Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af højfrekvente ultralyd (HFUS) til billeddannelse mus cervikal lymfeknuder. Denne teknik optimerer visualisering og kvantificering af livmoderhalskræft lymfeknude morfologi, volumen og blodgennemstrømningen. Image-vejledt biopsi af cervikale lymfeknuder og forarbejdning af lymfeknuder væv til histologisk evaluering også vist.
Abstract
Højfrekvent ultralyd (HFUS) er almindeligt anvendt som en ikke-invasiv metode til billeddannelse interne anatomiske strukturer i eksperimentelle små dyresystemer. HFUS har evnen til at detektere strukturer så små som 30 um, en egenskab, der er blevet anvendt til visualisering overfladiske lymfeknuder hos gnavere i lysstyrke (B) -tilstand. Kombinere power Doppler med B-mode scanning muliggør måling kredsløbssygdomme blodgennemstrømningen i lymfeknuder og andre organer. Mens HFUS er anvendt til lymfeknude-billeddannelse i en række muse modelsystemer, har en detaljeret protokol beskriver HFUS billeddannelse og karakterisering af de cervikale lymfeknuder i mus ikke blevet rapporteret. Her viser vi, at HFUS kan være indrettet til at detektere og karakterisere cervikale lymfeknuder i mus. Kombineret B-mode og magt dopplerbilledbehandling kan anvendes til at påvise stigninger i blodgennemstrømningen i immunologisk forstørrede livmoderhalsen noder. Vi beskriver også anvendelsen af B-mode imaging at foretage fine nål biopsier af cervikal lymfe ingendes at hente lymfevævet til histologisk analyse. Endelig software-aided trin beskrives til at beregne ændringer i lymfeknude volumen og til at visualisere ændringer i lymfeknude morfologi følgende billede genopbygning. Evnen til visuelt at overvåge ændringer i cervikal lymfeknude biologi over tid giver en enkel og effektiv teknik til ikke-invasiv overvågning af cervikale lymfeknude ændringer i prækliniske musemodeller for mundhulen sygdom.
Introduction
Lymfedrænage af interstitiel vævsvæske er den vigtigste metode til udbredelse til smitsomme mikroorganismer og kræft opstår i mundtlig og maxillofacial region 1,2. Klinisk evaluering af cervikale lymfeknuder er en almindelig diagnostisk praksis anvendt til at bestemme tilstedeværelsen eller progression af sygdomme, der stammer i mundhulen. Dette understreger vigtigheden af de indsamler cervikale lymfeknuder som værdifulde anatomiske steder til oral sygdomsdiagnose 3. Flere specialiserede imaging metoder er klinisk anvendes til at identificere syge cervikale lymfeknuder. Disse omfatter positron emission tomografi (PET), computertomografi (CT) og magnetisk resonans (MR). Mens meget værdifuldt, disse metoder alle kræve omfattende patient forberedelse, højt specialiseret udstyr og / eller kemisk infusion i cirkulationen for at aktivere eller forbedre den billeddannende proces.
Sonografisk imaging (ultralyd, US) er en almindeligt anvendt teknik, der anvendes til at image cervikale lymfeknuder præsenterer sig med lymfadenopati skyldes infektion eller metastatisk involvering 4-6. USA er ofte kombineret med PET-CT og MR scanning for at give en samlet repræsentation af patientens lymfeknude status, hjælper til at bestemme tumor iscenesættelse og nødvendighed for kirurgisk excision 7. Den ikke-invasive karakter af USA har også iboende fordele i forhold til andre billeddannende modaliteter, herunder brugervenlighed, lave omkostninger, minimal ubehag for patienten og forberedelse. Den overfladiske subkutane placering fleste cervikale lymfeknuder tillader USA at lede minimalt invasive fine nål aspiration biopsier med øget præcision, forbedre diagnostiske nøjagtighed 8.
Kommerciel højfrekvente (HF) USA giver detaljeret opløsning af interne anatomiske strukturer til 30 um 9. Anvendelse af transducere spænder fra 22 til 70 MHz, er HFUS blevet let påføres til en række eksperimentelle gnavere for at muliggøre real-time imaging af indre organer in vivo.; HFUS er blevet tilpasset til visualisering af tumordannelse i konventionel lysstyrke (B) -tilstand, samt med en række generelle og specialiserede kontrastforbedring agents9. Brug af magt Doppler med HFUS giver mulighed for at overvåge blodgennemstrømningen i musetumorer, så en samlet vurdering af angiogen perfusion i levende mus 10,11. HFUS er blevet anvendt til at visualisere syge mus lymfeknuder i hovedlegemet hulrum, hvilket viser parallel anvendelighed af denne teknologi til klinisk praksis. Navnlig, inflammatoriske og metastatiske visceral lymfeknudeceller ændringer er blevet observeret i musemodeller for cancer, der huser bryst 12,13, pancreas 14, kolorektal 15 og lunge 16 tumorer, samt fibrøse histocytomas 17, og en gammel musemodel for erhvervet hydronefrose 18 . Disse eksempler størkne værdien af HFUS som et kraftfuldt efterforskningsredskab for tumorinduceret lymfadenopati i en bred vifte af rodent systemer.
Adskillige modeller af bakteriel infektion 19,20 og hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) 21,22 er blevet udviklet til at studere disse sygdomme i den prækliniske indstilling. I modsætning til mennesker, mus indeholder tre cervikale lymfeknuder, der undersøgelse lymfeknuder fra mundhulen væv (mandibular, submandibulære mandibular og overfladisk parotideale 23). Vi har for nylig rapporteret anvendelsen af HFUS at kortlægge placeringen og morfologien af disse lymfeknuder, overvåge ændringer i lymfeknude volumen og blodgennemstrømningen i et carcinogen-induceret musemodel for HNSCC 24. Her giver vi en detaljeret protokol for brug af HFUS til at identificere, billedbehandling og analyse cervikale lymfeknuder i levende mus. Denne protokol viser også muligheden for at benytte HFUS at gennemføre image- vejledt fin nål biopsi af forstørret mus cervikale lymfeknuder, så histologiske overvågning af ændringer i livmoderhalsen lymfeknude indhold og patologier end time i det samme dyr. Denne protokol kan let tilpasses til at muliggøre detaljeret undersøgelse af cervikale lymfeknude patologier resulterende fra enhver invasiv mundhulen sygdom i mus.
Protocol
Alle dyreforsøg påvist i denne protokol er blevet gennemgået og godkendt af West Virginia University Animal Care og brug Udvalg under protokoller 11-0412 og 14-0514 og gennemføres i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er skitseret i NIH Guide til Pleje og brug of Animals.
1. Dyrepræparation
- Bedøver en enkelt mus i en induktion kammer anvendelse af 3% isofluoran blandet med 1,5 l / min 100% oxygen. Fjern dyret fra induktion kammeret og sted i rygleje på imaging platform forvarmet til 40 ° C og holdes mellem 37-42 ° C (figur 2A). Bekræft anæstesi på grund af manglende svar på en tå knivspids.
- Anbring musen snude i næsekegle forbundet til anæstesi system. Anvende anæstesi for at opretholde steady state sedation (1,5% isofluoran blandet med 1,5 l / min 100% oxygen).
- Påfør øjet smøremiddel for hvert øje for at forhindre drying. Påfør elektrodegel til elektroderne og bruge tape til at fastgøre hver af de fire poter på den tilhørende elektrode. Elektrodepuderne sender dyrets EKG til billedbehandling til at muliggøre overvågning af puls og åndedræt sats. Smør og sæt rektal temperatur sonde til kontinuerlig overvågning af kropstemperatur. Normal mus kropstemperatur er 36,9 ° C. 1-2 ° C variation er normalt, mens under anæstesi.
- Brug hårfjerningsmiddel at fjerne skind fra halsen af musen. Skyl halsregionen med vandfyldte gaze for at fjerne hår og overskydende hårfjerningsmiddel. Eventuelt bruge yderligere anvendelse af hårfjerningsmiddel at fjerne eventuelt resterende kropsbehåring (figur 2B).
2. Identifikation og Image Acquisition af Mouse Cervikal lymfeknuder Brug HFUS
- Til at begynde, anvende et lag af opvarmet ultralyd gel til halsområdet blottet for pels. Brug liberal anvendelse af gel til optimal billedkvalitetkvalitet (figur 2C). Undgår at indføre luftbobler i gelen under påføringen, som kan interferere med ultrasonisk billeddannelse.
- Juster imaging platform 20-30 °, så musen er placeret med hovedet let forhøjet. Denne position er med til at sikre en optimal respiration sats for musen. Placer 40 MHz transducer tværs i monteringssystem og omhyggeligt sænk den, indtil forsiden af transduceren scanhead er nedsænket i ultralyd gel (figur 2C).
BEMÆRK: Sørg for at ikke sætte stort pres på musen halsen, da det kan forårsage unødig åndedrætsbesvær. Derudover er det er nyttigt for billeddannelse at have en buffer af gel mellem transduceren og musen.
B-Mode Imaging og påvisning af lymfeknuder:
- Brug af computeren styrer HFUS erhvervelse software, justere lysstyrken (B-) indstillingerne på følgende parametre: Gain 22 dB, dybde 10.00mm, bredde 14,08 mm.
BEMÆRK: Disse indstillinger en foreslået udgangspunkt, og kan kræve lidt justering for optimal erhvervelse billede mellem forskellige applikationer. Overhold normale cervikale lymfeknuder som ovale hypoekkoisk strukturer nær hudoverfladen i en omgivende hyperekkoisk felt. Udseendet af syge lymfeknuder kan variere mellem modeller. Systematisk billede alle lymfeknuder i halsregionen bruge følgende trin:- Bruge Y-aksen for at scanne nakke i en kraniel at caudale måde mod thorax region. Brug X-aksen for at centrere billedet.
- Identificere vigtige landemærker: mundhulen, tungemål og skjoldbruskkirtlen (figur 3A, B og C, henholdsvis); vippe imaging platform til vandret justere den ventrale overflade af muse hals, hvilket gør begge sider af halsen vises selv i B-mode image. Mængden af vipning afhænger af fysiologi af hver individuel mus.
- Find tungen / mundhulen region (figur 3A) og bemærk den numeriske placering på Y-skalaen.
- Find skjoldbruskkirtlen (figur 3C), og bemærk den numeriske placering på Y-skalaen.
- Beregn forskellen mellem de opnåede værdier i (2.4.1) og (2.4.2) for at bestemme den totale længde i mm for det afbildede halsregionen.
- Bruge Y knappen for at centrere transduceren på midtpunktet af den bestemte totale længde.
- Tryk på "3D". Indtast den totale længde. For 3D skridt størrelse, kan du bruge 0,076 mm til at erhverve billedet serien stakken for hele halsregionen.
- Når scanningen er færdig, skal du vælge højre eller venstre side af halsen og centrere transduceren på en individuel lymfeknude af interesse, så hæve 40 MHz transducer off musen. Fjern 40 MHz transducer og erstatte med en 50 MHz microscan transducer (også i en tværgående position) for at opnå billeder med højere opløsning. Efterfylde ultralyd gel på musen hals og sænke 50 MHz transduceren i ultralyd gel.
3D Power Doppler Imaging
- Conduct 3D scanner med power Doppler at vurdere omfanget og vaskularisering af individuelle cervikale lymfeknuder som følger:
- Tryk på afbryderknappen på systemet tastaturet for at erhverve magt Dopper og juster følgende power-funktionsindstillinger: PRF 4 KHz, Doppler vinde 34 dB, 2D gain 30 dB, dybde 5,00 mm, bredde 4,73 mm. BEMÆRK: Som før disse indstillinger er en foreslået udgangspunkt og kan ændres efter behov for optimal erhvervelse billede i forskellige modeller.
- Find den kraniel-mest punkt af lymfeknude af interesse og notere placeringen på Y-skalaen.
- Finde de bedst caudale punkt af samme knudepunkt og notenplaceringen på Y-skalaen.
- Beregne afstanden forskel for at bestemme den totale længde af lymfeknuderne (se trin 2.4.3).
- Centrere transduceren på midtpunktet af den bestemte totale længde, ved hjælp af Y-skalaen placering.
- Tryk på "3D" og indtaste total lymfeknude længde. Brug 0,051 mm for trin størrelse.
BEMÆRK: På grund af nærheden af transduceren til brystregionen, kan 50 MHz transducer resultere i en ustabil dopplerbillede grund påvisning af normal respiratorisk bevægelse. Dette kan elimineres ved hjælp af "Respiration Gating" valgmulighed er tilgængelig under "fysiologiske" fanen. - Surround det valgte lymfeknude med den gule boks, der udpeger regionen, der skal analyseres ved magten Doppler og vælg "3D scan" til at erhverve billeder. Hæv transduceren ud af musen og flytte det til den modsatte side af halsen. Sænk transduceren på musen og gentage trinene ovenfor beskrevne til image lymfeknuder på denne side af halsen.
- Spar billede sæt til efterfølgende analyse.
3. Livmoderhalskræft lymfeknudebiopsi
- Vælg den ønskede lymfeknude for biopsi og opretholde HFUS billeddannelse med 50 MHz transducer. Valgte den største synlige cervikale lymfeknude i hver side af musen hals. Lymfeknude udvidelsen indikerer typisk en inflammatorisk reaktion, og derfor sådanne knudepunkter er ideelle kandidater til biopsi.
BEMÆRK: Vi har fundet det er meget vanskeligt at foretage biopsier på cervikale knudepunkter mindre end 10 mm 3. - Forbered nål og sprøjte til biopsi ved at placere en 1 ml sprøjte med en vedhæftet 27 G, 0,5 tommer nålen ind sprøjteholderen. Juster nåleholderen at orientere nålen 90 ° i forhold til muse hals (figur 4A).
- Forbered ved at løfte hele muse platform til niveauet af nålen. Opnå dette ved at fjerne 3D-motor og skifte til en højere bækken nedenorm, eller ved at placere en fast genstand med passende højde under den medfølgende korte platform. Bruge en plastic mikrofugerør rack til dette formål. Hvis det er nødvendigt, drejes platformen 180 ° med henblik på at biopsi knudepunkter placeret på siden af halsen modsat nålen apparatet.
- Justere indstillingerne erhvervelse ved at vælge "Indstillinger", og derefter ved at vælge "Max & Udvidet buffer". Forstørre synsfeltet til en dybde på 8,00 mm og bredde på 9,73 mm. Tænd nålestyret hjælp af Screen Keys dial. Nålestyret vil forudsige stien af nålen på skærmen, og giver brugeren mulighed for at line op lymfeknuden af interesse i den korrekte placering for biopsi.
- Sikre, at lymfeknude forbliver konstant i betragtning ved at centrere lymfeknuderne i midten eller lidt til venstre for midten i skærmen (figur 4B). For at opnå den hele cine loop af proceduren, tryk Pre-trigger på systemet tastaturet, før du begynder biopsi.
- Juster nåleholderen indtil nålespidsen kommer til syne og berører huden (figur 4B). Føres nålen med en fast, hurtig tryk for at punktere huden. Fortsæt med at fremføre nålen indtil spidsen punkterer også kapslen (figur 4C), og er synlig inden medulla (figur 4D).
- Når nålen er korrekt placeret i node, træk forsigtigt sprøjtens stempel tilbage mellem de gl afgrænsninger 200-300 at foretage biopsi (figur 4D og 4E). Bemærk, at biopsi materiale er typisk ikke synlig inden i sprøjten.
- Fjern forsigtigt nålen fra musen hals. Uddrive sprøjtens indhold i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fjern nålen fra sprøjten, så nålen i røret. Saml 1 ml biopsi medier (fra en prøve, adskilt fra bestanden kilden) med den samme sprøjte, og derefter vedhæfte nålen til sprøjten samtidig holde nålen i the rør.
- Skyl sprøjten og kanylen med biopsi medier ved udstøde biopsi medier ind i røret.
BEMÆRK: Træk ikke tilbage i stemplet, mens nålen er fastgjort på noget tidspunkt efter biopsi. Dette reducerer risikoen for at miste biopsimateriale grund af den lille prøvestørrelse.
- Skyl sprøjten og kanylen med biopsi medier ved udstøde biopsi medier ind i røret.
- Bekræft lymfeknude indhold ved histologiske middel (Figur 4F) og analysere af yderligere metoder (histokemi, flowcytometri, etc.) efter behov.
- Når biopsi er færdig, skal du slukke for anæstesi og fjern rektal temperatur probe. Fjern overskydende ultralyd gel fra mus med gaze og fjern tapen fra hver pote.
- Fjern musen fra imaging platform og vende tilbage til et bur. Minimal blødning fra biopsi websted kan forekomme, men det stopper uden indgriben. Overvåg musen under restitution indtil fuld aktivitet genoptages.
4. Image Analysis af livmoderhalskræft lymfeknuder
- Vælg "Rekonstrueret 3D Image" i øverste venstre hjørne, klikke på "Display Single Pane" knappen. Brug zoom-funktion til at forstørre billedet, hvis det ønskes. Skift "Display Layout" for at se billedet kun i B-mode, som fjerner magt Doppler overlay fra visningen. Dette gør det lettere at se kanterne af lymfeknude under efterfølgende 3-D-analyse. Rulle gennem billedserien at finde begyndelsen af lymfeknuderne.
- At afgrænse lymfeknude, navigere til "3D Settings" fanen. Vælg "volumen", derefter på "Start" knappen ved siden af "Parallel".
- Tegn konturer omkring området af interesse inden for individuelle billeder ved at rulle. Fortsæt, indtil billeder, der omfatter hele lymfeknude er markeret. Vælg "Afslut" for atfuldende analysen.
- I bunden af billedet, vil 3D volumen og% vaskularisering være automatisk.
BEMÆRK: 3D volumen svarer til node volumen lymfeknuder, og procent vaskularitet repræsenterer den procentdel af lymfeknude positiv for blodgennemstrømning ved magten Doppler. - Skift "Display Layout" for at se magten Doppler imaging som et overlay på B- modus billedet. På overfladen visning observere en netto lyset af mængden interesseområde. Eksportere billederne i mærkede billedfil (TIF) format eller 3D-scanninger som film (.avi) til videre brug.
Representative Results
Den overordnede skematiske for billedbehandling og biopsi procedurer er vist i figur 1. De vigtigste trin i proceduren omfatter ordentlig forberedelse af musen til billedbehandling, identifikation af de cervikale lymfeknuder, korrekt forberedelse og udførelse af nålen biopsi, og analyse af B -tilstand og Doppler billeder til at måle volumen og mængden af vaskularisering inden for hver udvalgt node ved hjælp af computersoftware.
HFUS billeddannelse af muse cervikale lymfeknuder kræver gennemføre og ajourføre ordentlig anæstesi hele imaging periode (figur 2A), samt fuldstændig fjernelse af hår, der dækker hele halsområdet (figur 2B). Den liberale anvendelse af ultralyd gel til afhåret region sikrer et klart HFUS signal under proceduren (figur 2C).
HFUS billeddannelse af halsregionen hjælpes af visualiseringen af cervikale anatomiske kendetegn, der producerer karakteristiske sonografiske billeder. Figur3 viser eksempler på de vigtigste organer (figur 3A-C), cervikale lymfeknuder i B-mode (figur 3D), og ved magten Doppler-tilstand (Figur 3E).
Real-time HFUS billeddannelse i bedøvede mus muliggør automatiseret fin nål biopsi af cervikale knudepunkter svarer til, hvad der foregår i klinisk praksis. Placering af biopsinålen og vedlagte indsamling sprøjte til den kontrollerende mikroinjektor udstyr er vist i figur 4A. Efterfølgende B-mode sonografiske billeder viser ideelle nåleplacering før biopsi (figur 4B), nålespidsen indtræden i en cervikal lymfeknude (figur 4C), og nål position under biopsi (figur 4D). Nærbillede billede viser nålespidsen i medulla af lymfeknude (Figur 4E). Behandling af biopsi komponenter ved cytospin afslører rigelige lymfoide celle klynger og tilhørende bindevæv, der verificerer vellykket lymfeknudebiopsi (Figur 4F).
Computational-baseret analyse af HFUS billeder giver mulighed for detaljerede oplysninger, der skal indhentes om lymfeknude arkitektur, volumen og vaskulær flow. Ved hjælp af power Doppler-mode og 3D volumen målinger procent vaskularitet (PV) kan beregnes ud fra billedet serien, der omfatter hele knuder (figur 5A). Derudover 3D imaging muliggør virtuel lymfeknude genopbygning, afslører samlet lymfeknude topografi (figur 5B).
Figur 1:. Oversigt skematiske af trinene, der er involveret i diagnostisk HFUS livmoderhalskræft lymfeknude billeddannelse i mus De vigtigste skridt omfatter 1: Forberedelse af mus i HFUS billedbehandling og opnå 40 og 50 billeder af halsregionen, der indeholder de tre mus cervikale lymfeknuder MHz opløsning . 2: Fin nål billede-vejledt biopsi af cervikale lymfeknuder og efterfølgende histologiske analyse af biopsi materiale. 3: Computer-aided billedanalyse og 3D rekonstruktion af lymfeknudeceller billeder opnået i B-mode og Doppler at bestemme den respektive lymfeknude volumen og procent (%) af vaskulær flow.
Figur 2:. Oversigt over den høje opløsning in vivo mikro-imaging system for cervikal lymfeknude vurdering og biopsi (A) HFUS er vist med en bedøvet mus forberedt til cervikal lymfeknude-billeddannelse. Også vist er mikroinjektor (MI) og 3D-motor fase (3D MS) ekstraudstyr. (B) Luk op visning af en bedøvet mus forberedt til HFUS billeddannelse med hår fjernet i halsregionen. (C) Det samme mus med 50 MHz transducer på plads på halsen. Bemærk den ekstra ultralyd gel anvendes til at lette halsregionen billeddannelse.
718fig3.jpg "/>
Figur 3: Repræsentant HFUS cervikale anatomi billeder i B-mode og magt Doppler. (A, B) B-mode billeder af mundhulen, og viser den bukkale kavitet (BC) og tunge (T) visualiseret ved billeddannelse nærmest næsehulen. De tre cervikale lymfeknuder findes på hver side af halsen (mærket M, mandibular, SM, submandibulære, SP, overfladisk parotideale), vises som en gruppe af hyperekkoisk strukturer i et enkelt afbildningsplanet som vist (B). (C) skjoldbruskkirtlen (Th) som visualiseret i den øvre thorax regionen, der optræder som et fast stof, ekkogen sommerfugl-formet struktur. (AC) blev visualiseret med en 40 MHz transducer; skala bar = 1 mm. (D, E) Repræsentative billeder af normal (D) og forstørrede (E) cervikale lymfeknuder med B-mode og magt Doppler (rød). Stiplede linjer skitsere individuelle lymfeknuder. Scale bar = 0.5 mm.
Figur 4: Cervikal lymfeknude biopsi opsætning, billedbehandling og cytospin analyse af biopsi materiale (A) billeddannende platformen viser mikro-injektor og nål placering nær musen hals.. En bred mikrocentrifugerør rack (orange blok) anvendes til lidt hæve platformen, hvilket muliggør korrekt nåleplacering mens det stadig tillader plads til 3D-motor fase. Dette arrangement minimerer tidsforbrug fjerne motoren fase for hver mus. (B - D) Hele hals HFUS billeder taget fra en video af en cervikal lymfeknude biopsi ved hjælp af 50 MHz transducer. (B) HFUS B-mode billede, der viser nålen anbragt på siden af halsen før biopsi. Nålespidsen er hyperekkoisk struktur lige under positionen for nålestyret (grøn stiplet linje) overlejret under billedbehandling til at betegne nålen bane. Lymfeknuden er i centrum afbilledet. Målestok = 1 mm. (C) Nål indtræden i lymfeknude. (D) biopsi af den cervikale lymfeknude. (E) Forstørret biopsi af cervikal lymfeknude. Scale bar = 0.5 mm. (F) Cytospin analyse af repræsentative biopsi lymfeknuder materiale bekræfter vellykket biopsi. Målestok = 100 um.
Figur 5:. Computeranalyse af 3D cervikal lymfeknude billeder (A) Repræsentativ skærmbillede af en lymfeknude analyseret under anvendelse af computersoftware. Noden er afgrænset i blåt; analyseresultater viser 3D Mængde og procent vaskularisering (PV) som angivet. (B) En overflade udsigt billede af den samme node efter 3D-analyse. Renders hele mængden af lymfeknude baseret på målinger foretaget i A.
Discussion
Den beskrevne protokol muliggør visualisering og in situ evaluering af murine cervikale lymfeknuder anvender ikke-invasiv HFUS billeddannelse. Brugen af B-mode og magt dopplerbilledbehandling at visualisere livmoderhalskræft lymfeknude morfologi, volumen og lymfeknude blodgennemstrømning giver en eksperimentel analyse af prækliniske mus modelsystemer svarende til den, der anvendes til karakterisering af cervikale patient knuder i klinisk praksis. Evnen til at overvåge cervial lymfeknuder via fin nål biopsi giver også en nyttig teknik til påvisning immuncellepopulationer ændringer og tilstedeværelsen af udenlandske celletyper eller bakterier under oral cavity sygdomsfrie inducerede lymphadenopathies i mus. Den brugervenlighed og lave omkostninger forbundet med HFUS muliggør hurtig screening af cervikale lymfeknude-status i en lang række dyremodeller.
Et afgørende skridt i denne protokol er den første vellykkede identifikation af de cervikale lymfeknuder i HFUS billeder. Vores anlæg har et sortiment af HFUS transducers som beskrevet, så vi har brugt dem til at opnå billederne højeste kvalitet. Men hvis transducerne vi beskriver ikke er tilgængelige, er det muligt at tilpasse billeddannelse ved hjælp af andre transducere. Til dette formål, justere billedet dybde og bredde til at opnå en tilstrækkelig billede er alt hvad der kræves. Resolution af sådanne billeder kan variere, men det bør stadig være muligt at opnå billeder af høj kvalitet ved at bruge HFUS. Vartegn i mundhulen og skjoldbruskkirtlen Imaging vil i høj grad hjælpe med at orientere brugeren til den rigtige region, hvor lymfeknuder er lokaliseret. Den karakteristiske ovalformede hypoekkoisk natur og overfladisk placering tæt på hudens overflade tillader hurtig bekræftende identifikation af de cervikale lymfeknuder i den korrekte halsregionen. Mens alle tre knuder kan være synlige i et enkelt billedplanet (figur 3B), er typisk en eller to knudepunkter fanget under billedbehandling. Kan udføres mindre justeringer af transducerposition at sønderriveER anderledes billeddannelse planes synlig, hvilket tillader visualisering af alle knuder på en enkelt side af halsen.
Mens vi har fundet den beskrevne teknik pålideligt til at identificere cervikale lymfeknuder, der er særlige begrænsninger for billedbehandling og biopsi teknik. Den overfladiske muse cervikal lymfeknuder giver overdreven mobilitet når selv svagt tryk påføres på huden via transduceren hovedet. Dette kan modvirkes ved langsomt at anvende transduceren hovedet ind i ultralyd gel på musen halsen indtil skelsættende billederne er identificeret. Lymfeknude mobilitet kan også komplicere fin nål biopsi, især når du bruger transducere i højere opløsning (50 MHz) rækkevidde. Centreret billeder af lymfeknuder til biopsi er typisk skubbet ud af synsfeltet som følge af den kraft, biopsinålen nødvendig for at punktere den overliggende hud og kapsel. Dette kan afhjælpes ved off-center positionering af lymfeknude i den retning af nålen indrejse,er plads til at lymfeknude at blive skubbet på tværs, men stadig forbliver inden for synsfeltet under biopsi. Det er vores erfaring, lymfeknuder> 10 mm 3 er meget vanskelige at biopsi, og er ofte skubbet af nålen frem gennemtrænges under nålen fremføring. Således er biopsi bedst forbeholdt forstørrede lymfeknuder hvor størrelsen er> 10 mm 3 for at sikre tilstrækkelig node target størrelse og stabilitet inden for den cervikale region. Desuden kan biopsi materiale ikke indeholder tilstrækkelige celleantal til procedurer, hvor større celleantal er nødvendige (fx flowcytometri).
HFUS har været anvendt med succes visualisere ortotopisk HNSCC tumorer 25, og har potentiale til at overvåge cervikal node metastase i mus med orale tumorer 24. Foruden ultralyd, har bioluminescens imaging også blevet anvendt til at visualisere orthotopisk oral tumordannelse og cervikal lymfeknudemetastase med levende mus 26,27. Som en alterntiv tilgang, bioluminescens imaging har en klar fordel i forhold HFUS i at kunne direkte kvantificere tumorprogression og metastatisk byrde over tid i det samme dyr. Mens uvæsentlige, bioluminescens billeddannelse er ikke i stand til at måle mange af de parametre, visualiseret ved HFUS, herunder lymfeknude morfologi, nodal volumener eller blodgennemstrømning. Bioluminescens imaging kræver også specialiserede mørke kasser til at opretholde mus under billedbehandling, hvilket gør denne teknik uegnet for tilpasning til fin nål biopsi.
Endvidere bioluminescens billeddannelse kræver produktionen af tumorceller, der stabilt udtrykker luciferaseenzymet, giver denne teknik kun anvendes i tilfælde af ortotopisk xenotransplantater med luciferase-transficerede tumorceller hos immunkompromitterede mus, eller med inducerbare vævsspecifikke transgene systemer, der begrænser luciferaseekspression i en spatio-temporal måde specifik for vævet af tumoroprindelse. I modsætning hertil kan HFUS være used sammenholdt med bioluminescens billeder i disse modeller, samt være i stand til at afbilde cervikale lymfeknuder i modeller for kræftfremkaldende-induceret orale tumorer i mus med komplette immunforsvar 28,29. Mens HFUS kan være mere tilpasses de fleste musemodeller af kræft i mundhulen, den kombinerede oplysninger, der kan fås fra bioluminescens og HFUS billeddannelse i systemer, hvor tumorceller udtrykker luciferase kan give et mere fuldstændigt billede af livmoderhalskræft lymfeknude involvering end både imaging modalitet alene.
Evnen til at identificere og påvise muse cervikale lymfeknuder i realtid giver mulighed for denne teknik, der skal anvendes i de fleste modeller af oral sygdom, der resulterer i inflammatorisk lymfadenopati, hvor dyret kan holdes i en omvendt stilling under kortvarig anæstesi. Påvisning af lymfeknudemetastase eller bakteriel infektion og den samtidige virkning på lymfeknude morfologi i levende dyr viser en signifikant fordel i forhold til traditionelle metoderder kræver lymfeknuder fjernes fra døde dyr til histologisk bearbejdning. Kombinere HFUS med fin nål biopsi giver et organ til udførelse af rutinemæssig patologisk analyse af cervikale lymfeknuder, svarende til hvad der foregår i klinikken, tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til overvågning af sygdommens progression i de fleste nuværende musemodeller for mundhulen sygdomme.
Disclosures
Offentliggørelse omkostninger til denne artikel er sponsoreret af Visual Sonics.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Dorothy D. Radford Endowment fond fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Brugen af West Virginia University dyremodeller og Imaging Facility (AMIF) og mikroskopi Imaging Facility (MIF) (støttet af Mary Babb Randolph Cancer Center og NIH tilskud P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 og S10 RR026378) er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27 G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
