den store udfordring, reproducerbarhed, når SERS substrater er fremstillet under anvendelse af alternative "bottom up" metoder 11,12,13, der giver mulighed for en bedre styring af metal nanostruktur størrelse og placering mod en pålidelig identifikation af optimal substrat design til en bred vifte af anvendelser. Skalerbarhed af disse teknikker kan derefter forbedres ved at kombinere EBL med komplementære nanolithography metoder såsom nanoaftryk litografi 19 mod fremtidig masseproduktion af nanoskala design optimerede ansætte de afstemmelige EBL teknikker.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) | Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com) |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
Conductive polymer | Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp) |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com) |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
Fused silica wafers | Mark Optics www.markoptics.com |
||
Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532) |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
High vacuum grease | Dow Corning (www.dowcorning.com) |
Used to seal water-proof chamber, step 5.1 | |
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
Phosphate buffered | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
saline (PBS) | |||
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem (www.microchem.com) |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
Recombinant protein A | Protein Mods Inc (www.proteinmods.com) |
PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd) |
Biopolymer in Design 1 |
Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3 |
Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. | Used to cut FS wafer, step 1.1 | |
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) | |||
Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker (www.lesker.com) |
Used for Au and Ag evaporation | |
Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
12-545-102 | Used in water-proof chamber, step 5.1 |
Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
Used in water-proof chamber, step 5.1 | |
Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. (www.raith.com) |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures, step 2.2 |
Raman microscope | Thermo Scientific (www.thermoscientific.com) |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy, step 5.3 |
Sonicator system | Branson (www.bransonic.com) |
Used for liftoff and solutions mixing | |
Spinner | Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com) |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1 |