Abstract
סינתזת חלבון היא תהליך בסיסי לביטוי גנים המשפיעים על תהליכים ביולוגיים מגוונים בעיקר הסתגלות לתנאי סביבה. צעד הייזום, הכולל הרכבה של תת-יחידות ריבוזומלי בmRNA קודון החניכה, הגורם מעורב ייזום כולל eIF4G1. פגמים בשלב זה שיעור הגבלה של תרגום צמודים להפרעות שונות. כדי לחקור את ההשלכות הפוטנציאליות של deregulations כזה, Xenopus laevis ביציות מהוות מודל אטרקטיבי עם מעלות גבוהות של שימור של מנגנונים תאיים ומולקולריים חיוניים עם אדם. בנוסף, במהלך התבגרות meiotic, ביציות תעתיק מודחקות וכל החלבונים הדרושים מתורגמים מקיימים מראש mRNAs, נגזר אימהי. מודל זה מאפשר זול mRNA אקסוגניים להשתלב בצורה מושלמת עם תרגום יעיל. כאן מתואר פרוטוקול להערכת תרגום עם גורם עניין (כאן eIF4G1) באמצעות storאד mRNA האימהי שהם ראשון להיות polyadenylated ותורגם במהלך הבשלת ביצית כקריאת נתונים פיזיולוגית. בתחילה, ה- mRNA synthetized ידי שעתוק במבחנה של פלסמידים של עניין (כאן eIF4G1) מוזרקים בביציות וקינטיקה של הבשלת ביצית על ידי זיהוי התפלגות רמינל שלפוחיות נקבע. יעד mRNA האימהי למד הוא סרין / Mos תראונין חלבון-קינאז. polyadenylation והתרגום הבא שלה נחקרים יחד עם הביטוי וזירחון של חלבונים של Mos מפל איתות מעורב בהבשלת ביצית. וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי לשים קדימה פגמי translational גם הציעו להדגיש תחולתה הכללית. לאור ראיות שמתעוררות סינתזת חלבון חריגה עשויה להיות מעורבת בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות, מודל כזה מספק את ההזדמנות כדי להעריך בקלות ירידת ערך זו ולזהות מטרות חדשות.
Introduction
חלבונים הם מרכיבים חיוניים של חיים סלולריים ובכך בקנה מידה גדולה יותר של האורגניזם. הם להבטיח רוב הפונקציות סלולריות כוללים מבנה, תחבורה, קטליזה תגובה, רגולציה, ביטוי גנים וכו 'הביטוי שלהם הוא התוצאה של מנגנון מורכב של תרגום המאפשר המרה של mRNA לחלבון. התרגום הוא נתון לבקרה שונות להסתגל ולהסדיר ביטוי גנים על פי צרכי התא, במהלך התפתחות והתמיינות, הזדקנות, לחצים פיסיולוגיים או פתולוגי גילויים.
תרגום מחולק ל 3 שלבים (ייזום, התארכות וסיום) ומתנות 3 מערכות תרגום ייזום כדי לענות על צרכי אלה: כובע תלוי, כובע-עצמאי באמצעות מגזר הפנימי הריבוזום כניסה (IRES) מבנים וכובע-עצמאי משפרי תרגום ( CITE).
רוב mRNA אוקריוטים מתורגמים בכובע-depeאופן ndent באמצעות כובע 5'-טריפוספט 7-methylguanosine המשמש כתכונת זיהוי במהלך סינתזת חלבון. כובע זה נקשר לeIF4E, רכיב של מורכב eIF4F עם eIF4G1 וeIF4A. קשור עם שותפים אחרים כמו פולי () חלבון מחייב (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, גורמי חניכת תרגום אלה מאפשרים לcircularize mRNA ולשפר את הנגישות שלה לצורות מורכבות 43s עד ייזום אוגוסט קודון הכרת 1. אירוע זה מתאים לסוף כלומר ייזום תרגום, הצעד הראשון של תרגום.
תרגום Cap-עצמאי משמש קידוד mRNA לחלבונים חיוניים בתנאים הדגישו כי לגרום להתפשטות תאים למשל ואפופטוזיס. מנגנון זה כולל מבנים משניים בmRNA 5'- אזור מתורגם (UTR) נקרא IRES, סוף carboxy מסוף של eIF4G1 הקשורים eIF4A והמורכב 43s. כריכה של זה 43s מראש הייזום גomplex לIRES יוזם את התרגום העצמאי הכובע ללא הצורך בגורם eIF4E 2,3.
לבסוף, מנגנון תרגום אחר עדיין לא הבין היטב תומך בפעילות תרגום כובע-העצמאי הזה, לפי תנאים הדגישו באמצעות CITE מבנים הנמצאים בתוך ה- mRNA 4 UTR.
דרך אלה מצבים השונים של התרגום השונה על ידי צעדי החניכה שלהם, תרגום משחק תפקיד קריטי בהומאוסטזיס סלולארי וכל שינוי באחד מהתהליכים אלה ובכך ישפיעו האורגניזם עם קטן לתופעות בקנה מידה גדולות. ואכן, החניכה היא צעד שיעור הגבלת שלטון תהליכי התרגום הנכון של mRNA לחלבונים ולכן היעד של מספר רב של בקרות ונקודות תקנה 5. בין אם מדובר באפשרות השנייה או לרכיבים של תהליכים אלה, אם אחד הופך להיות פגומים, זה יהיה לטרוד את האיזון שנקבע בתא ובכך עלול להוביל לקונדי פתולוגייםמשא. בהקשר זה, מוטציות בגורמי תרגום היו מעורבות במספר הפרעות, כולל הפרעות ניווניות כגון `leukoencephalopathy עם ההיעלמות לבנה matter' (מקטע eIF2B1-5) 6, בתסמונת וולקוט-Rallison (קידוד EIF2AK3 גן ל"הערכה") 7, שעלול להיות ב המחלה (p.R1205H eIF4G1) פרקינסון 8. לכן חשוב לבצע מחקרים תאיים ומולקולריים של חלבוני מוטציה אלה כדי להגדיל את הידע שלנו על התפתחות מחלה ועל התהליך הכללי של חניכת תרגום.
כדי לבצע את המחקרים הללו, זה חיוני כדי לבחור את הדגמים המתאימים ביותר לקיים את ההשלכות של מוטציות אלה Xenopus laevis ביציות מותאמות במיוחד גם בשל המאפיינים הפיסיולוגיים וביוכימיים שלהם:. סינכרוניות הפיזיולוגית (חסום בG2 שלב של מחזור התא) , קיבולת גבוהה של סינתזת חלבון (200-400 ng / יום / ביצית), מספר גבוה של OOC חולץytes מאותה חיה (800-1,000 ביציות / נקבה) וגודל תא (1.2-1.4 מ"מ קוטר) המאפשר המניפולציה שלהם. Microinjection של ביציות Xenopus עם mRNA מסונתז בקלות ניתן לבצע כדי לנתח את הפעולות תרגום. בתצוגה זו מציג יתרונות אחרים. בהתחשב במהירות של התקדמות מיוזה ותרגום לאחר microinjection mRNA (~ שעה 24), ביצית Xenopus מייצגת מערכת מהירה בהשוואה למערכות מחדש סלולריות (שחולצו מE.coli, חיידקי חיטה או reticulocyte ארנב ...) שבו mRNA הוא מתורגם עם שיעור מופחת ותרגום במהירות נמוכה יותר. אז, את ההשפעות של מוטציה הציגה בmRNA תהיה במהירות לצפייה ולמד בקלות בכמה ביציות. יתרון נוסף של ביציות Xenopus הוא שmRNAs האימהי הוא סמוי ותרגום חלבון חסום לפני גירוי פרוגסטרון. תוספת של פרוגסטרון היא אפוא אמצעי טוב של השליטה האינדוקציה התרגום. p cytoplasmicolyadenylation אינו מתרחש במהלך oogenesis. זה מתחיל בהבשלת ביצית בביציות מגורה פרוגסטרון בצו זמני וממשיך לאורך התפתחות מוקדמת ויכול לשמש כדי לחקור את השלבים השונים של תרגום.
Polyadenylation של Mos mRNA הוא בין הראשונים שמתרחשים והוא שייך עם אורורה / Eg2, היסטון-כמו B4 mRNA לכיתה של גנים "התבגרות המוקדמת" כהגדרתו בCharlesworth et al. (2004) 9. האינדוקציה translational של mRNA "מאוחר" כגון Cyclin A1 וCyclin B1 מתרחשת בערך בזמן של התמוטטות נבטי שלפוחית (GVBD). Mos mRNA מקודד קינאז סרין / תראונין חלבון. התרגום שלה הוא קריטי שכן הוא גורם למפל קינאז מפה שבעקיפין מפעיל את הבשלת הביצית. ואכן, בתגובה לפרוגסטרון, polyadenylation של Mos mRNA מוגבר באמצעות תהליך הכרוך אורורה / Eg2 חלבונים רגולטוריים וחלבוני RNA מחייב אחרים עם ההדואר 3'UTR של Mos mRNA. polyadenylation המוגבר של Mos mRNA מוביל לעלייה של רמת חלבון mos, אשר בתורו מפעילה MEK1. תהליך זה מתווך את ההפעלה של קינאז מוסדר האיתות תאי 2 (ERK2) (איור 1). מפל איתות זה יכול לגרום לאז M-שלב התבגרות קידום גורמים, מורכב נוצר על ידי קינאז Cyclin B וCdc2, וסופו של דבר גורם לחידוש meiotic.
לכן בXenopus laevis ביציות, יכול לשמש בקלות המחקר של mRNA האימהי כגון Mos לבדוק translatability עם כמה נקודות קצה מpolyadenylation היעילה שלהם לתרגום של כמה Mos איתות רכיבים, הכולל גם את קביעת שיעור GVBD. מערכת זו היא מעניינת ולכן כדי להעריך את ההשלכות הראשונות של מוטציות בגורמי חניכת תרגום ללא התערבות של mRNA עיבד חדש או של יעילות transfection, בעיות לעתים קרובות מתרחשות עם eukaryמחקרי תא otic.
כאן, פרוטוקול הוקם בי mRNAs eIF4G1 מוטצית microinjected בXenopus laevis ביציות ובתרגום של mRNA האימהי נבדק. בנוכחות של פגם בהתקדמות GVBD, Mos polyadenylation mRNA שהוא חיוני להתקדמות דרך מחזור תא ביצית meiotic ולתרגום הבא של mRNAs כיתה המוקדם והמאוחר הוא הוברר. זירחון אורורה / Eg2 וERK הוא גם למד כדי לאשר את התוצאה של deregulation.Thus mos, ביציות Xenopus מייצגות דרך פשוטה כדי לנתח את הפעולות שונות של תרגום mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי Xenopus בוצעו במתקן בעלי החיים של אוניברסיטת 1 Lille על פי הכללים של הנחיות מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) לניסויים בבעלי חיים במעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הסקירה מוסדית הלוח המקומי (Comité d'en Ethique הניסויים animale נור-פה דה קאלה, CEEA 07/2010).
טיפול 1. ביצית
- הכן את פתרון ההרדמה: לפזר 1 גרם של אבקת sulphonate תאן tricaine ב1 ליטר של מים סטריליים.
- צניחת צפרדעים נקבת laevis לפתרון זה, לכסות את הכוס, כדי למנוע בריחה ולחכות כ -45 דקות לחיה להיות מסוממת לגמרי (ללא כל תגובה לקמצוץ רגל).
- שטוף את הצפרדע עם סבון ולשטוף במים ברז ואז למקם את החיה על גבה על רדיד אלומיניום נקי.
- הצמד את העור של החלק הרוחבי של הבטן וברמת השחלות עם מלקחיים.עושה חתך של כ 1 סנטימטר במספריים לנקות לפני שימוש עם 70% אתנול. ודא שהסעיף הוא עמוק מספיק ולהגיע לדופן בטן הבסיסי כדי לאפשר כריתה של רקמת השחלה שבכמה ביציות בשלבים שונים של פיתוח נמצאות.
- לנתח את אונות השחלה, לשטוף אותם 4 פעמים בצלחת פטרי (50 מ"מ) עם מדיום ND96 (96 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 1.8 מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ HEPES מותאם pH 7.4 עם NaOH, בתוספת עם 50 מיקרוגרם / סטרפטומיצין / פניצילין, מיקרוגרם 225 מיליליטר / מיליליטר נתרן פירובט, 30 מיקרוגרם / מעכבי טריפסין סויה מיליליטר, μl 1 / טטרציקלין מיליליטר) כדי להסיר כל העקבות של דם ופסולת.
הערה: טטרציקלין מאפשר שימור אופטימלי והתאוששות טובה לאחר טיפול microinjection. - לאחסן אותם בצלחת פטרי מכוסה השקועה במדיום בגיל 14 מעלות צלזיוס, ומאפשר השימור שלהם במשך שבוע אחד.
- לתפור את דופן הבטן ועור עם לא נספגים וטרינרלחם ומחט תפירה (3 או 4 תפרים יהיו צורך).
- מניחים את החיה בכוס בלי מים ולחים לעור במים ברז עד לצפרדע נעה שוב. מכסה את הכוס כדי למנוע בריחה.
- להפריד בזהירות את אונות השחלה במדיום בקבוצות של 5 עד 10 ביציות באמצעות 2 זוגות מלקחיים תחת stereomicroscope עם הגדלה של פי 10. ביציות בחרו בVI השלב. הם יכולים להיות מוכרים על ידי i) הצורה והצבע שלהם עם מוט חום פיגמנט בעלי חיים ומוט וגטטיבי צהוב מופרד על ידי החגורה ברורה ii) גודלם עולה על 1.2 מ"מ בקוטר 10.
- דגירה הביציות שנבחרו בפתרון collagenase (1 מ"ג / מיליליטר collagenase מhistolyticum Clostridium, מומס בND96 ללא טטרציקלין) בצלחת פטרי תחת תסיסה עדינה במהלך 45 דקות כדי להקל על defolliculation הביצית (collagenase מעכל קשרי תא ביצית זקיקים /). יש לשטוף את הביציות 3 או 4 פעמים עם מדיום ND96 המשיכו בגיל 14מעלות צלזיוס.
הערה: אל דגירה הביציות פחות או יותר מ -45 דקות בשל הסיכון של הרס חלבוני פני השטח ביצית ולגרום לכדאיות עניה. טיפול Collagenase יכול לגרום GVBD הספונטני. - דגירה ביציות במדיום במשך 3-4 שעות. הסרת תאי זקיקים עם פינצטה בסדר תחת זכוכית מגדלת משקפת ולשמור אותם בגיל 19 מעלות צלזיוס במדיום ND96.
2. הכנה של mRNA סינתזה
- Linearize 5 מיקרוגרם של פלסמידים הבאים על ידי עיכול אנזימטי באמצעות PME אני אנזים.
הערה: pcDNA6.2 / V5-DEST המכיל חומצות אמינו מסוג 1,599 eIF4G1 cDNA פראי (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST מכיל cDNA eIF4G1 הדומיננטי שלילי (eIF4G1-DN) עם מוטציות c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T, 2125T>> - וc.2126T> G מפריע באזור של אינטראקציה בין eIF4G1 וeIF4E בעמדה 612-618 של החלבון המקביל betwe אינטראקציהen eIF4G1 וeIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP מכיל chloramphenicol אצטיל transferase (GFP). הכן 2 תערובות לכל אחד מפלסמידים 3: PME הראשון כולל אני אנזים והשני ללא אנזים כשליטה. - לזרז פלסמיד דנ"א באמצעות הליך אתנול קלאסי וresuspend אותו 20 μl של H nuclease ללא 2 O.
- לקבוע את הריכוז שלה באמצעות ספקטרופוטומטר. הריכוז צריך להיות עדיף על 150 ng / μl לתמלל קרנה.
- הפעל 1 μl של דגימות והבקרה שלהם עם 5 μl של חיץ טעינה על ג'ל agarose 0.8% כדי לאמת את linearization פלסמיד.
- השתמש בערכה לשעתוק במבחנה וטיהור קרנה על פי הוראות יצרן. קרנה עיבד הם resuspended ב 20 μl של H nuclease ללא 2 O. דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C במידת הצורך.
- הכן את חיץ הגירת מגבים 10X המכיל 0.2 M מגבים (pH 7.0), 20 מ 'אצטט M נתרן ו -10 מ"מ EDTA (pH 8.0). לעקר פתרון עם מסנן 0.45 מיקרומטר. מניות הפתרון מוגנים מפני האור על RT כדי למנוע חמצון פתרון.
- נקה את מיכל אלקטרופורזה ברציפות עם NaOH, HCl ושטף היטב במים מסוננים כפולים לO / N להימנע RNase ולמנוע השפלה RNA.
- עופרת agarose ג'ל המכיל 1.5% מגבים ופורמלדהיד. חם עד לפירוק agarose מלא ולתת לו להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס. מתחת למכסה מנוע קטר, להוסיף 0.1 בנפח של מגבים 10X, 6.6% של פורמלדהיד ו -4 מיקרוגרם של ברומיד (10 מ"ג / מיליליטר). יוצקים את הג'ל מתחת למכסת מנוע קטר ולחכות כ 1 שעה לג'ל להקשיח.
הערה: פורמלדהיד וethidium ברומיד הם רעילים. - הכן דגימות להגירה בצינור 0.2 מיליליטר עם 1 μl של קרנה, 8.8% של פורמלדהיד, 60% מפוראמיד ונפח של 0.1 מגבים 10X. דגירה של 3 דקות ב 70 מעלות צלזיוס ולשים את הצינורות על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה דגימות כמה שניות בx גרם 5000. הוסף 2 μl של חיץ טעינת ג'ל.
הערה: Formamide הוא רעיל. - הפעל דגימות עבור 20 דקות ב 90V. משרים את הג'ל בOO H 2 nuclease ללא / N לdestain ג'ל לפני הניתוח בו כדי לבדוק את איכות קרנה.
- קביעת ריכוז קרנה באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותם ב -80 ° C.
3. Microinjection של מסונתז רנ"א וביציות בשלים גירוי
- הכן את הציוד הדרוש לmicroinjection ביציות. להשתמש חולץ micropipette למשוך נימי זכוכית קטנות. תחת סטראו, לשבור את הגפיים של הנימים עם פינצטה כדי ליצור קצה קהה. מלא את micropipette הנימים עם שמן מינרלים באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מסנן Millipore 0.45 מיקרומטר בדיוק בקצה השני. הר micropipette על פיפטה microinjection. בחר micropipette מדויק מכויל על ידי היצרן לתת דיוק טוב בעת שימוש עם נימי זכוכית מתאימות.
- בצע microinjection 1-2 שעות לאחר defolliculation, עיכוב הכרחי להתאוששות ביצית בביציות נשמרים בגיל 14 מעלות צלזיוס. מנות שימוש פטרי עם התחתית מגורדת עם מלקחיים כדי ליצור משטח דביק לביציות ולמלא אותם במדיום ND96.
- לארגן ביציות לאורך נתיב מגורד בצלחת פטרי המאפשרת הזרקה רצופה של ביציות עם micropipette הנימים בזווית של 45 מעלות צלזיוס.
- להזריק באזור הקו המשווה הביצית, מתחת לאזור בעלי החיים פיגמנט לדיפוזיה אופטימלית של דגימות בציטופלסמה. הכנס את החלק הדק ביותר רק של קצה נימים על כ 150-200 מיקרומטר של עומק.
- הזרק 30 ng של קרנה הושג בהתאמה מפלסמידים השונים בהיקף של 60 NL בביצית ראשונה. לאחר הזרקה, לחכות 5-10 שניות לפני הסרת קצה הנימים כדי למנוע בריחת מדגם (איור 2 א).
הערה: אל תעלה על 120 NL. להזריק לאט ככל שתוכל. שליטה במים מזוקקים מומלצת. - הזז ידני צלחת פטרי להזריק הביצית הבאה.
הערה: ודא שהקצה אינו סתום על ידי יצירת דופק קטן מפתרון האמבטיה לאחר 2 עד 3 microinjections. - העברת ביציות הזריקו בתרבות צלחות 24 בארות (10 ביציות / טוב) מלא עם 3 מיליליטר של מדיום ND96 הטרי ולהשאיר אותם בגיל 19 מעלות צלזיוס.
- דגירה הביציות בND96 עם פרוגסטרון (PG) (2 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לעורר התבגרות meiotic (GVBD) בגיל 19 ° C, 15 שעות או 4 שעות לאחר microinjection של cRNAs polyadenylated הושג בהתאמה מpcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 וpcDNA6 .2 / C-EmGFP משמש כביקורת (איור 2 א).
הערה: ההזרקה משותפת של סמן פלואורסצנטי עם קרנה היא כלי נחמד כדי להבטיח שקרנה הוזרקה ונשארה בביצית. לבצע ניסויים ראשוניים כגון באמצעות קרנה של עניין עם תג ה- GFP. - Microinject כמו ב# 3.5 יחסים שונים (1: 3, 2: 2; 3: 1) של polyadenylated eIF4G1-WT וeIF4G1-DN cRNAs כדי teרח השפעת התרגום של cRNAs eIF4G1-WT בפנוטיפ מוטנטי (איור 2 ד).
קביעת התפלגות 4. רמינל שלפוחיות
- לספור את מספר הביציות בשלות לאחר גירוי PG ידי התבוננות הנוכחות של כתם לבן בקוטב החיה השחור עם סטראו. חזור על ספירת כל שעה עד השעה עשרים והארבעה (איור 2, 2C).
5. מערבי כתם ניתוח (WB)
- Homogenize הקבוצה של 10 ביציות על ידי קדימה ואחורה בתנועות עם קצה micropipette, על 4 מעלות צלזיוס ב200 μl במאגר הבא: 50 מ"מ Hepes, pH 7.4, 500 מ"מ NaCl, 0.05% SDS, 5 מ"מ MgCl 2, 1 מ"ג / אלבומין מיליליטר שור סרום, 10 מ"ג / מיליליטר leupeptin, 10 מ"ג / מיליליטר aprotinin, 10 מ"ג / מיליליטר מעכבי טריפסין הסויה, 10 מ"ג / מיליליטר benzamidine, 1 מ"מ PMSF, vanadate נתרן 1 מ"מ.
- צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות על 10,000 XG להסיר את השומנים בדם (עליון שלב) והקרום f (שלב תחתון)ractions. לאסוף את חלק cytoplasmic, לאחסן aliquot כדי לקבוע ריכוז חלבון ולהשלים את היתרה עם Laemmli או חיץ מדגם Bis-טריס (1: 1).
שים לב: יש לי ג'לי Bis-טריס ומאגר טעינת pH ניטראלי יותר שמגן על חלבונים מהידרוליזה - מחממים 20 מיקרוגרם של מדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לטעון כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל acrylamide. מניחים את הג'ל בטנק עם מאגר מתאים.
- לבצע אלקטרופורזה עבור h 1 ב 200 V.
- מבין WB בכפות pH 8.0 (טריס HCl 15 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, המכיל 10% אלבומין בסרום שור) עם אנטי-אורורה / Eg2 עז (1: 3000, 2 שעות) או עם אנטי ארנב -Aurora / Eg2-P (1: 1,000, O / N ב 4 ° C), עכבר אנטי-ERK2 (1: 3000, שעה 2), אנטי-ERK2-P עז (Tyr204) (1: 3000, 2 שעות ), ארנב נגד Mos (1: 5,000, 4 שעות), ארנב נגד GFP (1: 3000, שעה 2) antibodies.Use נוגדני העכבר אנטי V5 (1: 10,000, 2 שעות) וארנב נגד RSK (1 : 1,000, 2 שעות) (שולטת טעינה).
- לשטוףהקרום 3 פעמים במשך 10 דקות בכפות-Tween דגירה שעה 1 עם או אנטי עכבר או נוגדנים משני שכותרתו peroxidase חזרת נגד ארנב או אנטי-עז (IgM) בדילולים של 1: 5,000, 1: 7,500 ו1 : 5,000 בהתאמה.
- בצע 3 שוטף של 10 דקות בכפות-Tween ולזהות את מתחמי אנטיגן-נוגדנים במערכת מתקדם ECL איתור.
6. polyadenylation Assay
- לדוגמא 5 ביציות לכל מצב ב1.5 מיליליטר. לשטוף אותם עם 1 מיליליטר של nuclease ללא PBS 1X (pH 7.4). השלבים הבאים יבוצעו מתחת למכסת מנוע קטר.
- לחלץ RNA באמצעות הליך אורגני קלאסי (ראה הוראות יצרן).
- להתאושש RNA על ידי צנטריפוגה (10,000 XG) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו- RNA האוויר היבש למשך 10 דקות.
- גלולה RNA הגלול בμl 30 של H nuclease ללא 2 O.
- קח 15 μl של דגימות בצינור חדש ולהוסיף 85 μl של H nuclease ללא 2 O. לנקות אתדגימות se כדי לשפר את האיכות שלהם על הטור של סיליקה על פי הוראות היצרן. Elute RNA באמצעות 30 μl של H nuclease ללא 2 O
- הפעל 1 μl של דגימות עם 5 μl של חיץ טעינה על ג'ל agarose 0.8% כדי לבדוק את תקינות RNA.
- קבע את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
- הכן 2 תערובות קשירה למצב (כלומר, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN ושליטת 2 O H) עם ריאגנטים הבאים: 10 U של האנזים RNA, 0.1 נפח של 10X חיץ, 1 מ"מ ATP, 10% מPEG8000 50% , 0.1 מיקרוגרם של P1 פריימר (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 ולהביא את הנפח הסופי עד 10 μl עם H nuclease ללא 2 O. להוסיף בRNA התערובת הראשון שהתקבל מביציות ללא גירוי PG ובRNA התערובת השני מתקבל מPG מגורה ביציות.
- דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך 20 דקות על 65 מעלות צלזיוס כדי להשבית את האנזים.
- שלנוEA cDNA הפוך תמלול ערכה (RT). מכין את תערובת RT, לכל צינור: 0.1 נפח של חיץ 10X RT, 0.1 מיקרוגרם של P2 פריימר (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, תערובת 4 מ"מ dNTP, 50 U של טרנסקריפטאז ולהשלים עם H nuclease ללא 2 O נפח סופי 10 μl. הוסף 10 μl תגובת קשירה שהושגה בעבר. בצע RT בתנאים שתוארו על ידי היצרן.
- הכן תגובת שרשרת פולימראז תערובת (PCR), לכל צינור: 0.1 נפח של חיץ 10X, 1.5 מ"מ MgCl 2, 133 מיקרומטר תערובת dNTP, 0.2 מיקרומטר פריימר הספציפי, 0.2 מיקרומטר P2 פריימר, פולימראז 0.025 U תקי, 1 μl של cDNA ולהשלים עם -Nuclease חופשי H 2 O לנפח סופי של 50 μl. לבצע PCR בתנאים הבאים: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, [95 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות] * 40 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות 9. פריימרים הספציפיים הם כדלקמן: mos, GB4 כמו-היסטון TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; B1 cyclin: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- הכן 3% agarose ג'ל. להוסיף בכל מוצרי ה- PCR 10 μl של חיץ טעינה. הפעל את הג'ל עם 10 μl דגימות ב 110 V להגירה אופטימלית. נתח את הג'ל לאחר 10 ו -20 דקות כדי לבחון שינוי של גודל המשקף את אורכו של פולי הזנב () ובכך התבגרות RNA שהוא תנאי הכרחי לתרגום שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התבגרות הקינטית של ביציות Xenopus ונחישות של GVBD ביצית אחוז לאחר 24 שעות של גירוי PG (2B דמויות, 2C):
על מנת ללמוד את ההשלכות של התרגום של המוטציה eIF4G1-DN, התגובה לPG ב Xenopus laevis ביציות microinjected עם קרנה eIF4G1-DN הוא בהשוואה לeIF4G1-WT ולתנאי שליטה אחרים (H 2 O, GFP). הפקדים לאפשר להעריך את השכיחות של microinjection ביצית ללא קשר לאופי של קרנה הזריקו או של ביטוי יתר eIF4G1.
Maturations הקינטית של 10 ביציות מאופיינות בתנאי בקרת microinjected (H 2 O וGFP) דומה לWT ומספר עובר GVBD קרוב מאוד זה לזה בגיל 12 ו -24 שעות לאחר גירוי PG (איור 2). לאחר 24 שעות, הבשלה של ביציות מגיעה 95.7% לWT, 97.1% לH 2 O ו97.5% לGFP (אלחוטית איור 2 ג). לפיכך, יש לי microinjections עם H 2 O או שליטת cRNAs או cRNAs eIF4G1 השפעה מועטת על שחרור מיוזה הביצית. לעומת 8 שעות לאחר גירוי PG, מספר ביציות microinjected עם cRNAs eIF4G1-DN עובר GVBD מתעכב לעומת eIF4G1-WT cRNAs (איור 2) שחרור .the מיוזה של eIF4G1-DN לעומת ביציות eIF4G1-WT מקטין באופן משמעותי על ידי 85.8% ו 77.4% בשעה 12 ו -24 שעות לאחר גירוי PG בהתאמה (איור 2 ג). זה גם ראוי לציין כי 13 שעות לאחר גירוי PG, מספר הביציות בשלות מגיעים לכל היותר לכל התנאים למעט eIF4G1-DN שמרבי מושגת רק 20 שעות לאחר גירוי PG. לכן, הנוכחות של המוטציה eIF4G1-DN מובילה לשחרור מיוזה עני ביצית לעומת eIF4G1-WT.
שיקום של הבשלת ביצית בנוכחות הודות eIF4G1-DN לeIF4G1-WT (איור 2 ד):
_content "> כדי לקבוע אם פוגע eIF4G1-DN קרנה microinjection או חוסם את הבשלת הביצית, יחסים שונים של eIF4G1-WT וeIF4G1-DN cRNAs הם microinjected השותף. בתנאים אלה, גידול של ביצית הבשלה הוא ציין כרמות של eIF4G1-WT קרנה לגייס ואלה של התבגרות eIF4G1-DN קרנה decrease.While הוא ציין ב17.5% מביציות עם מנה אחת של cRNAs eIF4G1-DN, אחוז זה מגיע 76.7% עם שיתוף microinjection של 3 מנות של eIF4G1-WT cRNAs ו הנוכחות של מנה אחת של eIF4G1-WT cRNAs מובילה 95% של הבשלת ביצית. ניסוי זה מראה כי פגם ההבשלה של ביציות Xenopus microinjected עם eIF4G1-DN הוא לא בלתי הפיך וניתן לשחזר באופן חלקי.mos ביטוי חלבוני איתות נצפו על WB כמדד ליכולת תרגום לפני ואחרי גירוי PG (איור 2E):
רמת החלבון של V5-תג בביציות להביע eIF4G1-WT וeIF4G1-DN דומה המשקף את יעילות microinjection דומה. רמת חלבון RSK משמש כשליטה טעינת חלבון היא גם דומה בכל התנאים לפני ואחרי גירוי PG. הביטוי של חלבון ה- GFP נוכח גם בביציות microinjected עם GFP קרנה מגורה או לא עם PG. נתונים אלה מצביעים על כך שmicroinjection וביטוי היתר של eF4G1 לא להפריע התרגום של ה- GFP. עם זאת, אין ביטוי חלבון ה- GFP הוא זיהוי לפני ואחרי גירוי PG בביציות המבטאות את eIF4G1-DN. כצפוי, הביטוי לא Mos אנדוגני הוא להבחין בהיעדר גירוי PG. בנוסף, Mos ביטוי הוא ציין בeIF4G1-WT ו -2 O תנאי שליטה לאחר גירוי PG בהסכם עם תוצאות קודמות שהראו ביטוי יתר של eIF4G1-WT יש H השלכות קצת על Mos אנדוגני 16. לעומת זאת, ירידה ניכרת של ביטוי Mos בולטת לאחר גירוי PG.
המקצועןביטוי החלבון של חלק מרכיבים של Mos מפל איתות גם נבדק. לדוגמא, אורורה / חלבון Eg2 פועל במעלה הזרם לMOS אינדוקציה ולא זיהוי של הסרת הפיקוח החלבון שלה או של צורת phosphorylated המושרית לאחר גירוי PG הוא ציין. לעומת זאת, דה-רגולציה של זירחון ERK2 הנגרם על ידי mos הוא ציין בנוכחות eIF4G1-DN.
תוצאות אלו הציעו שהביטוי אנדוגני של RNA mos לחלבון וMos הפעלת ERK2 תלויה מושפע מהביטוי של eIF4G1-DN.
mRNA polyadenylation (איור 2F):
Polyadenylation של כמה mRNAs (mos, Cyclin A1, B1 ו- B4 Cyclin כמו היסטון-) ההכרחי לXenopus ביציות התאוששות מיוזה נבדקה. Assay מבוצע מאפשר להגדיר אם עלייה בגודל amplimer המקביל לאורכו של זנב פולי () של mRNA קיימת לאחר גירוי PG. ואכן, עם Pגירוי G התוספת של פולי זנב () הוא ציין בכל התנאים, כולל המוטציה eIF4G1-DN.
איור 1. סקירה סכמטי של הפעלת מפל MAPK. על הגירוי הורמונלי על ידי שינויים מהירים PG בפעילות של כמה אנזימים להתרחש כוללים אלה של אורורה / Eg2 ומסלול CPEB. Hyperphosphorylation של אורורה / Eg2 מוביל לCPEB זרחון (cytoplasmic polyadenylation אלמנט כריכת חלבון). CPEB phosphorylated מכיר CPE (polyadenylation cytoplasmic אלמנט) ב3'UTR של Mos mRNA, מגייס CPSF (מחשוף וpolyadenylation ספציפי פקטור) ומפעיל polyadenylation mRNA על ידי PAP (פולי () פולימראז). גירוי PG גם מקדם ברציפות זירחון Maskin באמצעות שתי הפעולה של PKA וcdk1, Maskin / ניתוק eIF4E ועמותת eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 מגייס טראנסשותפי ייזום ויסות כולל PABP שאינטראקציה עם eIF4G1 ומזהה את פולי זנב (). ברגע שמסונתז, Mos מפעיל MEK / MAPKK ידי זרחון, אשר בתורו, מפעיל ERK2 / MAPK ידי זרחון. מפל MAPK מה שנקרא זה מעורב בתהליכי meiotic ידי שליטה קינטית M-שלב כניסה, המורפוגנזה ציר ועיכוב של סינתזת DNA. המפל מוטבע בהיזון חוזרת לולאה חיובית שמקיימת סינתזת חלבון. אחת יש לציין כי MOS הוא לא רק החלבון ביקש להיות מסונתזים להפעלת GVBD; כלומר, Cyclin B נדרש להיות מתורגם להישג התבגרות.
2. מוטציה eIF4G1-DN איור משפיעה הבשלת ביצית ותרגום בlaevis Xenopus. RNA נגזר מפלסמידים קידוד חלבוני eIF4G1 מתויג V5 (WT וDN) הםmicroinjected בXenopus laevis ביציות. לאחר 15 שעות, הבשלה של ביציות היא מגורה על ידי פרוגסטרון (PG) (ניסויים בוצעו לפחות 3 פעמים ותוצאות נציג מוצגות). () Schematicoverview של פרוטוקול ניסוי. הזריקות של eIF4G1 ו / או cRNAs GFP מיוצגות על ידי חץ-ראשים לפני גירוי PG. דוגמאות לניתוחי RNA וחלבונים התקבלו ב -2 נקודות זמן (גירוי PG ובסוף הקינטית GVBD). התבגרות קינטי (B) של 10 ביציות מאופיינות GVBD נבדקה במהלך 24 שעות לאחר גירוי PG. עיכוב בהבשלת ביצית הוא ציין בביציות microinjected עם eIF4G1-DN cRNAs בהשוואה לאלו עם microinjected eIF4G1-WT cRNAs אחוז (C) של ביציות בשלות 24 שעות לאחר גירוי PG (n = 4; * p <0.05).. ירידה בהבשלת ביצית הוא ציין באלו microinjected עם eIF4G1-DN cRNAs לעומת eIF4G1-WT cRNAs. (ד) Reversioהערכת פנוטיפ n של ביציות microinjected עם cRNAs eIF4G1-DN המוטציה וcRNAs eIF4G1-WT מראה כי מכונות התרגום עדיין פונקציונליות כאשר eIF4G1-WT מתווסף למוטציה. חלבונים (E) מופקים מביציות ורמותיהם נקבעו על ידי immunoblotting ניתוח . הפרעות של זירחון ERK2, mos וביטוי של GFP בתנאי eIF4G1-DN הם נצפו. (F) polyadenylation של mos, Cyclin A1, B1 mRNAs B4 וכמו היסטון-Cyclin מביציות מגורה או לא עם PG נצפתה לאחר ההגברה PCR והגירה ב 3% agarose ג'ל. לאחר גירוי PG, עלייה בגודל> 100 polyadenylation מזוהה לכל התנאים. הנתיב הראשון תואם את הסולם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרגום הוא מנגנון המעורב בphysiopathology של הפרעות אנושיות רבות, כולל כמה מחלות ניווניות. למשל במחלת פרקינסון כמה דיווחים הציעו ירידת הערך בתרגום הקשורים מוטציות תורשתיות 8,12,13.
כמה דגמים סלולריים זמינים ללמוד תרגום. כאן, על מנת ללמוד את ההשלכות של התרגום של מוטציה בeIF4G1 שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית כמו הפחתת האינטראקציה בין שותפי eIF4G1 וeIF4E 8, Xenopus laevis ביצית משמשת. מודל זה יש את היתרונות של פשטות שכן הוא מורכב מתא ענק אחד בלבד להקל microinjection של mRNA הסינתטי, שהוביל לכמות ניכרת של חומר לניסויים ביוכימיים והקלת תצפיות מקרוסקופית של השלבים השונים של הבשלת ביצית. תהליך זה הוא גם זמן יעיל בהשוואה לתאים יציביםדור קו. יתר על כן, כמה פרוטוקולים של microinjections הכנת הביצית ו- RNA כבר תוארו בפרט ללימוד מחזור תא או תחבורת nucleocytoplasmic 14,15. לגבי גבולות פרוטוקולים כגון ללמוד תרגום, יש לקחת תשומת לב מיוחדת בנוגע לריכוז של mRNA. ריכוז זה לא צריך להיות ל( גבוה מ -30 ננוגרם לא ב -120 מרבי NL) גבוהים כדי שלא להרוות את תהליך התרגום. אם ניקח בחשבון את האלמנט הזה, ביצית Xenopus היא מודל אטרקטיבי ללמוד תרגום חלבון כפי שמעיד הנתונים המוצגים באיור 2 עם טופס מוטציה של תמליל EIF4G1.
ואכן, בנוכחות eIF4G1 המוטציה, ירידת ערך בתרגום חלבון mos של נצפתה ומתואם עם ירידה של 90% מGVBD לעומת WT ולשלוט תנאים. לעומת זאת, ביטוי יתר של eIF4G1-WT לא לגרום לשינוי ברמת oתרגום Mos F בהסכם עם 16,17 נתונים ספרות.
כמה שינויים ביולוגיים עשויים להסביר את התוצאות הללו. בידיעה שMOS mRNA הוא ממוצא אימהי וכבר עיבד לפני הפעלת מיוזה ידי PG, המנגנונים מוטרדים צריכים להתרחש בין צעדי השעתוק ותרגום. תרגום ראוי לציון, Mos הוא התוצאה של שרשרת אירועים מולקולריים שמתחילים מmRNA סמוי ללא פולי זנב () לתוספת של הזנב לאחר גירוי PG לתרגומה 18,19. לפיכך, מספר תרחישים אפשריים כולל: מומים בייזום תרגום עשויים להיות חשודים כגורם לכישלון הזה, או פגמים של זירחון של הגורם המוביל לMOS polyadenylation mRNA, או ברירת מחדל של polyadenylation mRNA של תמלילי mos על ידי עצמו יכול להוביל ל ירידת translational.
כדי להעריך 2 מנגנונים אלה האחרונים, הביטוי של גורמים אלה על ידי WB נבחן. הגעהרמות היון של אורורה פוספורילציה / Eg2, אחראים לזירחון CPEB לא הראו הפרעה בנוכחות eIF4G1 המוטציה. באותה הרוח, Mos polyadenylation mRNA או polyadenylation mRNA האחר הוא ציין בנוכחות eIF4G1 המוטציה לאחר גירוי PG (איור 2F). כדי לאשר נוסף פרופיל polyadenylation ניסויי כתם צפון יהיו מומלצים, כמו גם ביצוע בידוד שיפוע סוכרוז של polysomes כדי לקבוע אם הגיוס של mRNA להריבוזום יכול להתרחש 16.
אז, על ידי לימוד היסודות הראשונים והאחרונים של המפל, השלב מוטרד נחשד להיות במורד הזרם של המופע של polyadenylation. כמו כן, חשוב לבדוק אם פגם ביטוי Mos נתן את ההשפעה הצפויה על זירחון של ERK2. בנוכחות של המוטציה, ירידה בשיעור של ביטוי Mos הביא לירידה של רמת ERK2 פוספורילציה וכתוצאה מכך לפגם בהתקדמות GVBD (איור 1 ו2E). לפיכך, המוטציה eIF4G1 קשורה לירידה צפויה של תרגום Mos. המחיקה של תחום מחייב eIF4E ברצף eIF4G1 בeiF4G1-DN היא כנראה אחראית לירידה באינטראקציות eIF4G1 / eIF4E כפי שהוצע בעבר על ידי מחקר שיתוף immunoprecipitation 8 שעלולים להפריע להיווצרות המורכבת eIF4F.
יש פרוטוקול זה כמה יישומים מעניינים בביולוגיה תאית. הגדרה זו היא אידיאלית כחקירות ראשוניות למספר שאלות בסיסיות בביולוגיה תאית כגון: כדי להבין טוב יותר את התפקיד של תחומים ספציפיים של גורמי ייזום ולהגדיר אותם כי הם חיוניים לתרגום in vivo או ביצית הבשלה. בהקשר זה, Wakiyama et al. (2000) הראה את החשיבות בהבשלת ביצית באזור אמינו מסוף של eIF4G1 מכיל תחומים מחייבים לeIF4E וPABP 17; ללמוד splicING חניכה גורמי 20; לפענח את המנגנונים המשמשים על ידי וירוסי חטיפת מכונות תרגום מארח למטרותיהם באמצעות מחשוף eIF4G1 למשל עם עיכוב של מבני כובע תלוי תרגום וIRES של mRNA שלהם, המתורגם באופן כובע-עצמאי 21; כדי ללמוד את התפקיד של מוטציה בגורמי תרגום על מחזור תא מאז ביציות הן מודלים של בחירה למחקר כזה 22; כדי לחקור את המנגנונים העיקריים המסדירים ייזום כלומר תרגום, כובע תלוי וכובע-עצמאי להגדיר אם מערכות אחד או כמה הם מעורבים בהפרעת סינתזת חלבון. כמה וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי בקלות יכולות להיות מיושמות להגיע מטרות אלה, ובכלל זה קביעת יעילות התרגום על ידי microinjection mRNA method23 או כתב השקיעה. לדוגמא, השימוש בmRNA כתב bicistronic מכיל cistron ראשון שבי Renilla לוציפראז יהיה מתורגם כובע תלויבעוד cistron השני מכיל לוציפראז גחלילית יתורגם באמצעות IRES מבנים צריכים לאפשר להגדיר את המצב של חניכה לשים קדימה פגמים ו / או פיצויים בסדר לשמור על הומאוסטזיס תרגום. בנוסף, ניסויי RNA הכתב בלוציפראז כגון מציעים את היתרון שלא להסתמך על מנגנוני התפתחות מקצועיים משיבוש פוטנציאלי בשל מנגנוני שימור שלמים עם אדם.
במקביל לשאלות יסוד אלה, פרוטוקול כזה יכול להיות מיושם כצעד ראשון לטיפול בתנאים מזיקים שיכול לתרום להפרעות נוירולוגיות. בתנאים פיסיולוגיים, צעדי חניכת תרגום הם המטרות המועדפת של תקנות בתנאים הדגישו כגון חמצון, היפוקסיה, שינוי טמפרטורה, קרינה וקיפוח תזונתי. בתנאים כאלה, תרגום סלקטיבית של תמלילי קידוד חלבונים שחיוניים נגד לחצים והישרדות תא מתרחשת.כאשר תהליך זה הוא המום, הלחצים הפכו פתולוגיים ולהשתתף באופן פעיל בפיתוח של כמה חיבת נוירולוגיות. גורמי לחץ סלולריים מעורבים במחלות ניווניות רבות כגון אלצהיימר ופרקינסון, מחלת ניוון או מחלה הפריון (קרויצפלד-יעקב) 24 ולחצים אלה גורמים להפעלה של תגובת מצב פרישת חלבון (UPR). אחד ממנגנוני UPR אלה מוביל לתרגום ירד באמצעות הפעלת "הערכה" וזירחון של מקטע eIF2α עם ההשלכות של עצירת תרגום על ידי מניעה מחייבת בין eIF4F ו43s קומפלקסי 25. בביציות Xenopus, התוספת של סוכני חמצוני ו / או גנים שעברו מוטציה ידועה כקשורה לפתולוגיות כזה לחקות הלחצים הללו ולקבוע אם גנים שעברו מוטציה יכולים להשפיע על תהליכי התרגום. במחלת פרקינסון למשל, את ההקדמה של p.R1205H eIF4G1 בXenopשלנו ביצית קשורה או לא לחמצוני לחץ או ניתוח הגנום של פרופילי polysomal mRNA יכול להתייחס לשאלת מעורבות התרגום בphysiopathology 26.
כל יישומים אלה פנו לביצית וכך מייצגים שדה גדול של אפשרויות ללמוד הפרעות תרגום שכעת ידועים כקשורות לכמה חיבה כוללים הפרעות ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N.
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N.
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
