Abstract
تخليق البروتين هو عملية أساسية في التعبير الجيني يؤثر العمليات البيولوجية المختلفة وخاصة التكيف مع الظروف البيئية. الخطوة بدء، الذي ينطوي على تجميع مفارز الريباسي في مرنا بدء كودون، تشارك عامل الشروع بما في ذلك eIF4G1. ترتبط عيوب في هذا معدل الحد خطوة من الترجمة إلى اضطرابات متنوعة. لدراسة العواقب المحتملة لمثل هذه deregulations، القيطم المورق البويضات تشكل نموذجا جذابا مع درجة عالية من الحفاظ على الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية مع الإنسان. بالإضافة إلى ذلك، أثناء النضج الانتصافي، وقمع transcriptionally البويضات ويتم تحويل جميع البروتينات اللازمة من قبل الايجاد، من mRNAs المستمدة أمومي. هذا النموذج غير مكلفة يمكن مرنا خارجي لتصبح متكاملة تماما مع ترجمة فعالة. هنا يوصف بروتوكول لتقييم الترجمة مع عامل الفائدة (هنا eIF4G1) باستخدام ستورإد مرنا الأمهات التي هي أول من مذيل بعديد الأدينيلات وترجمتها خلال نضوج البويضة كما قراءات الفسيولوجية. في البداية، مرنا synthetized من قبل في المختبر النسخ من البلازميدات الفائدة (هنا eIF4G1) يتم حقنها في البويضات وحركية نضوج البويضة بواسطة جرمينال الحويصلة كشف انهيار يتحدد. ودرس الهدف مرنا الأمهات سيرين / موس ثريونين البروتين كيناز. يتم التحقيق في تذييل بعديد الأدينيلات وترجمتها لاحقا إلى جانب التعبير والفسفرة من بروتينات موس يشير التعاقبي المشاركة في نضوج البويضة. الاختلافات في البروتوكول الحالي لطرح ويقترح العيوب متعدية أيضا التأكيد على انطباق العام لها. في ضوء الأدلة التي تخليق البروتين الشاذة قد تكون لهم علاقة في التسبب في اضطرابات العصبية الناشئة، ويوفر هذا النموذج فرصة لتقييم بسهولة هذا الانخفاض وتحديد أهداف جديدة.
Introduction
البروتينات هي العناصر الأساسية للحياة الخلوية وبالتالي في نطاق أكبر من الكائن الحي. وتضمن الجزء الأكبر من الوظائف الخلوية بما في ذلك الهيكل، والنقل، والحفز رد فعل، والتنظيم، التعبير الجيني الخ التعبير عنها هو نتيجة لآلية معقدة للترجمة السماح للتحويل من مرنا في البروتين. يخضع ترجمة لضوابط مختلفة للتكيف وتنظيم التعبير الجيني وفقا لاحتياجات الخلية، أثناء التطور والتمايز، والشيخوخة، والضغوط النفسية أو المظاهر المرضية.
وتنقسم الترجمة إلى 3 مراحل (بدء، واستطالة وإنهاء) ويعرض 3 أنظمة الترجمة بدء من أجل الاستجابة لهذه الاحتياجات: تعتمد على كأب، وقبعة مستقل عبر القطاعية دخول الريبوسوم الداخلية (IRES) الهياكل ومعززات ترجمة الحد الأقصى المستقلة ( CITE).
ويتم تحويل معظم مرنا حقيقية النواة في سقف DEPEndent الطريقة عبر 7-methylguanosine سقف 5'-ثلاثي الفوسفات التي هي بمثابة ميزة التعرف خلال تخليق البروتين. هذا الغطاء بربط eIF4E، وهو مكون من مجمع eIF4F مع eIF4G1 وeIF4A. يرتبط مع شركاء آخرين مثل بولي (A) بروتين (PABP)، eIF2-GTP-MET-الحمض الريبي النووي النقال الأرصاد الجوية، هذه العوامل ترجمة بدء تسمح لالتعميم مرنا وتحسين إمكانية الوصول إلى أشكال 43S معقدة حتى بدء أغسطس كودون الاعتراف 1. هذا الحدث يناظر نهاية أي ترجمة بدء، فإن الخطوة الأولى من الترجمة.
يستخدم ترجمة الحد الأقصى المستقل ترميز مرنا لالبروتينات الضرورية في ظل ظروف أكد أن تحفز لتكاثر الخلايا المثال وموت الخلايا المبرمج. وتنطوي هذه الآلية الهياكل الثانوية في مرنا 5'- المنطقة غير المترجمة (UTR) دعا IRES، ونهاية كربوكسي محطة من eIF4G1 المرتبطة eIF4A ومجمع 43S. الربط هذا 43S قبل الشروع جomplex إلى IRES يبدأ الترجمة سقف مستقلة دون الحاجة إلى eIF4E عامل 2،3.
وأخيرا، آلية ترجمة أخرى لا تزال غير مفهومة جيدا تدعم هذا النشاط ترجمة الحد الأقصى مستقل في ظل ظروف وشدد عبر CITE الهياكل التي تقع داخل مرنا UTR 4.
من خلال هذه الأنماط المختلفة للترجمة اختلاف خطوات البدء فيها، والترجمة تلعب دورا حاسما في توازن الخلايا وأي تغيير في واحدة من هذه العمليات وبذلك تؤثر على الكائن الحي مع الصغيرة لتأثيرات واسعة النطاق. في الواقع، والشروع خطوة معدل الحد الذي يحكم عمليات الترجمة الصحيحة من مرنا في البروتينات وبالتالي فهو هدفا للعديد من الضوابط ونقاط المادة 5. ما إذا كان لهذا الأخير أو لمكونات هذه العمليات، إذا كان أحد اتضح أن تكون معيبة، وسوف التشويش على التوازن القائم في الخلية، وبالتالي يمكن أن تؤدي إلى كوندي مرضيةستعقد. في هذا السياق، وقد شاركت طفرات في عوامل الترجمة في العديد من الاضطرابات بما في ذلك الاضطرابات العصبية مثل `اعتلال بيضاء الدماغ مع التلاشي matter' الأبيض (eIF2B1-5 فرعية) 6، في متلازمة والكوت-Rallison (ترميز الجين EIF2AK3 لرفع معنوياته) 7، وربما في مرض (eIF4G1 p.R1205H) باركنسون 8. ولذلك فمن المهم إجراء الدراسات الخلوية والجزيئية لهذه البروتينات متحولة إلى زيادة معرفتنا على تطور المرض وعلى العملية العامة لترجمة المبادرة.
لتنفيذ هذه الدراسات، فمن الضروري اختيار النماذج الأكثر ملائمة لمراقبة آثار هذه الطفرات القيطم المورق تتكيف البويضات بشكل خاص نظرا لخصائصها الفسيولوجية والبيوكيميائية: التزامن الفسيولوجية (سدت في المرحلة G2 من دورة الخلية) ، قدرة عالية من تخليق البروتين (200-400 نانوغرام / اليوم / البويضة)، وعدد كبير من شركة النفط العمانية المستخرجytes من نفس الحيوان (800-1،000 البويضات / أنثى) وحجم الخلية (1،2-1،4 مم في القطر) مما يسهل التلاعب بهم. Microinjection من البويضات القيطم مع تصنيعه مرنا يمكن بسهولة أن يؤديها لتشريح الخطوات الترجمة. في هذا الرأي أنه يقدم مزايا أخرى. ونظرا لسرعة الانقسام الاختزالي التقدم والترجمة مرنا بعد microinjection (~ 24 ساعة)، وتمثل القيطم البويضة نظام سريع مقارنة بأنظمة أعيد الخلوية (المستخرج من القولونية والجراثيم القمح أو الأرانب الخلايا الشبكية ...) التي مرنا هو ترجم بمعدل ترجمة خفض وبسرعة أقل. لذلك، فإن آثار الطفرة التي أدخلت في مرنا يكون سريعا ملاحظتها ودراستها بسهولة في العديد من البويضات. ميزة أخرى من البويضات القيطم هي أن من mRNAs الأمهات الكامنة ومنعت ترجمة البروتين قبل التحفيز البروجسترون. إضافة البروجسترون هو بالتالي وسيلة جيدة للتحكم في الحث الترجمة. ص حشويةolyadenylation لا تحدث أثناء oogenesis. وهي تبدأ خلال نضوج البويضة في البويضات حفز البروجسترون في النظام الزمني وتستمر طوال التنمية في وقت مبكر، ويمكن استخدامها لدراسة الخطوات المختلفة للترجمة.
وتذييل بعديد الأدينيلات من موس مرنا هو من بين أول من تحدث وأنه ينتمي مع أورورا A / EG2، هيستون، مثل B4 مرنا لفئة من الجينات "النضج المبكر" على النحو المحدد في تشارلزورث وآخرون (2004) 9. تحريض متعدية مرنا "المتأخرة" مثل السيكلين A1 و B1 السيكلين يحدث في وقت قريب من انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). موس مرنا يشفر كيناز سيرين / ثريونين البروتين. ترجمته أمر بالغ الأهمية لأنه يحرض على MAP كيناز شلال الذي ينشط بشكل غير مباشر على نضوج البويضة. في الواقع، في استجابة لهرمون البروجسترون، مما يعزز تذييل بعديد الأدينيلات من موس مرنا خلال عملية تنطوي أورورا A / EG2 البروتينات التنظيمية وغيرها من RNA ملزم البروتينات مع الالبريد 3'UTR من موس مرنا. هذا تذييل بعديد الأدينيلات زيادة موس مرنا يؤدي إلى زيادة مستوى البروتين موس، والذي بدوره ينشط MEK1. هذه العملية تتوسط تفعيل الخلية التي تنظمها إشارات كيناز 2 (ERK2) (الشكل 1). وهذا يمكن أن يشير إلى سلسلة ثم تؤدي إلى نضوج M-مرحلة تعزيز العوامل، مجمع شكلتها السيكلين B وCdc2 كيناز، والنتائج في نهاية المطاف في استئناف الانتصافي.
لذلك في القيطم المورق البويضات، يمكن بسهولة أن تستخدم دراسة مرنا الأمهات مثل موس لاختبار ترجمتها مع عدة نقاط النهاية من تذييل بعديد الأدينيلات بكفاءة لترجمة عدة موس يشير مكونات، بما في ذلك أيضا تحديد معدل GVBD. هذا النظام هو بالتالي مثيرة للاهتمام لتقييم النتائج الأولى للطفرات في عوامل ترجمة الشروع دون تدخل من كتب حديثا مرنا أو الكفاءة ترنسفكأيشن، المشاكل التي تحدث في كثير من الأحيان مع eukaryدراسات الخلايا أذني.
هنا، يتم إنشاء بروتوكول حيث يتم microinjected من mRNAs eIF4G1 متحولة في القيطم المورق البويضات ويتم اختبار الترجمة مرنا الأمهات. في وجود عيب في GVBD التقدم، موس مرنا تذييل بعديد الأدينيلات وهو أمر ضروري للتقدم من خلال دورة الخلية الانتصافي بويضة وللترجمة اللاحقة من mRNAs الدرجة المبكرة والمتأخرة يتم التأكد. ودرس الفسفرة أورورا A / EG2 وERK أيضا لتأكيد نتيجة لموس deregulation.Thus، البويضات القيطم تمثل وسيلة بسيطة لتحليل الخطوات المختلفة الترجمة مرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب القيطم في منشأة الحيوان من جامعة ليل 1 وفقا للقواعد من المبادئ التوجيهية مجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EEC) عن التجارب على الحيوانات المختبرية. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلية (لجنة D'Ethique أون التجريب أنيمل نور-با-دو-كاليه، CEEA 07/2010).
1. سيت المناولة
- تحضير محلول مخدر: حل 1 غرام من مسحوق سلفونات تريكين الميثان في 1 لتر من الماء المعقم.
- يغرق الإناث القيطم المورق إلى هذا الحل، وتغطي الدورق لتجنب هروب والانتظار حوالي 45 دقيقة للحيوان أن يكون مخدرا تماما (دون أي رد فعل لقرصة الساق).
- غسل الضفدع بالصابون وشطف مع ماء الصنبور ثم ضع الحيوان على ظهره لرقائق الألومنيوم نظيفة.
- المشبك الجلد من الجزء الجانبي من البطن وعلى مستوى المبيض مع ملقط.إجراء شق حوالي 1 سم مع مقص تنظيفها قبل الاستخدام مع الايثانول 70٪. تأكد من أن القسم هو عميقة بما فيه الكفاية والوصول إلى جدار البطن الأساسي للسماح استئصال أنسجة المبيض التي تم العثور على العديد من البويضات في مراحل مختلفة من التنمية.
- تشريح الفص المبيض، وغسل بها 4 مرات في طبق بيتري (50 ملم) مع ND96 المتوسطة (96 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 1.8 ملي CaCl 2، 5 ملي HEPES تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، على أن تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين / البنسلين، 225 ميكروغرام / مل الصوديوم البيروفات، 30 ميكروغرام / مل مثبط التربسين فول الصويا، 1 ميكرولتر / التتراسيكلين مل) لإزالة كل آثار الدم والحطام.
ملاحظة: التتراسيكلين يسمح للالحفظ الأمثل وانتعاشا جيدا بعد العلاج microinjection. - تخزينها في طبق بيتري مغطاة غارقة في المتوسط في 14 ° C، مما يتيح الحفاظ عليها لمدة أسبوع واحد.
- غرزة جدار البطن والجلد مع طبيب بيطري امتصاص رhread وإبرة خياطة (لن 3 أو 4 غرز يكون ضروريا).
- وضع الحيوان في كوب من دون ماء ورطوبة الجلد مع ماء الصنبور حتى الضفدع يتحرك مرة أخرى. تغطية الكأس لمنعه من الهرب.
- فصل بعناية الفص المبيض في المتوسط في مجموعات من 5-10 البويضات باستخدام 2 أزواج من ملقط تحت stereomicroscope مع التكبير 10 أضعاف. اختر البويضات في مرحلة السادس. أنها يمكن أن تكون معترف بها من قبل ط) شكل ولون مع البني القطب الحيواني المصطبغة والقطب الخضري الأصفر مفصولة حزام اضح الثاني) حجمها متفوقة على 1.2 مم وقطرها 10.
- احتضان البويضات المحدد في حل كولاجيناز (1 ملغ / مل كولاجيناز A من كلوستريديوم الحالة للنسج، وحلت في ND96 دون التتراسيكلين) في طبق بتري في إطار التحريض لطيف خلال 45 دقيقة لتسهيل defolliculation البويضة (كولاجيناز هضم البويضة / اتصالات الخلايا الجرابية). شطف البويضات 3 أو 4 مرات مع ND96 المتوسطة أبقت على 14° C.
ملاحظة: لا احتضان البويضات أقل أو أكثر من 45 دقيقة ويرجع ذلك إلى خطر تدمير البروتينات السطحية بويضة والتسبب في ضعف قدرتها على البقاء. العلاج كولاجيناز يمكن أن تحدث GVBD عفوية. - احتضان البويضات في المتوسط لمدة 3-4 ساعة. إزالة الخلايا الجرابية مع ملاقط غرامة تحت العدسة المكبرة مجهر والاحتفاظ بها في 19 ° C في ND96 المتوسطة.
2. إعداد مرنا التجميعي
- خطي 5 ميكروغرام من البلازميدات التالية الهضم الأنزيمي باستخدام PME I الانزيم.
ملاحظة: pcDNA6.2 / V5-DEST تحتوي على 1599 الأحماض الأمينية eIF4G1 كدنا] النوع البري (eIF4G1-WT؛ NM_198241)، pcDNA6.2 / V5-DEST تحتوي على eIF4G1 كدنا] السلبي السائد (eIF4G1-DN) مع طفرات c.2105T > G c.2106A> C، c.2120-> G، c.2122T> A، 2125T> - وc.2126T> G في منطقة تفاعل بين eIF4G1 وeIF4E في موقف 612-618 من المقابلة البروتين التشويش على التفاعل betweأون eIF4G1 وeIF4E 8، pcDNA6.2 / C-EmGFP تحتوي على الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفراس (GFP). إعداد 2 الخلطات لكل من 3 البلازميدات: الأول بما في ذلك PME I انزيم والثانية بدون إنزيم عن السيطرة. - ترسيب الحمض النووي البلازميد باستخدام إجراء الإيثانول الكلاسيكية و resuspend في 20 ميكرولتر من H حر نوكلياز-2 O.
- تحديد تركيزه باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يجب أن يكون تركيز متفوقة على 150 نانوغرام / ميكرولتر لكتابة كرنا.
- تشغيل 1 ميكرولتر من العينات وضوابطها مع 5 ميكرولتر من العازلة تحميل على 0.8٪ هلام الاغاروز للتحقق من الخطية البلازميد.
- استخدام عدة لنسخ في المختبر وتنقية كرنا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ومعلق في كرنا كتب في 20 ميكرولتر من H حر نوكلياز-2 O. ويمكن تخزين العينات في -80 ° C إذا لزم الأمر.
- إعداد المخزن المؤقت الهجرة اجتماعات الأطراف 10X تحتوي على 0.2 M اجتماعات الأطراف (7.0 درجة الحموضة)، 20 مM خلات الصوديوم و 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة). تعقيم الحل مع فلتر 0.45 ميكرون. الأسهم الحل محمية من الضوء في RT لتجنب الحل الأكسدة.
- تنظيف الخزان الكهربائي تباعا مع هيدروكسيد الصوديوم، حمض الهيدروكلوريك وتشطف جيدا بالماء المزدوج تصفيتها لO / N لتجنب ريبونوكلياز ومنع تدهور الحمض النووي الريبي.
- يلقي 1.5٪ agarose هلام يحتوي على اجتماعات الأطراف والفورمالديهايد. دافئ حتى كامل الاغاروز حل وندعه يبرد إلى 55 درجة مئوية. تحت غطاء الدخان، إضافة 0.1 حجم MOPS 10X، 6.6٪ من الفورمالديهايد و4 ميكروغرام من بروميد إيثيديوم (10 ملغ / مل). صب جل تحت غطاء الدخان والانتظار حوالي 1 ساعة للهلام لتتصلب.
ملاحظة: الفورمالديهايد وإيثيديوم بروميد سامة. - تحضير عينات للهجرة في أنبوب 0.2 مل مع 1 ميكرولتر من كرنا، 8.8٪ من الفورمالديهايد، 60٪ من الفورماميد و 0.1 حجم MOPS 10X. احتضان لمدة 3 دقائق عند 70 درجة مئوية، ووضع أنابيب على الجليد لمدة 10 دقيقة. الطرد المركزي عينات بضع ثوان في5000 ز س. إضافة 2 ميكرولتر من العازلة هلام التحميل.
ملاحظة: الفورماميد غير سامة. - تشغيل عينات لمدة 20 دقيقة في 90V. نقع جل في Nuclease خالية من H 2 OO / N ليزيل اللون هلام قبل تحليلها للتحقق من جودة كرنا.
- تحديد تركيز كرنا باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينها في -80 ° C.
3. Microinjection من تجميعي RNA والبويضات تحفيز نضوج
- إعداد التجهيزات اللازمة لالبويضات microinjection. استخدام مجتذب micropipette لسحب صغيرة الزجاج الشعرية. تحت stereomicroscope، قطع أقصى من شعري مع ملاقط لإنشاء نهاية حادة. ملء micropipette الشعرية مع الزيوت المعدنية باستخدام حقنة 1 مل مع ميليبور 0.45 ميكرومتر مرشح في أقصى المعاكس. تحميل micropipette على ماصة microinjection. اختر micropipette دقة معايرة من قبل الشركة المصنعة لإعطاء دقة جيدة عند استخدامها مع الزجاج الشعرية المناسب.
- أداء microinjection 1-2 ساعة بعد defolliculation، تأخير الضروري لاستعادة البويضة على البويضات الاحتفاظ بها في 14 ° C. أطباق بتري استخدام مع الجزء السفلي كشط مع ملقط لإنشاء سطح لاصق لالبويضات وملئها ND96 المتوسطة.
- ترتيب البويضات على طول ممر كشط في طبق بيتري السماح لحقن متتالية من البويضات مع micropipette الشعرية في زاوية من 45 درجة مئوية.
- حقن في المنطقة الاستوائية البويضة، تحت منطقة الحيوانية المصطبغة لنشر الأمثل للعينات في السيتوبلازم. إدراج فقط أنحف جزء من غيض الشعرية على ما يقرب من 150-200 ميكرون من العمق.
- ضخ 30 نانوغرام من كرنا الحصول على التوالي من البلازميدات مختلفة في حجم 60 NL في البويضة الأولى. بعد الحقن، والانتظار لمدة 5-10 ثانية قبل إزالة غيض الشعرية لتجنب هروب عينة (الشكل 2A).
ملاحظة: لا يتجاوز 120 NL. حقن ببطء كما يمكنك. ينصح التحكم مع الماء المقطر. - نقل يدويا طبق بيتري لحقن البويضة القادمة.
ملاحظة: تأكد من أن الطرف لا انسداد طريق توليد نبضة صغيرة من الحل حمام بعد 2-3 إبر دقيقة جدا. - نقل حقن البويضات في 24 بئرا لوحات ثقافة (10 البويضات / جيد) مليئة 3 مل من الطازجة المتوسطة ND96 وتركهم في 19 ° C.
- احتضان البويضات في ND96 مع البروجسترون (PG) (2 ميكروغرام / مل) لتحريك نضوج الانتصافي (GVBD) في 19 ° C، 15 ساعة أو 4 ساعات بعد Microinjection من cRNAs مذيل بعديد الأدينيلات الحصول على التوالي من pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 وpcDNA6 0.2 / C-EmGFP تستخدم كعنصر تحكم (الشكل 2A).
ملاحظة: شارك في حقن علامة فلوري مع كرنا هو أداة لطيفة للتأكد من أن كرنا تم حقن وبقيت في البويضة. أداء مثل هذه التجارب الأولية باستخدام كرنا في المصالح مع علامة GFP. - Microinject كما هو الحال في # 3.5 نسب مختلفة (1: 3؛ 2: 2؛ 3: 1) من مذيل بعديد الأدينيلات eIF4G1-WT وeIF4G1-DN cRNAs من أجل الشركة المصرية للاتصالاتالحادي تأثير ترجمة cRNAs eIF4G1-WT على النمط الظاهري متحولة (الشكل 2D).
4. جرمينال الحويصلة انهيار تحديد
- حساب عدد البويضات الناضجة بعد التحفيز PG بملاحظة وجود بقعة بيضاء في القطب الحيواني الأسود مع stereomicroscope. تكرار عد كل ساعة حتى الساعة الرابعة والعشرين (الشكل 2B، 2C).
5. ويسترن صمة عار (WB) تحليل
- تجانس مجموعة من 10 البويضات التي كتبها الظهر وحركات عليها مع طرف micropipette، في 4 درجات مئوية في 200 ميكرولتر في المنطقة العازلة التالية: 50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، 500 مم كلوريد الصوديوم، 0.05٪ SDS، 5 ملي MgCl 2، 1 ملغ / مل ألبومين المصل البقري، 10 ملغ / مل leupeptin، 10 ملغ / مل أبروتينين، 10 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا، و 10 ملغ / مل benzamidine، 1 ملم PMSF، 1 ملم فانادات الصوديوم.
- عينات الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 10000 x ج لإزالة الدهون (المرحلة العليا) والغشاء (المرحلة السفلى) وractions. جمع جزء حشوية، تخزين قسامة لتحديد تركيز البروتين واستكمال ما تبقى مع Laemmli أو عينة عازلة مكرر تريس (1: 1).
ملاحظة: المواد الهلامية مكرر تريس والعازلة تحميل لديها درجة الحموضة أكثر حيادا التي تحمي البروتينات من التحلل - حرارة 20 ميكروغرام من العينة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحميل كل عينة في آبار من هلام الأكريلاميد. وضع الجل في خزان مع العازلة المناسبة.
- إجراء الكهربائي لمدة 1 ساعة في 200 V.
- تحقيق WB في TBS درجة الحموضة 8.0 (تريس حمض الهيدروكلوريك 15 ملم، كلوريد الصوديوم 150 ملم، توين 0.1٪، التي تحتوي على 10٪ ألبومين المصل البقري) مع الماعز المضادة للأورورا A / EG2 (1: 3000، 2 ساعة) أو مع المضادة أرنب -Aurora A / EG2-P (1: 1000، O / N عند 4 درجة مئوية)، والماوس مكافحة ERK2 (1: 3000، 2 ساعة) والماعز (المضادة للERK2-P (Tyr204) 1: 3000، 2 ساعة )، الأرنب المضادة للموس (1: 5000، 4 ساعة)، الأرنب مكافحة GFP (1: 3000، 2 ساعة) antibodies.Use الأجسام المضادة الماوس مكافحة V5 (1: 10000، 2 ساعة) والأرنب مكافحة RSK (1 : 1000، 2 ساعة) (والضوابط التحميل).
- غسلغشاء 3 مرات لمدة 10 دقيقة في TBS-توين واحتضان 1 ساعة إما مع المضادة للماوس أو المضادة للأرنب أو مكافحة الماعز (الغلوبولين المناعي) الفجل المسمى البيروكسيداز الضد الثانوية في التخفيفات من 1: 5000، 1: 7500 و1 : 5000 على التوالي.
- أداء 3 يغسل من 10 دقيقة في TBS-توين وكشف المستضدات الأجسام المضادة المجمعات مع النظام المتقدم كشف ECL.
6. تذييل بعديد الأدينيلات الفحص
- عينة 5 البويضات في حالة في 1.5 مل. غسلها مع 1 مل من نوكلياز خالية PBS 1X (7.4 درجة الحموضة). وستبذل الخطوات التالية تحت غطاء الدخان.
- استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام إجراء العضوي الكلاسيكي (انظر تعليمات الشركة المصنعة).
- استعادة RNA بواسطة الطرد المركزي (10000 x ج) لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف RNA لمدة 10 دقيقة.
- Resuspend بيليه RNA في 30 ميكرولتر من H حر نوكلياز-2 O.
- يستغرق 15 ميكرولتر من العينات في أنبوب جديد وإضافة 85 ميكرولتر من H حر نوكلياز-2 O. تنظيفعينات حد ذاتها لتحسين جودتها على عمود السيليكا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل الحمض النووي الريبي باستخدام 30 ميكرولتر من H حر نوكلياز-2 O
- تشغيل 1 ميكرولتر من العينات مع 5 ميكرولتر من العازلة تحميل على 0.8٪ هلام الاغاروز للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.
- إعداد 2 خلطات ربط في حالة (أي eIF4G1-WT، eIF4G1-DN وH 2 O السيطرة) مع الكواشف التالية: 10 U من RNA يغاز، 0.1 حجم 10X العازلة، 1 ملي ATP، 10٪ من PEG8000 50٪ و 0.1 ميكروغرام من P1 التمهيدي (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 وجلب الحجم النهائي إلى 10 ميكرولتر مع H حر نوكلياز-2 O. إضافة في أول RNA خليط تم الحصول عليها من البويضات دون التحفيز PG وفي RNA الخليط الثاني تم الحصول عليها من PG تحفيز البويضات.
- احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ثم في 65 ° C لإبطال نشاط الانزيم.
- لناعصام كدنا] عكس النسخ (RT) عدة. تحضير خليط RT، في أنبوب: 0.1 حجم العازلة 10X RT، 0.1 ميكروغرام من التمهيدي P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10، 4 ملي dNTP الخليط، 50 U من الناسخ العكسي والكامل مع Nuclease خالية من H 2 O إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من رد فعل ربط الحصول عليها سابقا. أداء RT في ظل ظروف وصفها من قبل الشركة المصنعة.
- إعداد البلمرة المتسلسل (PCR) خليط، في أنبوب: 0.1 حجم العازلة 10X، 1.5 ملي MgCl 2، 133 ميكرومتر خليط dNTP، 0.2 ميكرومتر التمهيدي معين، 0.2 ميكرومتر التمهيدي P2، 0.025 U بوليميريز طق، 1 ميكرولتر من [كدنا والكامل مع nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. أداء PCR في ظل الظروف التالية: 50 ° C لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، [95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية] * 40 دورات، 72 ° C لمدة 10 دقيقة 9. الاشعال محددة هي كما يلي: موس، GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA هيستون مثل B4، AGTGACAAACTAGGCTGATATACT. السيكلين A1، CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG. السيكلين B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- إعداد agarose هلام 3٪. إضافة في كل المنتجات PCR 10 ميكرولتر من العازلة تحميل. تشغيل هلام مع 10 ميكرولتر من العينات في 110 V لهجرة المثلى. تحليل هلام بعد 10 و 20 دقيقة لمراقبة التغير في حجم يعكس طول بولي ذيل (A)، وبالتالي نضوج RNA الذي هو شرط أساسي لترجمتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النضج الحركي من البويضات القيطم وتحديد GVBD نسبة البويضة بعد 24 ساعة من التحفيز PG (أرقام 2B، 2C):
من أجل دراسة النتائج متعدية للطفرة eIF4G1-DN، وردا على PG في القيطم المورق البويضات microinjected مع كرنا eIF4G1-DN يتم مقارنة eIF4G1-WT وظروف التحكم الأخرى (H 2 O، GFP). ضوابط تتيح لتقييم حالات البويضة microinjection بغض النظر عن طبيعة كرنا حقن أو من eIF4G1 overexpression.
وmaturations الحركية من 10 البويضات التي تتسم الظروف تحكم microinjected (H 2 O وGFP) مشابهة لWT وعدد تمر GVBD هي قريبة جدا من بعضها البعض في 12 و 24 ساعة بعد التحفيز PG (الشكل 2B). بعد 24 ساعة، نضوج البويضات يصل 95.7٪ للWT، 97.1٪ للH 2 O و 97.5٪ للGFP (فاي جوري 2C). وهكذا، إبر دقيقة جدا مع H 2 O أو السيطرة cRNAs أو cRNAs eIF4G1 يكون لها أثر يذكر على إطلاق البويضة الانقسام المنصف. وعلى العكس من 8 ساعات بعد التحفيز PG، تأخر عدد من البويضات microinjected مع cRNAs eIF4G1-DN تمر GVBD مقارنة eIF4G1-WT cRNAs (الشكل 2B). والافراج عن الانقسام الاختزالي من eIF4G1-DN مقابل البويضات eIF4G1-WT يقلل بشكل كبير من 85.8٪ و 77.4٪ في 12 ساعة و 24 ساعة بعد PG التحفيز على التوالي (الشكل 2C). ومن الجدير بالذكر أيضا أن 13 ساعة بعد التحفيز PG، وعدد من البويضات الناضجة يصل كحد أقصى لجميع الظروف باستثناء eIF4G1-DN التي يتم تحقيق الحد الأقصى 20 ساعة فقط بعد التحفيز PG. وبالتالي، فإن وجود eIF4G1-DN طفرة يؤدي إلى الأكثر فقرا إطلاق البويضة الانقسام المنصف مقارنة eIF4G1-WT.
استعادة نضوج البويضة في وجود eIF4G1-DN بفضل eIF4G1-WT (الشكل 2D):
_content "> لتحديد ما إذا كان يعوق eIF4G1-DN كرنا microinjection أو كتل نضوج البويضة، ونسب مختلفة من eIF4G1-WT وeIF4G1-DN cRNAs وشارك microinjected. وفي ظل هذه الظروف، لوحظ حدوث زيادة نضوج البويضة وذلك لأن مستويات eIF4G1-WT كرنا رفع وتلك من eIF4G1-DN كرنا decrease.While النضج لوحظ في 17.5٪ من البويضات مع جرعة واحدة من cRNAs eIF4G1-DN، هذه النسبة تصل إلى 76.7٪ مع زملاء Microinjection من 3 جرعات من eIF4G1-WT cRNAs و وجود جرعة واحدة من eIF4G1-WT cRNAs يؤدي إلى 95٪ من نضوج البويضة. وتظهر هذه التجربة أن العيب نضوج البويضات القيطم microinjected مع eIF4G1-DN ليست لا رجعة فيه ويمكن استعادة جزئيا.موس التعبير يشير إلى البروتينات لوحظ على WB كمؤشر على قدرة الترجمة قبل وبعد PG التحفيز (الشكل 2E):
مستوى البروتين من V5 العلامة في البويضات معربا عن eIF4G1-WT وeIF4G1-DN متشابهة يعكس كفاءة microinjection مماثلة. مستوى بروتين RSK تستخدم السيطرة البروتين التحميل هو أيضا مشابهة في جميع الأحوال قبل وبعد التحفيز PG. التعبير عن البروتين GFP موجود أيضا في البويضات microinjected مع GFP كرنا حفز أم لا مع PG. وتشير هذه البيانات إلى أن microinjection وoverexpression من eF4G1 لا التشويش ترجمة GFP. ومع ذلك، لا تعبير البروتين GFP هو كشفها قبل وبعد التحفيز PG في البويضات معربا عن eIF4G1-DN. كما هو متوقع، والتعبير لم الذاتية موس هو كشف في غياب التحفيز PG. بالإضافة إلى ذلك، موس لوحظ التعبير في eIF4G1-WT وH 2 O الظروف السيطرة بعد التحفيز PG في اتفاق مع النتائج السابقة تبين أن overexpression من eIF4G1-WT له عواقب قليلا على موس الذاتية 16. على العكس، انخفاضا كبيرا من موس التعبير ملحوظ بعد التحفيز PG.
للمحترفينيتم اختبار أيضا البروتين التعبير عن بعض مكونات موس يشير التعاقبي. على سبيل المثال، أورورا A / EG2 البروتين يتصرف المنبع إلى MOS الاستقراء وليس الكشف عن رفع القيود البروتين أو من شكل فسفرته لها الناجم عن بعد لوحظ التحفيز PG. وفي المقابل، لوحظ تحرير ERK2 الفسفرة الناجمة عن موس في وجود eIF4G1-DN.
وأشارت هذه النتائج إلى أن التعبير الذاتية لموس RNA إلى البروتين وموس تفعيل ERK2 تعتمد تتأثر التعبير عن eIF4G1-DN.
مرنا تذييل بعديد الأدينيلات (الشكل 2F):
تذييل بعديد الأدينيلات عدة من mRNAs (موس، السيكلين A1، B1 السيكلين ومثل هيستون B4) اللازمة لالقيطم البويضات تم اختبار الانتعاش الانقسام الاختزالي. فحص أداء يمكن أن تحدد ما إذا كانت الزيادة في حجم amplimer المقابلة لطول بولي (A) ذيل مرنا موجودة بعد التحفيز PG. في الواقع، مع Pالتحفيز G لوحظ إضافة بولي (A) الذيل في جميع الظروف بما في ذلك طفرة eIF4G1-DN.
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لتفعيل شلال MAPK وعند التحفيز الهرموني بالتغيرات السريعة PG في أنشطة عدة إنزيمات تحدث بما فيها أورورا A / EG2 ومسار CPEB. Hyperphosphorylation أورورا A / EG2 يؤدي إلى CPEB (حشوية تذييل بعديد الأدينيلات العنصر ملزم بروتين) الفسفرة. CPEB فسفرته تعترف CPE (تذييل بعديد الأدينيلات حشوية العنصر) على 3'UTR من موس مرنا، توظف CPSF (الشق وتذييل بعديد الأدينيلات خصوصية عامل) وينشط مرنا تذييل بعديد الأدينيلات التي كتبها PAP (بولي (A) البلمرة). يعزز التحفيز PG أيضا تباعا ماسكين الفسفرة سواء عن طريق عمل PKA وcdk1، ماسكين / eIF4E التفكك وتكوين الجمعيات eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 المجندين عبرlation شركاء بدء بما في ذلك PABP التي تتفاعل مع eIF4G1 وتسلم بولي (A) الذيل. مرة واحدة توليفها، موس ينشط مجاهدي خلق / MAPKK من قبل الفسفرة، التي في المنعطفات، ينشط ERK2 / MAPK من قبل الفسفرة. ويشارك هذا ما يسمى شلال MAPK في عمليات الانتصافي عن طريق التحكم الحركي دخول M-المرحلة، التشكل المغزل وتثبيط تخليق DNA. تم تضمين شلال في الإيجابية حلقة التغذية المرتدة التي تحافظ على تخليق البروتين. على المرء أن يلاحظ أن MOS ليس البروتين الوحيد المطلوب ليتم توليفها لتفعيل GVBD، أي مطلوبة السيكلين B لترجمتها لتحقيق النضج.
يؤثر الشكل 2. eIF4G1-DN متحولة نضوج البويضة والترجمة في القيطم المورق. RNA المستمدة من البلازميدات ترميز الموسومة V5 البروتينات eIF4G1 (WT وDN) هيmicroinjected في القيطم المورق البويضات. بعد 15 ساعة، يتم تحفيز نضوج البويضات بواسطة هرمون البروجسترون (PG) (وقد أجريت تجارب على الأقل 3 مرات ويتم عرض نتائج ممثل). (A) Schematicoverview من بروتوكول التجريب. يتم تمثيل حقن eIF4G1 و / أو GFP cRNAs التي كتبها السهم رؤساء قبل التحفيز PG. وقد تم الحصول على عينات لRNA والبروتينات التحليلات في 2 نقطة زمنية (التحفيز PG وفي نهاية الحركية GVBD). يتم اختبار (B) نضوج الحركية من 10 البويضات التي تتميز GVBD خلال 24 ساعة بعد التحفيز PG. لوحظ تأخير في نضوج البويضة في البويضات microinjected مع eIF4G1-DN cRNAs مقارنة مع أولئك microinjected مع eIF4G1-WT cRNAs (C) نسبة البويضات الناضجة 24 ساعة بعد PG التحفيز (ن = 4؛ * P <0.05). لوحظ انخفاض في نضوج البويضة في تلك microinjected مع eIF4G1-DN cRNAs مقارنة eIF4G1-WT cRNAs. (D) Reversioن تقييم النمط الظاهري من البويضات microinjected مع eIF4G1-DN cRNAs متحولة وcRNAs eIF4G1-WT تبين أن الآلية الترجمة لا تزال تعمل عند إضافة eIF4G1-WT إلى متحولة. يتم استخراج (E) والبروتينات من البويضات ومستوياتها يحدده immunoblotting تحليل . اضطرابات الفسفرة ERK2، موس وGFP التعبير في لوحظ الظروف eIF4G1-DN. (F) تذييل بعديد الأدينيلات من موس، السيكلين A1، السيكلين من mRNAs B4 B1 و مثل هيستون من البويضات تحفيز أم لا مع PG وحظ بعد PCR التضخيم والهجرة على 3٪ agarose هلام. بعد التحفيز PG، تم الكشف عن زيادة في حجم> 100 تذييل بعديد الأدينيلات لجميع الظروف. المسار الأول يناظر سلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الترجمة هي آلية المشاركة في الفيزيوباثيا العديد من الاضطرابات الإنسان بما في ذلك العديد من الأمراض العصبية. على سبيل المثال في مرض باركنسون اقترحت عدة تقارير ضعف في الترجمة المرتبطة بطفرات وراثية 8،12،13.
تتوفر لدراسة ترجمة العديد من النماذج الخلوية. هنا، من أجل دراسة النتائج متعدية من طفرة في eIF4G1 الذي يعمل طفرة السلبية السائدة عن الحد من التفاعل بين eIF4G1 وeIF4E شركاء 8، والقيطم المورق يستخدم البويضة. هذا نموذج لديها مزايا البساطة منذ وتتكون من خلية واحدة فقط عملاقة واحدة تيسير Microinjection من مرنا الاصطناعية، مما يؤدي إلى كمية كبيرة من المواد الكيميائية الحيوية للتجارب وتسهيل الملاحظات العيانية للمراحل المختلفة من نضوج البويضة. هذه العملية هي أيضا فعالة وقت بالمقارنة مع خلية مستقرةالجيل الخط. وعلاوة على ذلك، تم بالفعل وصف عدة بروتوكولات إعداد بويضة وRNA إبر دقيقة جدا بشكل خاص لدراسة دورة الخلية أو النقل نووي هيولي 14،15. وفيما يتعلق حدود هذه البروتوكولات لدراسة الترجمة، ينبغي أن تؤخذ اهتماما خاصا فيما يتعلق تركيز مرنا. لا ينبغي أن يكون هذا التركيز إلى الأعلى (لا يزيد عن 30 نانوغرام في 120 كحد أقصى NL) لكي لا تشبع عملية الترجمة. مع الأخذ بعين الاعتبار هذا العنصر، القيطم البويضة هي نموذجا جذابا لدراسة الترجمة البروتين كما يشهد به البيانات الواردة في الشكل 2 مع نموذج متحولة من EIF4G1 النص.
في الواقع، في وجود eIF4G1 تحور، لوحظ انخفاض في ترجمة البروتين موس ويرتبط بانخفاض قدره 90٪ من GVBD مقارنة WT والسيطرة على الأوضاع. على العكس، لم overexpression من eIF4G1-WT لا يؤدي إلى تعديل في المستوى سترجمة و موس بالاتفاق مع 16،17 البيانات الأدب.
العديد من التعديلات البيولوجية قد يفسر هذه النتائج. مع العلم أن موس مرنا من أصل الأمهات وكتب بالفعل قبل تفعيل الانقسام الاختزالي التي كتبها PG، ينبغي للآليات إرتباك يحدث بين النسخ والترجمة الخطوات. الجدير بالذكر، ترجمة موس هو نتيجة لسلسلة من الأحداث الجزيئية التي تبدأ من مرنا كامنة دون بولي (A) الذيل لإضافة الذيل بعد التحفيز PG إلى ترجمته 18،19. وهكذا، عدة سيناريوهات محتملة بما في ذلك: قد يشتبه العيوب في الترجمة بدء هو سبب هذا الفشل، أو عيوب الفسفرة من عامل يؤدي الى MOS مرنا تذييل بعديد الأدينيلات، أو تقصير من مرنا تذييل بعديد الأدينيلات من النصوص موس في حد ذاته يمكن أن تؤدي إلى انخفاض متعدية.
لتقييم هذه الآليات الأخيرة (2)، يتم فحص التعبير عن هذه العوامل من قبل البنك الدولي. التعبيرأظهرت مستويات أيون من مفسفر أورورا A / EG2، المسؤولة عن CPEB الفسفرة أي اضطراب في وجود eIF4G1 تحور. في نفس السياق، لوحظ موس مرنا تذييل بعديد الأدينيلات أو غيرها من تذييل بعديد الأدينيلات مرنا في وجود eIF4G1 تحور بعد PG التحفيز (الشكل 2F). لمزيد من تأكيد ملف تذييل بعديد الأدينيلات أن التجارب وصمة عار الشمالية أن يوصى بها وكذلك أداء السكروز العزلة التدرج من polysomes من أجل تحديد ما إذا كان يمكن أن يحدث تجنيد مرنا إلى الريبوسوم 16.
لذلك، من خلال دراسة العناصر الأولى والأخيرة من سلسلة، وكان يشتبه في المرحلة إرتباك أن يكون المصب من وقوع تذييل بعديد الأدينيلات. ومن المهم أيضا لاختبار ما إذا كان عيب موس التعبير أعطى الأثر المتوقع على الفسفرة ERK2. في وجود طفرة، أدى انخفاض موس التعبير إلى انخفاض مستوى ERK2 مفسفر وبالتالي إلى خلل فيتطور GVBD (الشكل 1 و 2E). وهكذا، ويرتبط الطفرة eIF4G1 إلى الانخفاض المتوقع الترجمة موس. حذف المجال ملزم eIF4E في تسلسل eIF4G1 في eiF4G1-DN هو على الأرجح المسؤول عن انخفاض في التفاعلات eIF4G1 / eIF4E كما اقترح سابقا من قبل الباحث المشارك في الدراسة مناعي 8 قد التشويش على تشكيل eIF4F معقدة.
هذا البروتوكول لديه العديد من التطبيقات المثيرة للاهتمام في علم الأحياء الخلوي. هذا الإعداد هو الأمثل حيث أن التحقيقات الأولية لعدد من الأسئلة الأساسية في علم الأحياء الخلوي مثل: لفهم أفضل لدور مجالات محددة من العوامل بدء وتحديد تلك التي تعتبر ضرورية لفي الجسم الحي الترجمة أو نضوج البويضة. في هذا السياق، Wakiyama وآخرون. (2000) أظهرت أهمية في نضوج البويضة في المنطقة الأميني من محطة eIF4G1 التي تحتوي على مجالات ملزمة لeIF4E وPABP 17؛ لدراسة splicجي الشروع عوامل 20؛ فك الآليات التي تستخدمها الفيروسات اختطاف آليات الترجمة المضيفة لأغراضها عبر eIF4G1 الانقسام على سبيل المثال مع تثبيط هياكل سقف تعتمد الترجمة وIRES مرنا، وترجم في الحد الأقصى مستقل الطريقة 21؛ لدراسة دور طفرة في العوامل الترجمة على دورة الخلية منذ البويضات هي النماذج التي اختارها لهذه الدراسة 22؛ لدراسة الآليات الرئيسية التي تحكم الشروع في ترجمة أي والحد الأقصى المستقلة التي تعتمد على الغطاء لتحديد ما إذا كانت تشارك مؤسسة واحدة أو عدة أنظمة في اضطراب تخليق البروتين. يمكن بسهولة تطبيق العديد من الاختلافات من البروتوكول الحالي للوصول إلى هذه الأهداف، بما في ذلك تحديد كفاءة الترجمة قبل غروب الشمس method23 أو مراسل مرنا microinjection. على سبيل المثال، استخدام مراسل مرنا bicistronic تحتوي على سيسترون؛ مفرون الأولى التي Renilla luciferase المراسل سوف يعتمد الحد الأقصى للترجمةفي حين سيتم ترجمة سيسترون؛ مفرون الثاني يحتوي على اليراع luciferase المراسل عبر IRES الهياكل ينبغي أن تمكن لتحديد طريقة البدء في طرح العيوب غرامة و / أو تعويضات للحفاظ على التوازن الترجمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مثل هذه التجارب luciferase المراسل الصحفي RNA توفر ميزة لعدم الاعتماد على تعطيل محتمل آليات تنموية متخصصة المقرر أن آليات الحفظ غير مكتملة مع الإنسان.
بالتوازي مع هذه الأسئلة الأساسية، مثل بروتوكول يمكن تطبيقها كخطوة أولى لمعالجة الأوضاع الضارة التي يمكن أن تسهم في الاضطرابات العصبية. في الظروف الفسيولوجية، الخطوات ترجمة المبادرة هي أهداف مميزة لوائح في ظل ظروف وشدد مثل الأكسدة، نقص الأكسجين، والتغير في درجة الحرارة، التشعيع والحرمان من المغذيات. في مثل هذه الظروف، ترجمة مختارة من النصوص ترميز البروتينات التي لا غنى عنها ضد الضغوط ويحدث بقاء الخلية.عندما تطغى هذه العملية، تؤكد تصبح مرضية والمشاركة بنشاط في تطوير العديد من المحبة العصبية. وتشارك الضغوطات الخلوية في العديد من الأمراض العصبية مثل الزهايمر وأمراض باركنسون والتصلب الوحشي الضموري أو مرض بريون (كروتزفيلد جاكوب) 24 وهذه الضغوط تحفز تفعيل الاستجابة البروتين تكشفت (UPR). واحدة من هذه الآليات الاستعراض الدوري الشامل يؤدي إلى ترجمة انخفضت خلال تفعيل ورفع معنوياته والفسفرة من eIF2α الوحيدات مع عواقب وقف الترجمة عن طريق منع ملزم بين eIF4F و43S المجمعات 25. في البويضات القيطم، إضافة للعوامل الأكسدة و / أو الجينات الطافرة المعروف أن تترافق لهذه الأمراض أن تحاكي هذه الضغوط وتحديد ما إذا كانت الجينات الطافرة يمكن أن تؤثر على عمليات الترجمة. في مرض باركنسون على سبيل المثال، وإدخال eIF4G1 p.R1205H في Xenopلنا البويضة المرتبطة أو عدم الأكسدة الإجهاد أو تحليل الجينوم على نطاق مرنا لمحات polysomal يمكن أن تعالج مسألة إشراك الترجمة في الفيزيوباثيا 26.
كل هذه التطبيقات المطبقة على البويضة وبالتالي تمثل حقل كبير من الاحتمالات لدراسة الاضطرابات الترجمة التي تعرف الآن أن تكون مرتبطة إلى عدة المحبة بما في ذلك اضطرابات الاعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
