Abstract
Die Proteinsynthese ist ein fundamentaler Prozess, um die Genexpression beeinflussen vielfältigen biologischen Prozesse, insbesondere die Anpassung an Umweltbedingungen. Die Initiierungsschritt, der den Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten auf der mRNA-Initiationscodon beteiligten Initiationsfaktor einschließlich eIF4G1 beinhaltet. Defekte in diesem geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Translation an verschiedenen Erkrankungen verbunden. Um die möglichen Folgen eines solchen Deregulierungen studieren, Oozyten von Xenopus laevis bilden ein attraktives Modell mit hohem Grad von der Erhaltung der wesentlichen zellulären und molekularen Mechanismen mit menschlichen. Darüber hinaus soll während meiotischen Reifung Oozyten transkriptionell unterdrückt und alle notwendigen Proteine aus bereits vorhandenen, maternalen mRNAs umgerechnet. Dieses preisgünstige Modell ermöglicht exogene mRNA, um perfekt mit einem effektiven Übersetzungs integriert werden. Hier ist ein Protokoll für die Bewertung der Übersetzung mit einem Faktor von Interesse (hier eIF4G1) mit stor beschriebened mütterlichen mRNA, die die ersten sind, um polyadenylierte und während Oocytenreifung als physiologischer Auslese übersetzt werden. Zuerst mRNA durch in vitro-Transkription von Plasmiden von Interesse (hier eIF4G1) synthetisiert werden in Oozyten und die Kinetik der Oocytenreifung von Keimbläschen Schlagerkennung injiziert wird bestimmt. Die untersuchten mütterlichen mRNA Ziel ist die Serin / Threonin-Proteinkinase mos. Seine Polyadenylierung und die anschließende Übersetzung zusammen mit der Expression und Phosphorylierung von Proteinen des MOS-Signalkaskade in Eizellreifung Beteiligten untersucht. Variationen des derzeitigen Protokolls zu unterbreiten Translationsfehlern werden ebenfalls vorgeschlagen, um der Allgemeinheit zu betonen. Angesichts der zunehmend Hinweise, dass aberrante Proteinsynthese kann in der Pathogenese von neurologischen Erkrankungen beteiligt sein, bietet ein solches Modell die Möglichkeit, leicht zu beurteilen diese Beeinträchtigung zu erkennen und neue Ziele.
Introduction
Proteine sind wesentliche Elemente des zellulären Lebens und damit zu größeren Maßstab des Organismus. Sie sorgen für die Mehrzahl von Zellfunktionen einschließlich der Struktur, Transport, Reaktionskatalyse, Regulierung der Genexpression usw. Ihre Expression ist das Ergebnis eines komplexen Mechanismus der Übersetzung für die Konvertierung einer mRNA in Protein. Die Übersetzung wird auf verschiedene Kontrollen unterzogen, sich anzupassen und die Genexpression nach den Zell Anforderungen während der Entwicklung und Differenzierung, Alterung, physiologischen Spannungen oder pathologischen Erscheinungen regulieren.
Über Internal Ribosome Entry Segment (IRES) Strukturen und CAP-unabhängige Translation Enhancers (cap-abhängige, cap-unabhängig: Die Übersetzung wird in 3 Phasen (Initiation, Elongation und Termination) und präsentiert 3 Einleitung Übersetzungssysteme, um auf diese Bedürfnisse zu reagieren unterteilt CITE).
Meisten eukaryotischen mRNA in einer cap-depe setztenndent Weise über die 7-Methylguanosin 5'-Triphosphat Kappe, die als Erkennungsfunktion während der Proteinsynthese dient. Diese Kappe bindet an eIF4E, einer Komponente von eIF4F Komplex mit eIF4G1 und eIF4A. Mit anderen Partnern wie Poly (A) Binding Protein (PABP) verbunden sind, eIF2-GTP-Met-tRNA Met, damit diese Translationsinitiationsfaktoren, um mRNA zirkularisieren und 43S-Komplex zur Verbesserung seiner Zugänglichkeit zu Formen bis zum August Initiationscodon Anerkennung 1. Dieses Ereignis entspricht dem Ende der Translationsinitiations dh dem ersten Schritt der Übersetzung.
CAP-unabhängige Translation von mRNA-Codierung für essentiellen Proteine unter Stressbedingungen, die beispielsweise Zellproliferation und Apoptose induzieren. Dieser Mechanismus beinhaltet Sekundärstrukturen der mRNA-5'-untranslatierten Region (UTR) bezeichnet IRES, dem Carboxy-terminalen Ende mit eIF4G1 eIF4A und dem 43S-Komplex assoziiert. Die Bindung dieser 43S vorge Einleitung complexe IRES leitet die Kappe unabhängige Translation ohne eIF4E Faktor 2,3.
Schließlich ist ein weiterer Übersetzungsmechanismus noch nicht gut verstanden unterstützt diese CAP-unabhängige Translation Aktivität unter Stressbedingungen über CITE Strukturen innerhalb mRNA UTR 4 entfernt.
Durch diese verschiedenen Formen der Übersetzung, die sich um ihre Initiationsschritte spielt Übersetzung eine entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase und jede Änderung in einer dieser Prozesse würde somit beeinflussen den Organismus mit kleinen bis großen Skaleneffekten. In der Tat ist die Einleitung einer geschwindigkeitsbestimmenden Schritt über die richtigen Übersetzungsprozesse von mRNA in Proteine und damit das Ziel von zahlreichen Kontrollen und Regulierungspunkte 5. Ob es sich für die letztere oder für Komponenten dieser Prozesse, wenn man stellt sich heraus, um defekt zu sein, wird es das vorgegebene Gleichgewicht in der Zelle zu stören und so konnten pathologische bedingungen führengen. In diesem Zusammenhang haben Mutationen in Translationsfaktoren in mehreren Erkrankungen einschließlich neurodegenerativer Störungen wie `Leukoenzephalopathie mit verschwindender weißen Materie' (eIF2B1-5 Untereinheit) 6, in Walcott-Rallison Syndrom (EIF2AK3 kodierenden Gen PERK) 7, potentiell in involviert Parkinson-Krankheit (eIF4G1 p.R1205H) 8. Es ist daher wichtig, um zelluläre und molekulare Studien dieser mutierten Proteine durchzuführen, um das Wissen über die Entwicklung der Krankheit und dem allgemeinen Verfahren der Translationsinitiation zu erhöhen.
Zur Durchführung dieser Studien ist es wichtig, um die am besten geeigneten Modellen wählen, die Konsequenzen dieser Mutationen beobachten Xenopus laevis Oozyten sind besonders gut aufgrund ihrer physiologischen und biochemischen Eigenschaften angepasst:. Physiologische Synchronizität (in der Phase G2 des Zellzyklus blockiert) , hohe Kapazität der Proteinsynthese (200-400 ng / Tag / Eizelle), hohe Anzahl von extrahierten oocytes aus demselben Tier (800-1.000 Oozyten / weiblich) und der Zellgröße (1,2-1,4 mm Durchmesser), die ihre Handhabung vereinfacht. Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten synthetisierte mRNA leicht durchgeführt werden, um die Translation Schritte zu zerlegen. In dieser Ansicht zeigt es andere Vorteile. Angesichts der Geschwindigkeit der Meiose Progression und der Übersetzung nach der mRNA Mikroinjektion (~ 24 Stunden), Xenopus-Oozyten eine schnelle System im Vergleich zu rekonstituierten Zellsystemen (aus E. coli extrahiert, Weizenkeime oder Kaninchen-Retikulozyten ...), in der eine mRNA ist setzten mit einer reduzierten Translationsrate und mit einer niedrigeren Geschwindigkeit. So werden die Auswirkungen einer Mutation in einer mRNA eingeführt schnell beobachtbar und einfach in verschiedenen Oozyten untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Xenopus-Oozyten, dass mütterliche mRNAs sind latent und Proteintranslation vor Progesteron Stimulation blockiert. Zugabe von Progesteron ist ein geeignetes Mittel zur Steuerung des Übersetzungs Induktion. Cytoplasmic polyadenylation nicht während der Oogenese auftreten. Es beginnt bei der Eizellreifung in Progesteron-stimulierten Eizellen in einer zeitlichen Reihenfolge und setzt sich während der frühen Entwicklung und könnte verwendet werden, um die verschiedenen Schritte der Übersetzung zu untersuchen.
Die Polyadenylierung mos mRNA ist unter den ersten, auftreten, und es gehört mit Aurora A / Eg2, histonähnlichen B4 mRNA zur Klasse der "frühen Reifung" Gene als in Charlesworth et al definiert. (2004) 9. Die Translations Induktion der "späten" mRNA wie Cyclin A1 und Cyclin B1 tritt um die Zeit der Keimbläschen Aufteilung (GVBD). MOS-mRNA kodiert für ein Serin / Threonin-Proteinkinase. Die Übersetzung ist von entscheidender Bedeutung, da sie die MAP-Kinase-Kaskade, die indirekt aktiviert die Eizellreifung induziert. Zwar in Reaktion auf Progesteron, Polyadenylierung mos-mRNA wird durch ein Verfahren mit Aurora A / Eg2 regulatorische Proteine und andere RNA-Bindungsproteine mit verbesserten the 3'UTR mos-mRNA. Diese erhöhte Polyadenylierung mos-mRNA führt zu einer Erhöhung des MOS Proteinebene, die wiederum aktiviert MEK1. Dieser Vorgang vermittelt die Aktivierung von extrazellulären signalregulierten Kinase 2 (ERK2) (Abbildung 1). Diese Signalkaskade kann dann lösen die Reifung M-Phasen-fördernde Faktoren, einen Komplex von Cyclin B und Cdc2 Kinase gebildet und schließlich zu meiotische Wiederaufnahme.
Daher in Xenopus laevis Oozyten, könnte die Untersuchung der mütterlichen mRNA wie MOS leicht verwendet werden, um ihre Translatierbarkeit mit mehreren Endpunkten ihrer effiziente Polyadenylierung der Übersetzung mehrerer MOS-Signalkomponenten, darunter auch die Bestimmung des GVBD Geschwindigkeit testen. Dieses System ist daher interessant, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren ohne Einmischung von neu transkribierten mRNA oder der Transfektionseffizienz zu bewerten, Probleme oft mit eukary vorkommendeOhrzellstudien.
Hier wird ein Protokoll eingesetzt, wo eine Mutante eIF4G1 mRNAs mikroinjiziert in Xenopus laevis Oozyten und die Übersetzung der mütterlichen mRNA getestet. In Gegenwart von einem Defekt in GVBD Progression, mos mRNA Polyadenylierung, die durch die Eizelle meiotischen Zellzyklus und für die nachfolgende Übersetzung der frühen und späten Klasse mRNAs essentiell für Progression ermittelt. Die Phosphorylierung Aurora A / Eg2 und ERK wird auch untersucht, um die Folge der mos deregulation.Thus bestätigen Xenopus-Oozyten, sind ein einfacher Weg, um verschiedene Schritte der mRNA-Translation zu analysieren.
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Protocol
Alle Xenopus Experimente wurden bei der Tierhaltung der Universität Lille 1 nach den Regeln des Gemeinschaftsrahmens des Europäischen (86/609 / EWG) für Labortierversuche durchgeführt. Das Tier-Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comité d'Ethique en Experimentieren Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Oocyte Handhabung
- Bereiten Sie die Narkoselösung: 1 g Tricainmethansulphonat Pulver in einem 1 l sterilem Wasser.
- Plunge weiblichen Xenopus laevis in diese Lösung, decken Sie den Becher, um das Entweichen zu vermeiden und warten Sie etwa 45 Minuten für das Tier vollständig sediert werden (ohne Reaktion an einem Bein Pinch).
- Waschen Sie den Frosch mit Seife und spülen mit Leitungswasser legen Sie dann das Tier auf seinem Rücken auf saubere Aluminiumfolie.
- Klemmen Sie die Haut des lateralen Teil des Bauches und an der Eierstöcke Ebene mit einer Pinzette.Einen Einschnitt von etwa 1 cm mit einer Schere vor dem Gebrauch mit Ethanol 70% gereinigt. Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt ist tief genug, und die zugrunde liegenden Bauchwand zu Exzision des Eierstockgewebe, in dem mehrere Eizellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung zu finden sind erlaubt zu erreichen.
- Sezieren die Ovar Lappen, wäscht sie 4 mal in einer Petrischale (50 mm) mit ND96-Medium (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES auf pH 7,4 mit NaOH, ergänzt mit 50 ug / ml Streptomycin / Penicillin, 225 ug / ml Natriumpyruvat, 30 ug / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 1 & mgr; l / ml Tetracyclin), um alle Spuren von Blut und Trümmer zu entfernen.
Hinweis: Tetracycline ermöglicht eine optimale Konservierung und eine gute Erholung nach Mikroinjektion Behandlung. - Speichern sie in einer Petrischale abgedeckt im Medium bei 14 ° C eingetaucht, so dass ihre Erhaltung für eine Woche.
- Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit Tierarzt resorbierbaren tHread und eine Nähnadel (3 oder 4 Maschen notwendig).
- Legen Sie das Tier in einem Becherglas ohne Wasser und feuchter die Haut mit Leitungswasser, bis der Frosch ist wieder in Bewegung. Das Becherglas, um eine Flucht zu verhindern.
- Trennen Sie sorgfältig die Eierstöcke Keulen in dem Medium, in Gruppen von 5 bis 10 Oozyten unter Verwendung von 2 Pinzetten unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Oozyten im Stadium VI. Sie können durch i mit einem braunen pigmentierten Tiermast und gelben vegetative Pol durch eine klare Band ii) ihrer Größe besser als 1,2 mm Durchmesser 10 getrennt erkannt werden) ihre Form und Farbe.
- Während 45 Minuten die ausgewählten Oozyten in einer Collagenase-Lösung (1 mg / ml Collagenase A aus Clostridium histolyticum, in ND96 gelöst, ohne Tetracyclin) in einer Petrischale unter leichtem Schütteln inkubieren, um die Eizelle defolliculation erleichtern (Kollagenase verdaut Eizelle / follikulären Zellverbindungen). Spülung der Oozyten 3 oder 4 mal mit ND96-Medium bei 14 gehalten° C.
Hinweis: die Oozyten weniger oder mehr als 45 min, da das Risiko von Oozyten Oberflächenproteine zerstören und was eine schlechte Lebensfähigkeit inkubieren nicht. Collagenase-Behandlung kann spontane GVBD induzieren. - Oozyten Inkubieren im Medium für 3-4 Std. Entfernen Follikelzellen mit feinen Pinzette unter binokularen Lupe und halten sie bei 19 ° C in ND96 Medium.
2. Herstellung der mRNA-Synthese
- Linearisieren 5 ug der folgenden Plasmide durch enzymatischen Verdau mit Pme I-Enzym.
HINWEIS: pcDNA6.2 / V5-DEST, die ein 1599 Aminosäuren eIF4G1 cDNA Wildtyp (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST, die eine eIF4G1 dominant negative cDNA (eIF4G1-DN) mit Mutationen c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - und c.2126T> G im Bereich der Wechselwirkung zwischen eIF4G1 und eIF4E an Position 612 bis 618 des entsprechenden Proteins störenden Interaktion between eIF4G1 und eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP enthält Chloramphenicolacetyltransferase (GFP). Vorzubereiten 2 Mischungen für jede der 3-Plasmiden: Die erste darunter Pme I-Enzym, und die zweite ohne Enzym als Kontrolle. - Ausfällung von Plasmid-DNA unter Verwendung eines klassischen Ethanol Verfahren und Resuspendieren in 20 ul Nuklease-freies H 2 O.
- Bestimmen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer. Die Konzentration sollte überlegen sein zu 150 ng / ul an cRNA zu transkribieren.
- Versuch 1 & mgr; l Proben und deren Steuerungen mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die Plasmid-Linearisierung zu verifizieren.
- Verwenden ein Kit zur in vitro-Transkription und cRNA Reinigung gemß den Herstelleranweisungen. Die transkribierten cRNA werden in 20 & mgr; l Nuklease-freies H 2 O resuspendiert Proben können bei -80 ° C, wenn erforderlich gespeichert.
- Bereiten Sie die Migration MOPS 10X-Puffer, der 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilisieren Lösung mit einem 0,45 um Filter. Aktien des von der Licht bei RT geschützt werden, um Oxidation zu vermeiden Lösung Lösung.
- Reinigen Sie die Elektrophoresetank nacheinander mit NaOH, HCl und gründlich mit doppelt gefiltertes Wasser für einen O gespült / N, um RNase zu vermeiden und zu verhindern, RNA-Abbau.
- Werfen ein 1,5% Agarose-Gel mit MOPS und Formaldehyd. Warm bis zur vollständigen Agarose-Auflösung und abkühlen lassen bis 55 ° C. Unter Abzug werden 0,1 Volumen MOPS 10X, 6,6% Formaldehyd und 4 ug Ethidiumbromid (10 mg / ml). Gießen Sie das Gel unter dem Abzug und warten Sie etwa 1 Stunde für das Gel zu härten.
Hinweis: Formaldehyd und Ethidiumbromid sind giftig. - Vorbereitung der Proben für die Migration in einem 0,2-ml-Röhrchen mit 1 ul cRNA, 8,8% Formaldehyd, 60% Formamid und 0,1 Volumen MOPS 10X. Inkubation für 3 min bei 70 ° C und legte die Röhrchen auf Eis für 10 min. Centrifuge Proben paar Sekunden auf5.000 x g. In 2 ul Gelladepuffer.
Hinweis: Formamid ist giftig. - Laufen Proben für 20 min bei 90V. Tränken Sie das Gel in Nuklease-freies H 2 OO / N, um das Gel vor der Analyse ist es, die Qualität zu überprüfen cRNA entfärben.
- Bestimmen Sie cRNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lagern Sie sie bei -80 ° C.
3. Mikroinjektion von synthetisierten RNA und Eizellen Reifung Stimulation
- Bereiten Sie die notwendige Ausrüstung für Eizellen Mikroinjektion. Verwenden Sie einen Mikropipette Abzieher für kleine Glaskapillare zu ziehen. Unter Stereomikroskop, brechen Sie das Ende der Kapillare mit der Pinzette, um ein stumpfes Ende zu schaffen. Füllen der Kapillare Mikropipette mit Mineralöl unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einem Millipore-Filter 0,45 um am gegenüberliegenden Ende. Montieren Sie die Mikropipette auf die Mikroinjektion Pipette. Wählen Sie eine genaue Mikropipette vom Hersteller kalibriert, um eine gute Genauigkeit, wenn sie mit entsprechenden Glaskapillare verwendet zu geben.
- Führen Sie die Mikroinjektion 1-2 Stunden nach defolliculation, notwendige Verzögerung für Eizelle Erholung an Eizellen gehalten bei 14 ° C. Verwenden Petrischalen mit dem Boden kratzte mit einer Pinzette, um eine Klebefläche für Eizellen zu erstellen und füllen sie mit ND96 Medium.
- Ordnen Oozyten entlang einem Kratzspur in einer Petrischale ermöglicht eine sukzessive Injektion von Oozyten mit der Kapillare Mikropipette in einem Winkel von 45 ° C.
- Injizieren in die Oozyte Äquatorialzone unterhalb der pigmentierten Tierbereich für eine optimale Diffusion der Proben im Zytoplasma. Legen Sie nur den dünnsten Teil der Kapillarspitze auf etwa 150-200 & mgr; m Tiefe.
- Injizieren 30 ng cRNA von den verschiedenen Plasmiden in einem Volumen von 60 nl in einer ersten Oozyte jeweils erhalten. Nach der Injektion, warten Sie 5-10 Sekunden, bevor Sie die Kapillarspitze zu Proben escape (2A) zu vermeiden.
Hinweis: Nehmen Sie 120 nl nicht überschreiten. Spritzen Sie so langsam, wie Sie können. Ein Steuer mit destilliertem Wasser wird empfohlen. - Verschieben Sie manuell die Petrischale, um die nächste Eizelle zu injizieren.
Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Spitze nicht durch die Erzeugung eines kleinen Impulses aus dem Bad-Lösung nach 2 bis 3 Mikroinjektionen verstopft. - Übertragungs injizierten Oozyten in 24 Vertiefungen-Kulturplatten (10 Oocyten / Vertiefung) werden mit 3 ml frischem ND96 Medium gefüllt und lassen sie auf 19 ° C.
- Die Eizellen in ND96 inkubieren mit Progesteron (PG) (2 ug / ml) zu der meiotischen Reifung (GVBD) bei 19 ° C ausgelöst werden, 15 Stunden oder 4 Stunden nach der Mikroinjektion von polyadenylierter cRNAs jeweils von pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 und pcDNA6 erhalten .2 / C-EmGFP verwendet als Kontrolle (Abbildung 2A).
Anmerkung: Co-Injektion von Fluoreszenzmarker mit der cRNA ist ein schönes Werkzeug, um sicherzustellen, dass die cRNA injiziert wurde und blieb in der Oocyte. Zuführen, Vorversuchen unter Verwendung eines cRNA von Interesse mit einem GFP-Tag. - Microinject wie in # 3.5 unterschiedlichen Verhältnissen (1: 3, 2: 2; 3: 1) von polyadenyliert eIF4G1-WT und eIF4G1-DN cRNAs um test die Übersetzung Wirkung eIF4G1-WT cRNAs auf dem mutierten Phänotyp (2D).
4. Keimbläschen Pannen Bestimmung
- Zählen Sie die Anzahl der reifen Eizellen nach der PG-Stimulation durch die Beobachtung der Gegenwart von einem weißen Fleck auf der schwarzen Tiermast mit einem Stereomikroskop. Wiederholen Sie das Zählen jede Stunde bis zum vierundzwanzigsten Stunde (2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Analyse
- Homogenisierung der Gruppe von 10 Oozyten von Hin- und Herbewegungen mit einer Mikropipettenspitze, bei 4 ° C in 200 & mgr; l in dem folgenden Puffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl 2, 1 mg / ml Rinderserumalbumin, 10 mg / ml Leupeptin, 10 mg / ml Aprotinin, 10 mg / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 10 mg / ml Benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM Natriumvanadat.
- Zentrifuge Proben für 15 min bei 10.000 × g, um das Lipid (obere Phase) und der Membran (untere Phase) f entfernenractions. Sammeln Sie die cytoplasmatische Fraktion, speichern eines Aliquots auf Proteinkonzentration zu bestimmen, und die restlichen mit Laemmli oder ein Bis-Tris-Probenpuffer (1: 1).
Anmerkung: Bis-Tris Gelen und Ladepuffer einen neutraleren pH die Proteine durch Hydrolyse schützt - Wärme 20 ug Probe bei 95 ° C für 10 min. Laden jeder Probe in die Vertiefungen der Acrylamidgel. Legen Sie das Gel in einem Behälter mit geeigneten Puffer.
- Führen eine Elektrophorese für 1 h bei 200 V.
- Realisieren WB in TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, das 10% Rinderserumalbumin) mit einem Ziege-Anti-Aurora-A / Eg2 (1: 3000, 2 h) oder mit Kaninchen-Anti -Aurora A / Eg2-P (1: 1000, O / N bei 4 ° C), Maus-anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), Ziege-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), Kaninchen-Anti-mos (1: 5000, 4 h), Kaninchen-Anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use Antikörper Maus-anti-V5 (1: 10.000, 2 h) und Kaninchen-Anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (als Lade Kontrollen).
- Washdie Membran 3 x 10 min in TBS-Tween und inkubiere 1 h entweder mit einem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen oder Anti-Ziege (IgM) Meerrettichperoxidase-markierter sekundärer Antikörper in Verdünnungen von 1: 5.000, 1: 7.500 bis 1 : 5,000 auf.
- Führen Sie 3 Waschungen von 10 min in TBS-Tween und erfassen die Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem Advanced ECL-Nachweissystem.
6. Polyadenylierung Assay
- Probe 5 Oozyten pro Bedingung in einem 1,5 ml. Mit 1 ml Nuklease-freies PBS 1X (pH 7,4) waschen. Die folgenden Schritte werden unter Abzug durchgeführt werden.
- Auszug RNA unter Verwendung eines klassischen organischen Verfahren (siehe Anweisungen des Herstellers).
- Erholen RNA durch Zentrifugation (10.000 × g) für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und an der Luft trocknen RNA für 10 min.
- Resuspendieren RNA-Pellet in 30 & mgr; l Nuklease-freies H 2 O.
- Nehmen Sie 15 ul der Proben in ein neues Röhrchen und fügen Sie 85 ul Nuklease-freies H 2 O. Bereinigen Sie diese Proben, um ihre Qualität zu Spalte Kieselsäure ist nach den Anweisungen des Herstellers zu verbessern. Elution der RNA unter Verwendung von 30 ul Nuklease-freies H 2 O
- Versuch 1 ul-Proben mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die RNA-Integrität zu überprüfen.
- Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
- Vorzubereiten 2 Ligierungsgemische pro Bedingung (dh eIF4G1-WT, eIF4G1-DN und die H 2 O-Kontrolle) mit den folgenden Reagenzien: 10 U RNA-Ligase, 0,1 Volumen 10x-Puffer, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50% 0,1 ug Primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 und bringen das Endvolumen auf 10 ul mit Nuklease-freiem H 2 O. Hinzufügen in dem ersten Gemisch aus RNA Oozyten ohne PG-Stimulation erhalten und in der zweiten Mischung RNA aus PG erhalten stimuliert Oozyten.
- Inkubation für 1 h bei 37 ° C dann 20 min bei 65 ° C, um das Enzym zu inaktivieren.
- Unsea cDNA Reverse Transkription (RT) Kit. Bereiten Sie die RT-Mischung, je Rohr: 0,1 Volumen 10X RT-Puffer, 0,1 ug Primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP-Mischung, 50 U der reversen Transkriptase und komplett mit Nuklease-freies H 2 O auf ein Endvolumen von 10 & mgr; l. Zugabe von 10 ul Ligationsreaktions zuvor erhaltenen. Führen Sie die RT unter dem vom Hersteller beschriebenen Bedingungen.
- Vorbereitung Polymerase Chain Reaction (PCR), die aus je Röhrchen: 0,1 Volumen Puffer 10X, 1,5 mM MgCl 2, 133 & mgr; M dNTP-Gemisch, 0,2 uM spezifischen Primer, 0,2 & mgr; M Primer P2, 0,025 U Taq-Polymerase, 1 & mgr; l cDNA und komplett mit Nuklease-freies H2 O auf ein Endvolumen von 50 ul. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, [95 ° C für 1 min, 56 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 s] * 40 Zyklen, 72 ° C für 10 min 9. Die spezifischen Primer sind wie folgt: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon-ähnlichen B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Bereiten Sie einen 3% igen Agarosegel. Fügen Sie in jeder PCR-Produkte 10 ul Auftragspuffer. Führen Sie das Gel mit 10 ul der Proben bei 110 V für eine optimale Migration. Analyse des Gels nach 10 und 20 Minuten, um eine Änderung der Größe des Reflexions Länge des Schwanzes poly (A) und somit der RNA-Reifung, die eine Voraussetzung für die Übersetzung ist zu beobachten.
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Representative Results
Kinetic Reifung des Xenopus-Oozyten und die Bestimmung des Prozent Eizelle GVBD nach 24 Stunden von PG-Stimulation (2B, 2C):
Um die translatorische Folgen der eIF4G1-DN Genmutationsversuch die Reaktion auf PG in Xenopus laevis Oozyten mit cRNA eIF4G1-DN mikroinjiziert wird eIF4G1-WT und auf andere Steuerbedingungen (H 2 O, GFP) verglichen. Die Kontrollen zu ermöglichen, das Auftreten von Oozyten Mikroinjektion unabhängig von der Art des eingespritzten cRNA oder eIF4G1 Expression beurteilen.
Die kinetischen Reifungen von 10 Oozyten gekennzeichnet durch mikroinjizierten Kontrollbedingungen (H 2 O und GFP) ähneln WT und die Anzahl der unterzogen GVBD sind sehr dicht nebeneinander bei 12 und 24 Stunden nach PG-Stimulation (2B). Nach 24 Stunden Reifung der Eizellen erreicht 95,7% für WT, 97,1% für H 2 O und 97,5% für die GFP (Fi Abbildung 2C). So Mikroinjektionen mit H 2 O oder Steuer cRNAs oder eIF4G1 cRNAs haben wenig Einfluss auf Eizelle Meiose Release. Umge 8 Stunden nach PG-Stimulation, wird die Anzahl der Oozyten mit eIF4G1-DN cRNAs läuft GVBD mikroinjiziert Vergleich zu eIF4G1-WT cRNAs (2B) .Die Meiose Freisetzung eIF4G1-DN gegen eIF4G1-WT Oozyten um 85,8% verringert signifikant verzögert und 77,4% nach 12 h und 24 h nach der Stimulation bzw. PG (2C). Bemerkenswert ist auch, dass 13 Stunden nach PG-Stimulation, die Anzahl reifer Oocyten maximal für alle Bedingungen mit Ausnahme eIF4G1-DN für die der maximale nur 20 Stunden nach PG-Stimulation erreicht erreicht. Somit ist die Anwesenheit von eIF4G1-DN-Mutation führt zu schlechteren Eizelle Meiose Release Vergleich zu eIF4G1-WT.
Wiederherstellung der Oocytenreifung in Gegenwart eIF4G1-DN dank der eIF4G1-WT (2D):
_content "> Um zu bestimmen, ob die eIF4G1-DN cRNA Mikroinjektion beeinträchtigt oder blockiert die Oocytenreifung, unterschiedliche Verhältnisse von eIF4G1-WT und eIF4G1-DN cRNAs co-mikroinjiziert. Unter diesen Bedingungen ist eine Erhöhung der Oocytenreifung ist wie die Höhe der beobachteten eIF4G1-WT cRNA zu erhöhen und die der eIF4G1-DN cRNA decrease.While Reifung in 17,5% der Oozyten eine Dosis eIF4G1-DN cRNAs beobachtet, gelangt dieser Anteil 76,7% mit Co-Mikroinjektion von 3 Dosen eIF4G1-WT cRNAs und die Anwesenheit einer Dosis von eIF4G1-WT cRNAs führt zu 95% der Oocytenreifung. Dieses Experiment zeigt, dass die Reifung Defekt Xenopus-Oozyten mikroinjiziert eIF4G1-DN ist nicht irreversibel, und teilweise wiederhergestellt werden.Expression mos Signalisierung auf WB als Indikator für Translationsfähigkeit vor und nach der PG-Stimulation (2E) beobachtet Proteinen:
Der Proteingehalt von V5-Tag in Oozyten, die eIF4G1-WT und eIF4G1-DN sind ähnlich reflektierenden ähnlichen Mikroinjektion Effizienz. Das Niveau der Proteinbeladung als Kontrolle verwendet Rsk Protein ist ebenfalls ähnlich in allen Bedingungen vor und nach der PG-Stimulation. Die Expression des GFP-Proteins ist auch in Oozyten, die mit GFP-cRNA mikroinjiziert vorliegenden stimuliert oder nicht mit PG. Diese Daten zeigen, dass die Mikroinjektion und die Überexpression von eF4G1 keine Übersetzung des GFP stören. Jedoch ist keine GFP-Proteinexpression vor und nach der PG-Stimulation bei Oozyten, die eIF4G1-DN nachweisbar. Wie erwartet, keine endogene mos-Expression in Abwesenheit von PG-Stimulation nachweisbar. Darüber hinaus mos Ausdruck wird in der eIF4G1-WT beobachtet und H 2 O-Steuerbedingungen nach PG-Stimulation in Übereinstimmung mit früheren Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression von eIF4G1-WT hat wenig Auswirkungen auf endogene mos 16. Umgekehrt ist eine beträchtliche Abnahme der mos-Expression nach PG-Stimulation bemerkbar.
Die Pro-Protein Expression einiger Komponenten des MOS-Signalkaskade ist ebenfalls getestet. Zum Beispiel ist Aurora A / Eg2 Protein stromauf wirkende Induktion und keine Erfassung seines Protein Deregulierung oder seiner phosphorylierten Form nach PG-Stimulation beobachtet induzierte mos. Umgekehrt wird eine Deregulierung der ERK2 Phosphorylierung durch mos induziert in Gegenwart eIF4G1-DN beobachtet.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß die endogene Expression von MOS-RNA in Protein und mos abhängigen ERK2-Aktivierung wird durch die Expression von eIF4G1-DN betroffen.
mRNA Polyadenylierung (2F):
Polyadenylierung von mehreren mRNAs (mos, Cyclin A1, Cyclin B1 und Histon-ähnlichen B4) für Xenopus Oozyten notwendig Meiose Erholung wurde getestet. Die durchgeführte Test ermöglicht es, festzulegen, ob eine Erhöhung der Amplimer Größe entsprechend der Länge der Poly (A) Schwanz der mRNA nach PG Stimulierung vorliegt. Tatsächlich mit PG Stimulierung der Zusatz eines Poly (A) -Schwanz ist unter allen Bedingungen, einschließlich der eIF4G1-DN Mutation beobachtet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der MAPK-Kaskade Aktivierung. Bei hormonellen Stimulation von PG raschen Veränderungen in den Aktivitäten verschiedener Enzyme treten auch die der Aurora A / Eg2 und CPEB Weg. Hyperphosphorylierung von Aurora A / Eg2 führt zu CPEB (Cytoplasmic Polyadenylierung Element Binding Protein) Phosphorylierung. Phosphoryliert CPEB erkennt den CPE (Cytoplasmic Polyadenylierung Element) auf 3'UTR mos mRNA rekrutiert CPSF (Spaltung und Polyadenylierung Spezifität Factor) und aktiviert mRNA Polyadenylierung von PAP (Poly (A) -Polymerase). PG Stimulation fördert auch sukzessive Maskin Phosphorylierung sowohl über Wirkung von PKA und cdk1, Maskin / eIF4E Dissoziation und eIF4E / eIF4G1 Vereins. eIF4G1 rekrutiert transnung Einleitung Partnern wie PABP die mit eIF4G1 interagiert und erkennt die Poly (A) Schwanz. Einmal synthetisiert, mos aktiviert MEK / MAPKK durch Phosphorylierung, die abwechselnd aktiviert ERK2 / MAPK durch Phosphorylierung. Diese sogenannte MAPK Kaskade in den meiotischen Prozesse durch Steuerung M-Phasen-Eintrag kinetische, Spindel Morphogenese und die Hemmung der DNA-Synthese beteiligt sind. Die Kaskade in einer positiven Rückkopplungsschleife, die die Proteinsynthese aufrecht eingebettet. Man muss beachten, dass der MOS nicht nur aufgefordert, für GVBD Aktivierungsprotein synthetisiert werden, das heißt, sind Cyclin B erforderlich ist, um die Reifung Leistung umgesetzt werden.
Abbildung 2. Die eIF4G1-DN-Mutante wirkt Eizellreifung und Translation in Xenopus laevis. RNA aus Plasmiden V5-markierten Proteine eIF4G1 (WT und DN) kodiert, abgeleitet sindin Xenopus laevis Oozyten mikroinjiziert. Nach 15 h wird die Reifung der Oozyten von Progesteron (PG) stimuliert (Experimente wurden mindestens 3 mal durchgeführt, und repräsentative Ergebnisse sind gezeigt). (A) Schematicoverview Experimentier Protokoll. Die Injektionen von eIF4G1 und / oder GFP cRNAs sind durch Pfeilspitzen vor dem PG Stimulation vertreten. Proben für RNA und Proteine Analysen wurden mit 2 Zeitpunkte (PG-Stimulation und am Ende des GVBD kinetische) erhalten wurde. (B) Kinetische Reifung von 10 Oozyten gekennzeichnet durch GVBD wird 24 Stunden nach PG-Stimulation getestet. Eine Verzögerung bei der Eizellreifung ist in Oozyten eIF4G1-DN cRNAs mikroinjiziert Vergleich zu denen mit eIF4G1-WT cRNAs mikroinjiziert beobachtet (C) Prozentsatz der reifen Eizellen 24 h nach der PG-Stimulation (n = 4; * p <0,05).. Eine Abnahme der Eizellreifung ist bei den Patienten mit eIF4G1-DN cRNAs Vergleich zu eIF4G1-WT cRNAs mikroinjiziert beobachtet. (D) Reversion Phänotyp Beurteilung der Oozyten mit eIF4G1-DN-Mutante cRNAs und eIF4G1-WT cRNAs zeigen, dass die Translationsmaschinerie noch funktionsfähig ist, wenn eIF4G1-WT ist mit dem mutierten hinzugefügt mikroinjiziert. (E) Proteine werden aus Eizellen entnommen und deren Niveaus durch Immunoblotting-Analyse bestimmt . Störungen der ERK2 Phosphorylierung, mos und GFP-Expression in den eIF4G1-DN Bedingungen eingehalten werden. (F) Polyadenylierung der mos, Cyclin A1, Cyclin B1 und Histon-ähnlichen B4 mRNAs von Eizellen stimuliert oder nicht mit PG nach der PCR-Amplifikation und Migration auf die beobachtet 3% Agarosegel. Nach PG-Stimulation wird eine Erhöhung in der Größe> 100 Polyadenylierungsstelle für alle Bedingungen nachgewiesen. Die erste Spur entspricht der Leiter.
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Discussion
Translation ist ein Mechanismus in der Pathophysiologie von zahlreichen menschlichen Erkrankungen einschließlich mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Zum Beispiel in der Parkinson-Krankheit mehrere Berichte vorgeschlagen, die Wertminderung in der Übersetzung mit erblichen Mutationen 8,12,13 verbunden.
Mehrere zelluläre Modelle stehen zur Verfügung, um die Translation zu studieren. Hier wird, um die translatorische Folgen einer Mutation in eIF4G1, die als dominant-negative Mutation Verringerung der Wechselwirkung zwischen eIF4G1 und eIF4E Partner 8 wirkt studieren laevis Xenopus Oozyten verwendet. Dieses Modell hat den Vorteil der Einfachheit, da es aus nur einem einzigen Riesenzell Erleichterung der Mikroinjektion von synthetischer mRNA zusammengesetzt, was zu einer beträchtlichen Menge an Material für biochemische Experimente und Erleichterung makroskopischen Beobachtungen der verschiedenen Phasen der Oocytenreifung. Auch dieses Verfahren ist zeitsparend im Vergleich zum stabilen ZellLinie Generation. Darüber hinaus haben mehrere Protokolle der Eizelle Vorbereitung und RNA Mikroinjektionen wurden bereits insbesondere zur Untersuchung des Zellzyklus oder nukleozytoplasmatischen Transport 14,15 beschrieben. In Bezug auf die Grenzen einer solchen Protokollen, um die Translation zu untersuchen, sollte eine besondere Aufmerksamkeit hinsichtlich der Konzentration von mRNA entnommen werden. Diese Konzentration sollte nicht zu hoch ist (nicht mehr als 30 ng in 120 nl maximal), um nicht den Übersetzungsvorgang zu sättigen. Unter Berücksichtigung dieses Element ist Xenopus-Oozyten ein attraktives Modell, um die Proteintranslation zu studieren, wie in Abbildung 2 mit einer mutierten Form von EIF4G1 Transkript vorgelegten Daten bestätigt.
Zwar in Gegenwart des mutierten eIF4G1, eine Beeinträchtigung in der Übersetzung des mos-Proteins festgestellt wird und mit einer Abnahme von 90% im Vergleich zu WT GVBD und die Bedingungen steuern korreliert. Umgekehrt hat die Überexpression von eIF4G1-WT nicht in der Modifikation in der Höhe o führenf mos Übersetzung in Übereinstimmung mit Literaturdaten 16,17.
Mehrere biologische Modifikationen könnten diese Ergebnisse erklären. Wissen, dass der MOS-mRNA sind mütterlichen Ursprungs und schon vor Meioseaktivierung von PG transkribiert sollten die gestörten Mechanismen zwischen den Transkriptions- und Translationsschritte erfolgen. Bemerkenswert mos-Übersetzung ist das Ergebnis einer Kaskade von molekularen Ereignisse, die von einem latenten mRNA der Zugabe des Schwanzes nach PG-Stimulation, um die Übersetzung 18,19 beginnen, ohne Poly (A) -Schwanz. So sind verschiedene Szenarien möglich, einschließlich: Defekte in Translationsinitiations könnte als Ursache für dieses Versagen vermutet werden, oder Mängel der Phosphorylierung der Faktor, der zu mRNA Polyadenylierung oder Standard-mRNA-Polyadenylierung des MOS-Transkripte von selbst mos könnte zu einem führen Translations Abnahme.
Um diese letzten 2 Mechanismen zu bewerten, wird die Expression dieser Faktoren, die von WB untersucht. AusdrückenIonenspiegel an phosphoryliertem Aurora A / Eg2 zum CPEB Phosphorylierung verantwortlich zeigten keine Störung in der Anwesenheit des mutierten eIF4G1. In die gleiche Richtung wird der MOS-mRNA Polyadenylierungs- oder andere mRNA Polyadenylierung in Gegenwart des mutierten eIF4G1 nach PG-Stimulation (2F) beobachtet. Um die Polyadenylierung Profil Northern Blot Experimenten zu empfehlen wäre weiter zu bestätigen, sowie die Durchführung von Saccharosegradienten Isolierung von Polysomen, um festzustellen, ob die Einstellung von mRNA an Ribosomen können 16 auftreten.
Also, indem man die ersten und letzten Elemente der Kaskade wurde die gestörte Stufe vermutet abwärts des Auftretens Polyadenylierungssequenz sein. Es ist auch wichtig, um zu testen, ob die mos Ausdruck Defekt ergab die zu erwartenden Auswirkungen auf die Phosphorylierung von ERK2. In Gegenwart der Mutation, die Abnahme der mos-Expression führte zu einer Abnahme der phosphorylierte ERK2 Niveaus und damit einen Defekt indie GVBD Progression (Abbildung 1 und 2E). Somit wird die eIF4G1 Mutation zu einer erwarteten Verringerung der MOS-Übersetzung verbunden sind. Die Deletion der Bindungsdomäne in eIF4E eIF4G1 Sequenz im eiF4G1-DN ist wahrscheinlich verantwortlich für eine Senkung der eIF4G1 / eIF4E Wechselwirkungen wie zuvor durch eine Co-Immunopräzipitation Studie 8, die die Komplexbildung stören eIF4F könnte vorgeschlagen.
Dieses Protokoll hat einige interessante Anwendungen in der Zellbiologie. Dieser Aufbau ist ideal, da Voruntersuchungen für eine Reihe von Grundsatzfragen in der Zellbiologie wie zum Beispiel: ein besseres Verständnis der Rolle von bestimmten Domains von Initiationsfaktoren und zu denen, die wesentlich für In-vivo-Translation oder Eizellreifung sind zu definieren. In diesem Zusammenhang Wakiyama et al. (2000) zeigte die Bedeutung der Oocytenreifung der Amino-terminalen Region von eIF4G1 enthaltend die Bindungsdomänen für eIF4E und PABP 17; um splic studierening Initiationsfaktoren 20; die durch Viren Entführung Host Translationsmaschinerie für ihre Zwecke über eIF4G1 Spaltung zum Beispiel mit der Hemmung der CAP-abhängigen Übersetzung IRES Strukturen ihrer mRNA, in cap-unabhängigen Weise 21 übersetzt verwendeten Mechanismen zu entschlüsseln; um die Rolle der Mutation in Translationsfaktoren auf die Zellzyklus zu studieren, da Oozyten sind Modelle der Wahl für solche Studie 22; um die wichtigsten Mechanismen, die Initiation der Translation, dh zu untersuchen, cap-abhängigen und cap-unabhängig zu definieren, ob ein oder mehrere Systeme in einem Proteinsynthese Störung beteiligt. Mehrere Varianten des derzeitigen Protokolls könnte leicht angewendet werden, um diese Ziele zu erreichen, einschließlich der Bestimmung der Translationseffizienz durch den Sonnenuntergang method23 oder Reporter-mRNA Mikroinjektion. Beispielsweise die Verwendung eines bicistronischen Reporter-mRNA, die ein erstes Cistron, in dem Renilla Luciferase CAP-abhängigen übersetzt werdenwohingegen das zweite Cistron enthält Firefly Luziferase wird via IRES übersetzt werden Strukturen sollten zu ermöglichen, um den Modus der Einleitung zu definieren, um feine Mängel und / oder Entschädigungen vorgebracht, um Übersetzung Homöostase. Darüber hinaus bieten derartige Luciferase Reporter-RNA Experimente den Vorteil, nicht auf potentielle Disruptionsmittel spezialisierten Entwicklungsmechanismen aufgrund unvollständiger Erhaltungsmechanismen mit menschlichen verlassen.
Parallel zu diesen grundlegenden Fragen könnten solche Protokoll als einen ersten Schritt, um nachteilige Bedingungen, die zu neurologischen Störungen beitragen könnten Adresse angewendet werden. In physiologischen Bedingungen, Translationsinitiationsschritte sind die privilegierten Ziele der Vorschriften unter Stressbedingungen, wie Oxidation, Hypoxie, Temperaturänderung, Bestrahlung und Nährstoffmangel. Unter diesen Bedingungen eine selektive Übersetzung von Transkripten, die Proteine codieren, die wesentlich gegen Spannungen und das Überleben der Zellen auftritt.Wenn dieser Prozess überwältigt, Spannungen zu pathologischen und aktiv an der Entwicklung von mehreren Erkrankungen des Nervensystems zu beteiligen. Zelluläre Stressfaktoren werden bei zahlreichen neurodegenerativen Krankheiten, wie Alzheimer und Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose oder Prionenerkrankung (Creutzfeld-Jakob) 24 und diese Spannungen induzieren die Aktivierung entfaltete Protein Response (UPR) beteiligt. Einer dieser Mechanismen UPR führt zu einer verringerten Übersetzung via PERK Aktivierung und der Phosphorylierung von eIF2a Untereinheit mit den Folgen zu stoppen Übersetzung durch die Verhinderung der Bindung zwischen eIF4F und 43S Komplexe 25. In Xenopus-Oozyten, die Zugabe von Oxidationsmittel und / oder bekannte mutierte Gene zu solchen Pathologien würden diese Spannungen zu imitieren, und festzustellen, ob die mutierten Gene können die Übersetzungsprozesse auswirken zugeordnet werden. Bei Parkinson-Krankheit beispielsweise die Einführung von eIF4G1 p.R1205H in xenopuns Oozyten assoziiert oder nicht Stressoren oder genomweite Analyse der mRNA polysomaler Profile könnte die Frage der Übersetzung Beteiligung an der Physiopathologie 26 adressieren oxidativem.
Alle diese Anwendungen in die Eizelle angewendet stellen somit ein großes Feld von Möglichkeiten, Übersetzung Störungen, die jetzt bekannt sind, um zu mehreren Erkrankungen einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht werden zu studieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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