Summary
يصف هذا البروتوكول تطبيق الموجات فوق الصوتية عالية التردد (HFUS) للماوس التصوير الغدد الليمفاوية عنق الرحم. هذه التقنية يحسن التصور النوعي والكمي لعنق الرحم مورفولوجيا العقدة الليمفاوية، وحجم وتدفق الدم. ويتجلى أيضا صورة موجهة خزعة من العقد الليمفاوية العنقية ومعالجة الأنسجة الليمفاوية للتقييم النسيجي.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع عالية التردد الموجات فوق الصوتية (HFUS) كوسيلة من وسائل غير الغازية لتصوير الهياكل التشريحية الداخلية في نظم الحيوانات الصغيرة التجريبية. HFUS لديه القدرة على الكشف عن هياكل صغيرة مثل 30 ميكرون، وهي الممتلكات التي تم استخدامها لتصور الغدد الليمفاوية السطحية في القوارض في السطوع (B) -mode. الجمع بين دوبلر السلطة مع التصوير B-وضع يسمح لقياس تدفق الدم في الدورة الدموية داخل الغدد الليمفاوية وغيرها من الأجهزة. في حين HFUS وقد استخدمت لتصوير العقدة الليمفاوية في عدد من النظم نموذج الفأر، لم يتم الإبلاغ عن بروتوكول مفصلة وصف HFUS التصوير وتوصيف العقد الليمفاوية العنقية في الفئران. هنا، وتبين لنا أن HFUS يمكن تكييفها لكشف وتميز العقد الليمفاوية العنقية في الفئران. جنبا إلى جنب B-وضع والتصوير دوبلر طاقة يمكن استخدامها للكشف عن زيادة في تدفق الدم في العقد عنق الرحم الموسع مناعيا. نحن أيضا وصف استخدام التصوير B-وضع لإجراء الخزعات إبرة رفيعة من الليمفاوية عنق الرحم لادي لاسترداد الأنسجة الليمفاوية للتحليل النسيجي. وأخيرا، يتم وصف الخطوات بمساعدة برنامج لحساب التغيرات في حجم العقدة الليمفاوية وتصور التغييرات في العقدة الليمفاوية التشكل التالية إعادة الإعمار الصورة. القدرة على رصد التغيرات في عنق الرحم بصريا البيولوجيا العقدة الليمفاوية مع مرور الوقت وتقدم تقنية بسيطة وقوية لرصد غير الغازية من عنق الرحم التعديلات العقدة الليمفاوية في نماذج الماوس قبل السريرية لمرض تجويف الفم.
Introduction
التصريف اللمفاوي من السوائل النسيج الخلالي هو الأسلوب الرئيسي لنشر الميكروبات والسرطانات المعدية الناشئة في المنطقة عن طريق الفم والوجه والفكين 1،2. التقييم السريري الغدد الليمفاوية العنقية هو ممارسة التشخيص المستخدمة لتحديد وجود أو تطور الأمراض التي تنشأ في تجويف الفم. وهذا يؤكد على أهمية جمع الغدد الليمفاوية العنقية كمواقع التشريحية قيمة لتشخيص المرض عن طريق الفم 3. وتستخدم عدة منهجيات التصوير المتخصصة سريريا لتحديد الغدد الليمفاوية العنقية المريضة. وتشمل هذه التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)، التصوير المقطعي (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MR). بينما قيمة عالية، وهذه الطرق كلها أمور تتطلب إعداد واسعة المريض، ومعدات متخصصة للغاية و / أو التسريب الكيميائي إلى الدورة الدموية لتمكين أو تعزيز عملية التصوير.
التصوير سنوغرفيك] (الموجات فوق الصوتية، الولايات المتحدة) هي تقنية التي شاع تطبيقها لايمالغدد الليمفاوية العنقية بحسب العمر يقدم مع اعتلال عقد لمفية بسبب الإصابة أو مشاركة المنتشر 4-6. في كثير من الأحيان جنبا إلى جنب مع الولايات المتحدة PET-CT والتصوير بالرنين المغناطيسي لتوفير تمثيل شامل للالليمفاوية المريض حالة عقدة، مما يساعد على تحديد انطلاق الورم وضرورة الاستئصال الجراحي 7. طبيعة غير الغازية من الولايات المتحدة أيضا مزايا متأصلة على طرائق التصوير الأخرى، بما في ذلك سهولة الاستخدام والتكلفة المنخفضة، والحد الأدنى انزعاج المريض والتحضير. الموقع تحت الجلد السطحي في معظم الغدد الليمفاوية العنقية يسمح للولايات المتحدة لتوجيه التنظيرية الدقيقة خزعات بالإبرة مع زيادة الدقة، وتحسين دقة التشخيص 8.
التجاري عالية التردد (HF) على الولايات المتحدة قرار مفصل من الهياكل التشريحية الداخلية إلى 30 ميكرون 9. باستخدام محولات تتراوح 22-70 ميغاهيرتز، وقد HFUS تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من أنظمة القوارض التجريبية لإتاحة الوقت الحقيقي تصوير الأعضاء الداخلية في الجسم الحي.؛ وقد تم تكييف HFUS لرؤية تشكيل الورم في التقليدية سطوع (B) -mode، وكذلك مع عدد من عام والمتخصصة تعزيز النقيض agents9. باستخدام دوبلر السلطة مع HFUS يوفر القدرة على مراقبة تدفق الدم داخل الأورام الماوس، مما يسمح بإجراء تقييم شامل لنضح عائية في الفئران الحية 10،11. وقد استخدم HFUS لتصور العقد الليمفاوية الماوس المريضة داخل تجويف الجسم الرئيسي، مما يدل على فائدة موازية لهذه التكنولوجيا إلى الممارسة السريرية. ولا سيما التهابات والمنتشر الليمفاوية الحشوية التعديلات عقدة لوحظت في نماذج الفئران من سرطان الثدي إيواء 12،13، 14 البنكرياس والقولون والمستقيم والرئة 15 16 الأورام، وكذلك histocytomas ليفي 17، ونموذج الفأر العمر من موه الكلية المكتسبة 18 . هذه الأمثلة ترسيخ قيمة HFUS كأداة قوية لتحقيق الناجم عن الورم تضخم العقد اللمفية في طائفة واسعة من ريال عمانينظم دنت.
عدة نماذج من عدوى بكتيرية 19،20 والرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية (HNSCC) وقد وضعت 21،22 لدراسة هذه الأمراض في الإعداد قبل السريرية. وعلى النقيض من البشر والفئران تحتوي على ثلاثة الغدد الليمفاوية العنقية أن مسح الليمفاوية من أنسجة الفم تجويف (الفك السفلي، الفك السفلي تحت الفك السفلي والنكفية السطحية 23). في الآونة الأخيرة، أبلغنا استخدام HFUS لرسم خريطة للموقع ومورفولوجية هذه الغدد الليمفاوية، ورصد التغيرات في حجم العقدة الليمفاوية وتدفق الدم في نموذج الفأر التي يسببها مسرطنة من HNSCC 24. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لاستخدام HFUS لتحديد وتصوير وتحليل الغدد الليمفاوية العنقية في الفئران الحية. يوضح هذا البروتوكول أيضا على جدوى استخدام HFUS لإجراء -الصورة تسترشد خزعة بإبرة دقيقة من الماوس الموسع الغدد الليمفاوية العنقية، يسمح بمراقبة النسيجي للتغيرات في عنق الرحم الليمفاوية المحتوى عقدة والأمراض أنحاء رIME في نفس الحيوان. هذا البروتوكول هو قابلية للتكيف مع إتاحة الفرصة لدراسة تفصيلية لعنق الرحم أمراض العقدة الليمفاوية الناتجة من أي مرض التجويف الفموي الغازية في الفئران.
Protocol
وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية هو موضح في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة ويست فيرجينيا في إطار البروتوكولات 11-0412 و14-0514 وأجرى وفقا للمبادئ والإجراءات المبينة في دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام من الحيوانات.
1. إعداد الحيوانية
- تخدير ماوس واحدة في غرفة الاستقراء باستخدام 3٪ isofluorane مختلطة مع 1.5 لتر / دقيقة 100٪ الأكسجين. إزالة الحيوان من غرفة تحريض وضعها في موقف ضعيف على منصة التصوير مسخن الى 40 درجة مئوية، وحافظت بين 37-42 درجة مئوية (الشكل 2A). تأكيد التخدير بسبب عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميه.
- ضع الماوس خطم داخل الرؤوس متصلة بنظام التخدير. تطبيق التخدير للحفاظ على التخدير حالة مستقرة (1.5٪ isofluorane مختلطة مع 1.5 لتر / دقيقة 100٪ الأكسجين).
- تطبيق مواد التشحيم عين كل عين لمنع dryinز. تطبيق هلام الكهربائي إلى الأقطاب واستخدام الشريط لتأمين كل من الكفوف أربعة إلى القطب المقابل. سوف سادات القطب الكهربائي ECG نقل الحيوان إلى نظام التصوير للسماح رصد معدل ضربات القلب ومعدل التنفس. تليين وادخال مسبار درجة حرارة المستقيم للرصد المستمر لدرجة حرارة الجسم. درجة الحرارة العادية جسم الفأر هو 36.9 درجة مئوية. 1-2 ° C الاختلاف أمر طبيعي في حين تحت التخدير.
- استخدام كريم مزيل الشعر لإزالة الفراء من الرقبة من الفأرة. شطف منطقة الرقبة بشاش غارقة في الماء لإزالة الشعر وكريم مزيل الشعر الزائد. اختياريا، استخدم تطبيق إضافية من كريم مزيل الشعر لإزالة أي شعر الجسم المتبقية (الشكل 2B).
2. تحديد والحصول على الصور من الفأر عنق الرحم الغدد الليمفاوية عن طريق HFUS
- للبدء، وتطبيق طبقة من درجة حرارة هلام الموجات فوق الصوتية لمنطقة الرقبة تخلو من الفراء. استخدام تطبيق الليبرالية من جل للصورة المثلىجودة (الشكل 2C). تجنب إدخال فقاعات الهواء في هلام خلال التطبيق، والتي يمكن أن تتداخل مع التصوير بالموجات فوق الصوتية.
- ضبط منصة التصوير 20-30 درجة بحيث يتم وضع الماوس مع رفع الرأس قليلا. هذا الموقف يساعد على ضمان معدل التنفس الأمثل للماوس. وضع 40 ميغاهيرتز محول بالعرض في نظام تصاعد وانخفاض بعناية حتى يتم غمر أمام scanhead محول في هلام الموجات فوق الصوتية (الشكل 2C).
ملاحظة: تأكد من عدم الضغط الزائد على الرقبة الماوس، لأنه يمكن أن يسبب ضيق في التنفس لا لزوم لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للتصوير ليكون منطقة عازلة من هلام بين محول والفأر.
التصوير B-Mode و الكشف عن الغدد الليمفاوية:
- استخدام الكمبيوتر السيطرة على اقتناء البرمجيات HFUS، وضبط سطوع (B-) ضبط الوضع لالمعلمات التالية: كسب 22 ديسيبل، وعمق 10.00مم، عرض 14.08 ملم.
ملاحظة: يتم من اقترح هذه الإعدادات نقطة البداية، وربما تتطلب تعديل طفيف لالتقاط صور الأمثل بين التطبيقات المختلفة. مراقبة الغدد الليمفاوية العنقية العادية والهياكل ناقص الصدى البيضاوي بالقرب من سطح الجلد داخل حقل مفرط الصدى المحيطة بها. ظهور الغدد الليمفاوية المصابة يمكن أن تختلف بين النماذج. لمنهجية صورة عن العقد الليمفاوية في منطقة الرقبة اتبع الخطوات التالية:- استخدام المحور Y لمسح الرقبة في الجمجمة لالذيلية بطريقة تجاه المنطقة الصدرية. استخدام X-محور لتوسيط الصورة.
- تحديد المعالم الرئيسية: الشدق واللسان، والغدة الدرقية (أرقام 3A، B و C، على التوالي). إمالة منصة التصوير لضبط أفقيا السطح البطني من الرقبة الماوس، مما يجعل تظهر جانبي العنق حتى في صورة B-الوضع. مقدار إمالة يعتمد على علم وظائف الأعضاء من كل فأر الفردية.
- تحديد اللسان / الشدق المنطقة تجويف (الشكل 3A) ثم لاحظ موقع العددي على مقياس Y.
- تحديد الغدة الدرقية (الشكل 3C) ثم لاحظ موقع العددي على مقياس Y.
- حساب الفرق بين القيم التي تم الحصول عليها في (2.4.1) و (2.4.2) لتحديد الطول الكلي مم لمنطقة الرقبة المصورة.
- استخدام مقبض Y لتوسيط محول في مرحلة منتصف الطول الكلي المحدد.
- اضغط على "3D". أدخل الطول الإجمالي. ل3D خطوة الحجم واستخدام 0.076 ملم للحصول على كومة سلسلة صورة لمنطقة الرقبة كلها.
- مرة واحدة يتم المسح الضوئي، حدد الجانب الأيمن أو الأيسر من الرقبة وتوسيط محول على العقدة الليمفاوية الفردية للمصلحة، ثم رفع 40 ميغاهيرتز محول من الماوس. إزالة 40 ميغاهيرتز محول واستبدالها مع محول microscan 50 ميغاهيرتز (كما في موقف عرضية) للحصول على صور ذات دقة أعلى. تجديد هلام الموجات فوق الصوتية على العنق الماوس وتخفيض 50 ميغاهيرتز محول في هلام الموجات فوق الصوتية.
3D السلطة دوبلر التصوير
- بفحص سلوك 3D مع دوبلر السلطة إلى حجم الحمير والأوعية الدموية الفردية الغدد الليمفاوية العنقية على النحو التالي:
- اضغط على زر الطاقة على لوحة المفاتيح للحصول على نظام Dopper السلطة وضبط إعدادات الطاقة في الوضع التالي: PRF 4 كيلو هيرتز، دوبلر كسب 34 ديسيبل، 2D كسب 30 ديسيبل، وعمق 5.00 ملم، العرض 4.73 مم. ملاحظة: كما كان من قبل، هذه الإعدادات هي نقطة البداية واقترح، ويمكن تعديله حسب الحاجة لاقتناء الصورة الأمثل في نماذج مختلفة.
- تحديد موقع الأكثر الجمجمة نقطة العقدة الليمفاوية من الاهتمام والملاحظة الموقع على نطاق وY.
- تحديد موقع النقطة الأكثر الذيلية من نفس العقدة والملاحظةالموقع على نطاق وY.
- حساب الفرق المسافة لتحديد الطول الكلي للالعقدة الليمفاوية (راجع الخطوة 2.4.3).
- توسيط محول في مرحلة منتصف الطول الكلي العزم، وذلك باستخدام موقع Y النطاق.
- اضغط على "3D" وأدخل مجموع طول العقدة الليمفاوية. استخدام 0،051 مم للحجم الخطوة.
ملاحظة: نظرا لقربها من محول للمنطقة الصدر، قد يؤدي 50 ميغاهيرتز محول في صورة دوبلر غير مستقرة بسبب الكشف عن حركة التنفس العادية. يمكن القضاء على هذه باستخدام "التنفس المحاصرة" الخيار المتاح في إطار "الفسيولوجية" علامة التبويب. - تحيط العقدة الليمفاوية المحدد مع المربع الأصفر الذي يعين المنطقة ليتم تحليلها من قبل دوبلر السلطة وحدد "3D المسح الضوئي" للحصول على الصور. رفع محول الخروج من الماوس ونقله إلى الجانب الآخر من الرقبة. خفض محول على الماوس وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لمعهد العالم العربيالغدد الليمفاوية جنرال الكتريك على هذا الجانب من العنق.
- حفظ مجموعات الصور لتحليلها لاحقا.
3. عنق الرحم العقدة الليمفاوية خزعة
- حدد العقدة الليمفاوية المطلوب للخزعة والحفاظ على التصوير HFUS مع 50 ميغاهيرتز محول. اختار أكبر العقدة الليمفاوية عنق الرحم واضحة في كل جانب من الرقبة الماوس. يشير العقدة الليمفاوية توسيع عادة استجابة التهابية، وبالتالي هذه العقد هي مثالية للمرشحين الخزعة.
ملاحظة: لقد وجدت أنه من الصعب جدا إجراء الخزعات على العقد عنق الرحم أقل من 10 مم 3. - إعداد الإبر والمحاقن لخزعة من خلال وضع حقنة 1 مل مع المرفقة 27 G، و 0.5 بوصة إبرة في حامل حقنة. ضبط حامل إبرة لتوجيه الإبرة 90 درجة في الرقبة الماوس (الشكل 4A).
- إعداد برفع منصة الماوس بأكملها إلى مستوى الإبرة. تحقيق ذلك عن طريق إزالة محرك 3D والتحول إلى platf أطولمكتب إدارة السجلات، أو عن طريق وضع جسم صلب من ارتفاع مناسب تحت منصة قصيرة المقدمة. استخدام البلاستيك microfuge أنبوب رف لهذا الغرض. إذا لزم الأمر، وتناوب على منصة 180 درجة من أجل عقد الخزعة تقع على جانب العنق قبالة جهاز الإبرة.
- ضبط إعدادات الاستحواذ عن طريق اختيار "تفضيلات"، ثم اختيار "ماكس وعازلة الموسع". توسيع مجال الرؤية إلى عمق 8.00 ملم وعرض 9.73 مم. بدوره على دليل إبرة باستخدام الشاشة مفاتيح الاتصال الهاتفي. ودليل إبرة يتوقع مسار الإبرة على الشاشة ويسمح للمستخدم ليصطف العقدة الليمفاوية من الفائدة في الموقع الصحيح لخزعة.
- تأكد من أن العقدة الليمفاوية تبقى دائما في الرأي تركز العقدة الليمفاوية في منتصف أو قليلا إلى يسار الوسط في الشاشة (الشكل 4B). للحصول على حلقة سينمائية كاملة من هذا الإجراء، الصحفي قبل الزناد على لوحة المفاتيح النظام قبل البدء في خزعة.
- ضبط حامل الإبرة حتى يأتي رأس الإبرة في طريقة العرض والاتصالات الجلد (الشكل 4B). دفع الإبرة مع شركة، ودفع سريع لثقب الجلد. مواصلة التقدم في الإبرة حتى أيضا يثقب طرف الكبسولة (الشكل 4C) ومرئيا داخل النخاع (الشكل 4D).
- مرة واحدة يقع الإبرة بشكل صحيح ضمن عقدة، وسحب بلطف المكبس حقنة الظهر بين 200-300 ترسيم ميكرولتر لإجراء خزعة (الشكل 4D و4E). لاحظ أن المواد الخزعة هي عادة غير مرئية داخل الحقنة.
- بلطف إزالة الإبرة من الرقبة الماوس. طرد محتويات الحقنة في أنبوب 1.5 مل microfuge. إزالة الإبرة من الحقنة، وترك الإبرة في الأنبوب. جمع 1 مل من وسائل الإعلام الخزعة (من قسامة، منفصلة عن مصدر الأوراق المالية) بنفس الحقنة، ومن ثم أعد الإبرة إلى حقنة مع الحفاظ على إبرة في الالبريد الأنبوب.
- شطف المحاقن والإبر مع وسائل الإعلام الخزعة بطرد وسائل الإعلام الخزعة في أنبوب.
ملاحظة: لا تنسحب على المكبس في حين تعلق الإبرة في أي لحظة بعد الخزعة. وهذا يقلل من خطر فقدان المواد خزعة نظرا لصغر حجم العينة.
- شطف المحاقن والإبر مع وسائل الإعلام الخزعة بطرد وسائل الإعلام الخزعة في أنبوب.
- تأكيد الليمفاوية المحتوى العقدة عن طريق النسيجية (الشكل 4F) وتحليل من قبل وسائل إضافية (الكيمياء النسيجية، التدفق الخلوي، الخ) حسب مقتضى الحال.
- مرة واحدة خزعة كاملة، إيقاف التخدير وإزالة التحقيق في درجة الحرارة المستقيم. إزالة هلام الموجات فوق الصوتية الزائدة من الفأر مع الشاش وإزالة الشريط من كل مخلب.
- إزالة الماوس من منصة التصوير والعودة إلى القفص. قد يحدث نزيف الحد الأدنى من موقع خزعة، ولكن هذا يتوقف دون تدخل. مراقبة الماوس أثناء الانتعاش حتى يتم استئناف النشاط الكامل.
4. صورة تحليل عنق الرحم الغدد الليمفاوية
- حدد "3D تم إعادة بناء صورة" في أعلى الزاوية اليسرى، والنقر على زر "عرض جزء واحد". استخدام وظيفة التكبير لتكبير الصورة إذا رغبت في ذلك. تبديل "تخطيط العرض" لعرض الصورة إلا في B-الوضع، الذي يزيل تراكب دوبلر السلطة عن الأنظار. وهذا يجعل من السهل أن نرى حواف العقدة الليمفاوية خلال لاحقة تحليل 3-D. انتقل من خلال سلسلة صورة لتحديد بداية العقدة الليمفاوية.
- لتطويق العقدة الليمفاوية، انتقل إلى "إعدادات 3D" علامة التبويب. حدد "حجم"، ثم زر "ابدأ" إلى جانب "بالتوازي".
- رسم معالم حول منطقة المصالح داخل الصور الفردية عن طريق التمرير. تستمر حتى يتم وضع علامة على الصور التي تشمل العقدة الليمفاوية بأكملها. اختيار "إنهاء" لاستكمال التحليل.
- في الجزء السفلي من الصورة، وسوف يتم عرض 3D حجم و٪ الأوعية الدموية تلقائيا.
ملاحظة: 3D حجم يتوافق مع حجم العقدة الليمفاوية، ويمثل في المئة الأوعية الدموية نسبة العقدة الليمفاوية إيجابية لتدفق الدم عن طريق دوبلر السلطة. - تبديل "تخطيط العرض" لعرض التصوير دوبلر السلطة كما تراكب على الصورة B- واسطة. على وجهة النظر سطح مراقبة وجهة نظر الصافي للمنطقة حجم الفائدة. تصدير الصور في الموسومة ملف الصورة (TIF) أو شكل 3D المسح من الأفلام (افي) لاستخدامها مرة أخرى.
Representative Results
ويرد التخطيطي الشامل لإجراءات التصوير والخزعة في الشكل 1. وتشمل الخطوات الرئيسية في إجراء الإعداد المناسب من الماوس للتصوير، وتحديد الغدد الليمفاوية العنقية، وإعداد الصحيح و إجراء خزعة الإبرة، وتحليل B -mode ودوبلر الصور لقياس حجم وكمية من الأوعية الدموية داخل كل العقدة المحددة باستخدام برنامج كمبيوتر.
HFUS التصوير من الماوس الغدد الليمفاوية العنقية يتطلب تطبيق والحفاظ على التخدير المناسبة طوال فترة التصوير (الشكل 2A)، وكذلك إزالة كاملة من الشعر الذي يغطي منطقة الرقبة بالكامل (الشكل 2B). تطبيق الليبرالية من هلام الموجات فوق الصوتية لمنطقة نزعه يضمن إشارة واضحة HFUS أثناء إجراء (الشكل 2C).
وساعد HFUS التصوير من منطقة الرقبة من قبل التصور من المعالم التشريحية عنق الرحم التي تنتج الصور [سنوغرفيك مميزة. الشكل3 يبين أمثلة من الأجهزة الرئيسية (الشكل 3A-C)، والعقد الليمفاوية العنقية في B-وضع (الشكل 3D) ووضع دوبلر الطاقة (الشكل 3E).
في الوقت الحقيقي التصوير HFUS في الفئران تخدير يسمح لتسترشد خزعة بإبرة دقيقة من العقد العنقية على غرار ما يجري في الممارسة السريرية. ويظهر موضع إبرة الخزعة وتعلق حقنة جمع لمعدات microinjector مسيطرة في الشكل 4A. وتبين لاحقا B-وضع الصور سنوغرفيك] وضع مثالي إبرة قبل خزعة (الشكل 4B)، دخول رأس إبرة في العقدة الليمفاوية العنقية (الشكل 4C)، وموقف إبرة خلال خزعة (الشكل 4D). تظهر عن قرب صورة رأس الإبرة داخل لب العقدة الليمفاوية (الشكل 4E). تجهيز المكونات الخزعة التي cytospin يكشف عن مجموعات الخلايا اللمفاوية وفيرة والنسيج الضام المرتبطة بها، والتحقق من العقدة الليمفاوية ناجحةخزعة (الشكل 4F).
يسمح التحليل القائم الحاسوبية من الصور HFUS للحصول على معلومات مفصلة التي يمكن الحصول عليها فيما يتعلق بنية العقدة الليمفاوية، وحجم وتدفق الأوعية الدموية. باستخدام طريقة دوبلر السلطة وقياسات حجم 3D، الأوعية الدموية في المئة (PV) يمكن أن تحسب من سلسلة صورة يشمل العقد بأكمله (الشكل 5A). بالإضافة إلى ذلك، والتصوير 3D يسمح للالظاهري إعادة الإعمار العقدة الليمفاوية، وكشف عن العام تضاريس العقدة الليمفاوية (الشكل 5B).
الشكل 1: نظرة عامة التخطيطي من الخطوات المتبعة في HFUS التشخيص الليمفاوية عنق الرحم التصوير عقدة في الفئران وتشمل الخطوات الرئيسية 1: إعداد الفئران لتصوير HFUS والحصول على 40 و 50 صور ميغاهيرتز قرار من منطقة الرقبة يحتوي على ثلاثة الماوس الغدد الليمفاوية العنقية . 2: غرامة إبرة صورة موجهة خزعة من العقد الليمفاوية العنقية والتحليل النسيجي لاحقا من تحتاج فحص المواد. 3: بمساعدة الحاسوب تحليل الصور وإعادة الإعمار 3D من الصور العقدة الليمفاوية التي تم الحصول عليها في B-وضع ودوبلر لتحديد حجم العقدة الليمفاوية منها، والنسبة المئوية (٪) من تدفق الأوعية الدموية.
الشكل 2: لمحة عامة عن ارتفاع القرار في فيفو نظام التصوير الجزئي لعنق الرحم تقييم العقدة الليمفاوية والخزعة هو مبين (A) نظام HFUS مع الماوس تخدير على استعداد لعنق الرحم التصوير العقدة الليمفاوية. أظهرت أيضا هو microinjector (MI) ومرحلة 3D الحركية (3D MS) معدات ملحق. (B) عن قرب عرض من الماوس تخدير على استعداد لHFUS التصوير مع إزالة الشعر في منطقة الرقبة. (C) نفس الفأر مع محول 50 ميغا هرتز في مكان على الرقبة. لاحظ هلام الموجات فوق الصوتية إضافية تستخدم لتسهيل الرقبة منطقة التصوير.
718fig3.jpg "/>
الرقم 3: HFUS الممثل صور التشريح عنق الرحم في B-وضع ودوبلر السلطة. (A، B) وصور B-وضع تجويف الفم، والتي تبين الشدق (BC) واللسان (T) التي تصور التصوير الأقرب إلى تجويف الأنف. الغدد الليمفاوية العنقية ثلاثة الاطلاع على كل جانب من الرقبة (المسمى M، الفك السفلي، SM، تحت الفك السفلي، SP، النكفية السطحية)، تبدو وكأنها مجموعة من الهياكل ناقص الصدى في طائرة التصوير احدة كما هو مبين (B). (C) الغدة الدرقية (ث) كما تصور في منطقة الصدر العلوية، يبدو وكأنه، مولد للصدى هيكل على شكل فراشة الصلبة. (AC) وتصور مع 40 ميغاهيرتز محول. شريط النطاق = 1 مم. (D، E) صور الممثل العادي (D) والموسعة (E) الغدد الليمفاوية العنقية مع B-وضع ودوبلر الطاقة (الحمراء). الخطوط المنقطة توضح الغدد الليمفاوية الفردية. شريط النطاق = 0.5 مم.
الرقم 4: عنق الرحم خزعة العقدة الليمفاوية انشاء والتصوير وتحليل cytospin من المواد خزعة (A) منصة التصوير تبين حاقن الدقيقة ووضع الإبرة بالقرب من الرقبة الماوس. ويستخدم اسعة رف أنبوب microcentrifuge (كتلة البرتقال) لرفع قليلا منصة، مما وضع الإبرة الصحيح في حين لا يزال يسمح مساحة للمرحلة 3D المحرك. هذا الترتيب يقلل من الوقت الذي يقضيه إزالة المرحلة المحرك لكل الماوس. (B - D) كامل الصور HFUS الرقبة مأخوذة من شريط فيديو لعنق الرحم خزعة العقدة الليمفاوية باستخدام 50 ميغاهيرتز محول. (B) HFUS B-وضع صورة تظهر الإبرة وضعه إلى جانب الرقبة قبل الخزعة. رأس الإبرة هو هيكل مفرط الصدى أقل بقليل من منصب المرشد إبرة (الخط المتقطع الأخضر) فرضه أثناء التصوير للدلالة على مسار الإبرة. العقدة الليمفاوية هي في وسطالصورة. شريط النطاق = 1 مم. (C) دخول إبرة في العقدة الليمفاوية. (D) خزعة العقدة الليمفاوية العنقية. (E) خزعة التكبير من العقدة الليمفاوية العنقية. شريط النطاق = 0.5 مم. تحليل (F) Cytospin من تمثيلية المواد خزعة الليمفاوية يؤكد خزعة ناجحة. على نطاق وبار = 100 ميكرون.
الرقم 5: تحليل بالكمبيوتر 3D صور العقدة الليمفاوية العنقية (A) قطة شاشة التمثيلية للالعقدة الليمفاوية تحليلها باستخدام برامج الكمبيوتر. غالبا ما تكون محدودة عقدة باللون الأزرق. تظهر نتائج تحليل حجم 3D والأوعية الدموية في المئة (PV) كما هو مبين. (B) سطح صورة بالنظر إلى نفس العقدة بعد تحليل 3D. يجعل كامل حجم العقدة اللمفاوية على أساس القياسات التي اتخذت في A.
Discussion
بروتوكول صفها يسمح التصور والتقييم في الموقع من الفئران الغدد الليمفاوية العنقية باستخدام التصوير HFUS غير الغازية في. استخدام B-وضع وقوة التصوير دوبلر لتصور عنق الرحم مورفولوجيا العقدة الليمفاوية، ويوفر حجم والعقدة الليمفاوية تدفق الدم للتحليل التجريبي للنظم نموذج الفأر قبل السريرية مشابهة لتلك المستخدمة لتوصيف العقد المريض عنق الرحم في الممارسة السريرية. القدرة على رصد الغدد الليمفاوية cervial عن طريق خزعة الإبرة على ما يرام كما يوفر تقنية مفيدة للكشف عن تغيرات الخلايا المناعية وجود أنواع الخلايا أجنبية أو البكتيريا خلال تجويف الفم lymphadenopathies التي يسببها المرض في الفئران. سهولة الاستخدام وانخفاض التكلفة المرتبطة HFUS يسمح للفحص السريع لعنق الرحم وضع العقدة الليمفاوية في طائفة واسعة من النماذج الحيوانية.
A خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو النجاح في تحديد الأولي من العقد الليمفاوية العنقية في الصور HFUS. منشأة لديها مجموعة متنوعة من HFUS ترانsducers كما هو موضح، ولذا فإننا قد استخدمها للحصول على صور عالية الجودة. ومع ذلك، إذا كان محولات وصفنا غير متوفرة، فمن الممكن للتكيف مع التصوير باستخدام محولات أخرى. لهذا الغرض، وتعديل عمق الصورة وعرض للحصول على صورة وافية هو كل ما هو مطلوب. قد تختلف حل مثل هذه الصور، ولكن ينبغي أن يكون لا يزال من الممكن الحصول على صور ذات جودة عالية باستخدام HFUS. سوف المعالم تصوير تجويف الفم والغدة الدرقية تساعد إلى حد كبير في توجيه المستخدم إلى المنطقة المناسبة حيث يتم ترجمة الغدد الليمفاوية. على شكل بيضاوي مميزة، والطبيعة ناقص الصدى والمكان سطحية قريبة من سطح الجلد يسمح لتحديد تأكيدي السريع من العقد الليمفاوية العنقية داخل منطقة الرقبة المناسبة. في حين أن كل عقد ثلاثة قد تكون مرئية في طائرة التصوير احدة (الشكل 3B)، يتم التقاط عادة واحد أو اثنين من العقد أثناء التصوير. ويمكن إجراء تعديلات طفيفة للموقف محول للتمزقإيه التصوير مختلف الطائرات وضوحا، مما يسمح التصور من كافة العقد على جانب واحد من الرقبة.
على الرغم من أننا قد وجدت تقنية وصفها يمكن الاعتماد عليها لتحديد الغدد الليمفاوية العنقية، وهناك قيود محددة لأسلوب التصوير والخزعة. طبيعة سطحية من الماوس الغدد الليمفاوية العنقية تمنح الحركة المفرطة عند تطبيق حتى ضغط طفيف على الجلد عن طريق رئيس محول. هذا يمكن مواجهة ذلك عن طريق تطبيق ببطء رئيس محول في هلام الموجات فوق الصوتية على الرقبة الماوس حتى يتم التعرف على صور تاريخية. يمكن التنقل العقدة الليمفاوية أيضا تعقيد خزعة بإبرة دقيقة، خاصة عند استخدام محولات في دقة أعلى (50 ميغاهيرتز) مجموعة. يتم دفع الصور تركز الغدد الليمفاوية لخزعة عادة من مجال الرؤية بسبب قوة إبرة الخزعة اللازمة لثقب الجلد المغطي والكبسولة. هذا يمكن تداركه من قبل المواقع خارج مركز العقدة الليمفاوية نحو اتجاه دخول الإبرة،توفير مساحة لالعقدة الليمفاوية ليتم دفعها عبر كنهم يظلون داخل مجال الرؤية خلال الخزعة. في تجربتنا، والعقد اللمفاوية> 10 ملم 3 من الصعب جدا لخزعة، وكثيرا ما دفعت من قبل إبرة بدلا من اختراقها خلال النهوض الإبرة. وبالتالي، فمن الأفضل محفوظة خزعة للتضخم العقد اللمفاوية حيث الحجم> 10 ملم 3 لضمان ما يكفي من حجم الهدف عقدة والاستقرار في منطقة عنق الرحم. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يحتوي على المواد خزعة أرقام الخلية كافية للإجراءات التي تتطلب أعدادا أكبر خلية (على سبيل المثال، التدفق الخلوي).
وقد استخدم HFUS لتصور بنجاح HNSCC مثلي الأورام 25، ولديه القدرة على رصد عنق الرحم الانبثاث العقدة في الفئران مع الاورام عن طريق الفم 24. بالإضافة إلى الموجات فوق الصوتية، كما تم استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي لتصور مثلي تشكيل الورم عن طريق الفم وسرطان عنق الرحم الانبثاث العقدة الليمفاوية في الفئران الحية 26،27. باعتبارها alternنهج ative، والتصوير تلألؤ بيولوجي لديها ميزة واضحة على HFUS في أن تكون قادرة على تحديد مباشرة تطور الورم النقيلي وعبء على مر الزمن في نفس الحيوان. في حين مفيدة لا يمكن إنكاره، والتصوير تلألؤ بيولوجي غير قادر على قياس العديد من المعلمات التي تصور HFUS، بما في ذلك العقدة الليمفاوية التشكل، وأحجام عقدية أو تدفق الدم. يتطلب التصوير تلألؤ بيولوجي أيضا صناديق مظلمة المتخصصة للحفاظ على الفئران خلال التصوير، مما يجعل هذه التقنية غير مناسبة للتكيف لخزعة الإبرة على ما يرام.
وعلاوة على ذلك، يتطلب التصوير تلألؤ بيولوجي إنتاج الخلايا السرطانية التي تعبر عن ثابت انزيم luciferase المراسل، مما يسمح هذا الأسلوب لا يستخدم إلا في حالات xenografts مثلي مع الخلايا السرطانية-transfected luciferase المراسل في الفئران المناعة، أو مع أنظمة المعدلة وراثيا الأنسجة محددة محرض التي تحد من luciferase المراسل التعبير بطريقة المكانية والزمانية محددة لأنسجة الورم الأصلي. في المقابل، يمكن أن يكون HFUS شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي بالتعاون مع الصور تلألؤ بيولوجي في هذه النماذج، فضلا عن كونها قادرة على تصوير الغدد الليمفاوية العنقية في نماذج من الأورام الناجمة عن مادة مسرطنة عن طريق الفم في الفئران مع جهاز المناعة كاملة 28،29. في حين HFUS قد تكون أكثر قدرة على التكيف مع معظم نماذج الماوس من سرطان الفم، والمعلومات المشتركة التي يمكن الحصول عليها من تلألؤ بيولوجي وHFUS التصوير في النظم التي تعبر عن الخلايا السرطانية يمكن luciferase المراسل توفير صورة أكثر اكتمالا من عنق الرحم تورط العقدة الليمفاوية من أي طريقة التصوير وحدها.
القدرة على تحديد والكشف عن الماوس الغدد الليمفاوية العنقية في الوقت الحقيقي تسمح هذه التقنية لاستخدامها في معظم نماذج من أمراض الفم التي تؤدي إلى اعتلال عقد لمفية التهابات حيث يمكن الحفاظ على الحيوان في وضع مقلوب تحت التخدير على المدى القصير. الكشف عن ورم خبيث العقدة الليمفاوية أو عدوى بكتيرية، وتأثير ما يصاحب ذلك على التشكل العقدة الليمفاوية في الحيوانات التي تعيش يقدم فائدة كبيرة على الطرق التقليديةالتي تتطلب الغدد الليمفاوية ليتم إزالتها من الحيوانات النافقة لمعالجة النسيجي. الجمع بين HFUS مع خزعة بإبرة دقيقة تتيح وسيلة لإجراء التحليل الروتيني للمرضي الغدد الليمفاوية العنقية، على غرار ما يجري في العيادة، وتوفير وسيلة محسنة لرصد تطور المرض في معظم نماذج الماوس الحالية من الأمراض تجويف الفم.
Disclosures
وترعى تكاليف النشر لهذه المادة من قبل Visual سياتل.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل صندوق دوروثي D. رادفورد الأوقاف من جامعة ماري [بب] مركز فيرجينيا الغربية راندولف السرطان. استخدام نماذج والتصوير جامعة وست فرجينيا الحيوان مرفق (AMIF) ومرفق المجهري تصوير (MIF) (بدعم من مريم [بب] مركز سرطان راندولف والمعاهد الوطنية للصحة منح P20 RR16440، P30 RR032138 / GM103488 وS10 RR026378) على ما قدمه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
