Abstract
Proteinsyntese er en grundlæggende proces for at genekspression påvirker forskellige biologiske processer, navnlig tilpasning til miljøforholdene. Trin indledningen, der involverer samling af ribosomale subunits på mRNA startcodon involveret initieringsfaktor herunder eIF4G1. Fejl i denne hastighedsbegrænsende trin oversættelse er knyttet til forskellige lidelser. At undersøge de mulige konsekvenser af sådanne deregulering, Xenopus laevis oocytter udgør en attraktiv model med en høj grad af beskyttelse af væsentlige cellulære og molekylære mekanismer med human. Hertil kommer, at i løbet af meiotisk modning, oocytter er transkriptionelt undertrykt og alle nødvendige proteiner oversat fra allerede eksisterende, maternelle mRNA. Denne billige model giver eksogen mRNA til at blive helt integreret med en effektiv oversættelse. Her beskrives en protokol til vurdering af oversættelse med en faktor af interesse (her eIF4G1) ved hjælp af Stored maternal mRNA, er de første til at blive polyadenyleret og oversat under oocytmodning et fysiologisk udlæsning. Ved første mRNA syntetiseres ved in vitro transkription af plasmider af interesse (her eIF4G1) injiceres i oocyter og kinetik oocytmodning af Germinal vesikelnedbrydning detektion bestemmes. Den undersøgte maternelle mRNA mål er serin / threonin-protein-kinase MOS. Dens polyadenylering og dens efterfølgende translation undersøges sammen med ekspressionen og phosphorylering af proteiner af MOS signaleringskaskade involveret i oocytmodning. Variationer af den nuværende protokol til at fremsætte translationelle defekter er også foreslået at understrege sin generelle anvendelighed. I lyset af ny dokumentation, at afvigende proteinsyntese kan være involveret i patogenesen af neurologiske lidelser, giver en sådan model mulighed for nemt at vurdere denne svækkelse og identificere nye mål.
Introduction
Proteiner er væsentlige elementer i cellulære liv og dermed på større skala af organismen. De sikrer størstedelen af cellulære funktioner, herunder struktur, transport, reaktion katalyse, regulering, genekspression osv Deres udtryk er resultatet af en kompleks mekanisme for oversættelse muliggør konvertering af et mRNA til protein. Oversættelsen er udsat for forskellige kontroller for at tilpasse og regulere genekspression i henhold til de celle behov, under udvikling og differentiering, aldring, fysiologiske belastninger eller patologiske manifestationer.
Oversættelse er opdelt i 3 faser (initiering, forlængelse og ophør) og gaver 3 indvielse oversættelse med henblik på at reagere på disse behov: cap-afhængige, cap-uafhængig via internt ribosom indtastning Segment (IRES) strukturer og cap-Uafhængig Translation Enhancers ( CITE).
De fleste eukaryote mRNA oversættes i en hætte-Dependent måde via 7-methylguanosin 5'-triphosphat hætte, der fungerer som en anerkendelse funktion under proteinsyntese. Denne hætte binder sig til eIF4E, en komponent af eIF4F kompleks med eIF4G1 og eIF4A. Forbundet med andre partnere som poly (A) protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met Disse oversættelse initieringsfaktorer muligt at cirkularisere mRNA og forbedre dens tilgængelighed for formularer 43S kompleks indtil august initieringskodonet anerkendelse 1. Denne begivenhed svarer til slutningen af translationsinitiering dvs. det første trin i oversættelse.
Cap-uafhængig translation anvendes af mRNA, der koder for essentielle proteiner i stresssituationer, der inducerer for eksempel celleproliferation og apoptose. Denne mekanisme involverer sekundære strukturer i 5'-mRNA utranslaterede region (UTR) kaldes IRES, den carboxyterminale ende af eIF4G1 forbundet med eIF4A og 43S kompleks. Bindingen af denne 43S pre-initiering Complex til IRES indleder hætten uafhængig oversættelse uden behov for eIF4E faktor 2,3.
Endelig er en anden oversættelse mekanisme stadig ikke godt forstået understøtter denne cap-uafhængige oversættelse aktivitet under stressede forhold via CITE strukturer placeret inden mRNA UTR 4.
Gennem disse forskellige former for oversættelse adskiller deres indledning trin, oversættelse spiller en kritisk rolle i cellulær homeostase og enhver ændring i en af disse processer vil således påvirke organismen med små til store effekter skala. Faktisk indledningen er en hastighedsbegrænsende trin regulerer den korrekte oversættelse processer mRNA til proteiner og er dermed målet for mange kontroller og regulering punkt 5. Uanset om det er for sidstnævnte eller komponenter i disse processer, hvis man viser sig at være defekt, vil det forstyrre den etablerede balance i cellen og dermed kunne føre til patologiske Conditioner. I denne sammenhæng har mutationer i oversættelse faktorer været involveret i flere lidelser, herunder neurodegenerative lidelser såsom `leukoencefalopati med forsvindende hvid matter' (eIF2B1-5 underenhed) 6, i Walcott-Rallison syndrom (EIF2AK3 gen, der koder for PERK) 7, eventuelt i Parkinsons sygdom (eIF4G1 p.R1205H) 8. Det er derfor vigtigt at gennemføre cellulære og molekylære studier af disse mutantproteiner at øge vores viden om udvikling sygdom og på den generelle proces med oversættelse indvielse.
For at udføre disse undersøgelser, er det vigtigt at vælge de mest hensigtsmæssige modeller til at observere konsekvenserne af disse mutationer Xenopus laevis oocytter er særligt godt tilpasset på grund af deres fysiologiske og biokemiske egenskaber:. Fysiologiske synkronicitet (blokeret i fase G2 af cellecyklus) , høj kapacitet af proteinsyntese (200-400 ng / dag / oocyt), højt antal ekstraheret OOCytes fra en samme dyr (800-1.000 oocytter / kvinde) og cellestørrelse (1,2-1,4 mm i diameter), som letter deres manipulation. Mikroinjektion af Xenopus-oocytter med syntetiseret mRNA kan let udføres for at dissekere oversættelse trin. I denne opfattelse det præsenterer andre fordele. I betragtning af den hastighed meiosen progression og translation efter mRNA mikroinjektion (~ 24 timer), Xenopus-oocyt repræsenterer et hurtigt system sammenlignet med rekonstituerede cellulære systemer (udvundet fra E. coli, hvedekim eller reticulocyt ... kanin), hvor et mRNA er oversat med en reduceret oversættelse sats og ved en lavere hastighed. Så vil virkningerne af en mutation indføres i et mRNA hurtigt og nemt observeres undersøgt i adskillige oocytter. En anden fordel ved Xenopus-oocytter er, at moderen mRNA'er er latent og protein translation blokeres før progesteron stimulation. Tilsætning af progesteron er således et godt middel til at kontrollere oversættelsen induktion. Cytoplasmatisk polyadenylation ikke forekomme under oogenese. Det begynder i oocytmodning i progesteron-stimulerede oocytter i en tidsmæssig rækkefølge og fortsætter hele tidlige udvikling og kan anvendes til at undersøge de forskellige trin i oversættelse.
Den polyadenylering af mRNA MOS er blandt de første til at forekomme, og det hører med Aurora A / EG2, histon-lignende B4 mRNA til klassen af "tidlig kønsmodenhed" gener som defineret i Charlesworth et al. (2004) 9. Den translationelle induktion af "sene" mRNA såsom cyclin A1 og cyclin B1 sker omkring tidspunktet for kimblære fordeling (GVBD). Mos mRNA koder for en serin / threonin-proteinkinase. Oversættelsen er afgørende, da det inducerer MAP kinase kaskade, der indirekte aktiverer oocytmodning. Faktisk som reaktion på progesteron, er polyadenylering af mRNA MOS forstærket via en proces, der involverer Aurora A / EG2 regulatoriske proteiner og andre RNA-bindende proteiner med the 3'UTR af mos mRNA. Denne øgede polyadenylering af mRNA MOS fører til en stigning af MOS proteinniveau, som igen aktiverer MEK1. Denne proces medierer aktivering af ekstracellulære signaler-kinase 2 (ERK2) (figur 1). Dette signaleringskaskade kan så udløse modningen M-fase fremmende faktorer, et kompleks dannet af cyclin B og Cdc2-kinase, og i sidste ende resulterer i meiotisk genoptagelse.
Derfor vil der i Xenopus laevis oocytter, kunne studiet af maternelle mRNA såsom MOS sagtens bruges til at teste deres oversættelighed med flere endepunkter fra deres effektive polyadenylering til oversættelse af flere MOS signalanlæg komponenter, herunder også fastlæggelsen af GVBD sats. Dette system er derfor interessant at evaluere de første konsekvenser af mutationer i translationsinitieringsregioner faktorer uden indblanding af nyligt transkriberet mRNA eller transfektionseffektivitet problemer, som ofte forekommer med eukaryøre- celle undersøgelser.
Her er en protokol, etableres, hvor mutant eIF4G1 mRNA'er mikroinjiceres i Xenopus laevis oocyter og oversættelse af maternelle mRNA testes. I nærvær af en defekt i GVBD progression, mos mRNA polyadenylering som er afgørende for progression gennem oocyt meiotiske cellecyklus og for den efterfølgende translation af tidlige og sene mRNA'er klasse konstateres. Phosphoryleringen Aurora A / EG2 og ERK også undersøgt for at bekræfte følge af MOS deregulation.Thus, repræsenterer Xenopus-oocytter en enkel måde at analysere forskellige trin i mRNA-translation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Xenopus forsøg blev udført på dyret facilitet i Lille 1 Universitet i henhold til reglerne i retningslinjerne Europæiske Fællesskab Råd (86/609 / EØF) til laboratorie dyreforsøg. Dyret Protokollen blev godkendt af den lokale Institutional Review Board (Comité d'Ethique da Eksperimenter Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Oocyte Håndtering
- Forbered bedøvende opløsning: Opløs 1 g tricainmethansulfonat pulver i en 1 l sterilt vand.
- Springet kvindelige Xenopus laevis i denne opløsning, tildækkes for at undgå udslip og vente ca. 45 minutter for dyret at være fuldstændig bedøvet (uden reaktion på et ben knivspids).
- Vask frøen med sæbe og skyl med vand fra hanen derefter placere dyret på ryggen på ren aluminiumsfolie.
- Klemme huden af den laterale del af maven og på æggestokkene plan med en pincet.Lave et snit på ca. 1 cm med en saks rengøres før brug med ethanol 70%. Sørg for, at sektionen er dyb nok, og til at nå det underliggende bugvæggen for at tillade fjernelse af ovarievæv, hvor flere oocytter i forskellige stadier af udvikling er fundet.
- Dissekere ovarie lapper, vaske dem 4 gange i en petriskål (50 mm) med ND96 medium (96 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES indstillet til pH 7,4 med NaOH, suppleret med 50 ug / ml streptomycin / penicillin, 225 ug / ml natriumpyruvat, 30 ug / ml sojabønne trypsin inhibitor, 1 ul / ml tetracyclin) for at fjerne alle spor af blod og snavs.
Bemærk: Tetracyklin giver en optimal bevaring og en god bedring efter mikroinjektion behandling. - Opbevar dem i en overdækket petriskål neddykket i mediet ved 14 ° C, så deres bevaring i en uge.
- Sy bugvæggen og huden med dyrlæge absorberbar thread og en suturnål (3 eller 4 masker vil være nødvendigt).
- Dyret i et bæger uden vand og fugtigere huden med postevand indtil frøen bevæger igen. Bægerglasset dækkes for at forhindre flugt.
- Adskil forsigtigt ovarieceller lapper i mediet i grupper på 5 til 10 oocytter ved anvendelse af 2 par pincet under et stereomikroskop med en 10-fold forstørrelse. Vælg oocytter på trin VI. De kan genkendes ved i) deres form og farve med en brun pigmenteret dyr stang og gule vegetative pol adskilt af et klart bånd ii) deres størrelse overlegen i forhold til 1,2 mm i diameter 10.
- Inkuber de udvalgte oocytter i en collagenase-opløsning (1 mg / ml collagenase A fra Clostridium histolyticum, opløst i ND96 uden tetracyclin) i en petriskål under forsigtig omrøring under 45 min for at lette oocyt defolliculation (collagenase fordøjer oocyt / follikelcellehyperplasi forbindelser). Skyl oocytter 3 eller 4 gange med ND96 medium holdt ved 14° C.
Bemærk: Du må ikke inkuberes oocytterne mindre eller mere end 45 min på grund af risikoen for at ødelægge oocyt overfladeproteiner og forårsage dårlig levedygtighed. Collagenasebehandling kan inducere spontan GVBD. - Inkubér oocytter i mediet i 3-4 timer. Fjern follikulære celler med fine pincet under binokulære forstørrelsesglas og holde dem ved 19 ° C i ND96 medium.
2. Fremstilling af mRNA-syntese
- Linearisere 5 ug af følgende plasmider ved enzymatisk nedbrydning ved anvendelse af Pmel enzym.
BEMÆRK: pcDNA6.2 / V5-DEST indeholdende et 1599 aminosyrer eIF4G1 cDNA vildtype (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST indeholdende en eIF4G1 dominant negativ cDNA (eIF4G1-DN) med mutationer c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - og c.2126T> G i regionen samspillet mellem eIF4G1 og eIF4E i position 612-618 af det tilsvarende protein forstyrre interaktion between eIF4G1 og eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP indeholdende chloramphenicolacetyltransferase (GFP). Forbered 2 blandinger for hver af de 3 plasmider: den første herunder Pmel enzym og den anden uden enzym som kontrol. - Udfældning af plasmid-DNA ved hjælp af en klassisk ethanol procedure og resuspender den i 20 pi Nuclease-free H 2 O.
- Bestem koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer. Koncentrationen skal være bedre end 150 ng / ul at transskribere cRNA.
- Kør 1 pi prøver og deres kontrol med 5 pi loading buffer på en 0,8% agarosegel for at verificere plasmid linearisering.
- Brug et kit til in vitro-transkription og cRNA oprensning i overensstemmelse med producentens anvisninger. De transskriberede cRNA resuspenderes i 20 pi Nuclease-free H 2 O. Prøver kan opbevares ved -80 ° C, hvis det er nødvendigt.
- Forbered MOPS 10X migration buffer indeholdende 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM natriumacetat og 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilisere opløsningen med et 0,45 um filter. Stock løsningen beskyttet mod lys ved RT for at undgå løsning oxidation.
- Rengør elektroforesetanken successivt med NaOH, HCI og skyllet grundigt med dobbelt-filtreret vand til en O / N at undgå RNase og forhindre RNA-nedbrydning.
- Kastet en 1,5% agarose gel indeholdende MOPS og formaldehyd. Varm indtil fuldstændig agarose opløsning og lad det køle ned til 55 ° C. Under stinkskab tilsættes 0,1 volumen MOPS 10X, 6,6% formaldehyd og 4 ug ethidiumbromid (10 mg / ml). Hæld gelen under stinkskabet og vente ca. 1 time for gelen at hærde.
Bemærk: Formaldehyd og Ethidiumbromid er giftige. - Fremstille prøver til migration på en 0,2 ml rør med 1 ml af cRNA, 8,8% formaldehyd, 60% formamid og 0,1 volumen MOPS 10X. Der inkuberes i 3 minutter ved 70 ° C og sætte rørene på is i 10 min. Centrifugér prøver par sekunder ved5.000 x g. Tilsæt 2 pi gelloadningspuffer.
Bemærk: Formamid er giftigt. - Kør prøver i 20 min ved 90V. Soak gelen i nuklease-fri H2 OO / N til affarvning gelen før analysere det at kontrollere cRNA kvalitet.
- Bestem cRNA koncentration anvendelse af et spektrofotometer og opbevare dem ved -80 ° C.
3. mikroinjektion af syntetiseret RNA og oocyter Modning Stimulation
- Forbered det nødvendige udstyr til oocytter mikroinjektion. Brug en mikropipette aftrækker til at trække lille glas kapillarrør. Under stereomikroskop, brække det yderste af kapillar med pincet for at skabe en stump ende. Fyld kapillær mikropipette med mineralsk olie under anvendelse af en 1 ml sprøjte med et Millipore 0,45 um filter ved den modsatte ende. Monter mikropipette på mikroinjektion pipette. Vælg en nøjagtig mikropipette kalibreret af producenten til at give god nøjagtighed, når det bruges med passende glas kapillar.
- Udfør mikroinjektion 1-2 timer efter defolliculation, nødvendig forsinkelse for oocyt opsving på oocytter holdes ved 14 ° C. Brug petriskåle med bunden skrabet med en pincet for at skabe en klæbende overflade til oocytter og fylde dem med ND96 medium.
- Arrangere oocytter langs en skrabet bane i en petriskål tillader en successiv injektion af oocytter med den kapillære mikropipette i en vinkel på 45 ° C.
- Injicerer på oocytten ækvatorialzonen, under den pigmenterede dyr område for en optimal spredning af prøver i cytoplasmaet. Indsæt kun den tyndeste del af kapillær tip om ca. 150-200 um af dybde.
- Injicer 30 ng cRNA opnået henholdsvis fra de forskellige plasmider i et volumen på 60 nl i en første oocyt. Efter injektion, vente 5-10 sek, før du fjerner den kapillære tip til at undgå prøven flugt (figur 2A).
Bemærk: Du må ikke overstige 120 nl. Sprøjt så langsomt som du kan. En kontrol med destilleret vand anbefales. - Flyt manuelt petriskålen at injicere næste oocyt.
Bemærk: Sørg for, at spidsen ikke er tilstoppet ved at generere en lille puls ud af badet opløsning efter 2 til 3 mikroinjektioner. - Overfør oocytter injiceret i 24 brønde dyrkningsplader (10 oocytter / brønd) fyldt med 3 ml frisk medium ND96 og efterlade dem ved 19 ° C.
- Inkubér oocytterne i ND96 med progesteron (PG) (2 ug / ml) for at udløse meiotisk modning (GVBD) ved 19 ° C, 15 timer eller 4 timer efter mikroinjektion af polyadenylerede cRNA'er opnået henholdsvis fra pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 og pcDNA6 .2 / C-EmGFP anvendt som en kontrol (figur 2A).
Bemærk: Co-injektion af fluorescerende markør med cRNA er en nice værktøj til at sikre, at cRNA blev injiceret og forblev i oocytten. Udføre sådanne indledende forsøg ved hjælp af en cRNA af interesse med et GFP-tag. - Microinject som i # 3.5 forskellige forhold (1: 3, 2: 2, 3: 1) af polyadenyleret eIF4G1-WT og eIF4G1-DN cRNA'er med henblik på at test translationseffekt af eIF4G1-WT cRNA'er på mutant fænotype (figur 2D).
4. kimblære Fordeling Bestemmelse
- Tæl antallet af modne oocytter efter PG stimulering ved at observere tilstedeværelsen af en hvid plet på det sorte dyr stang med et stereomikroskop. Gentag tælle hver time indtil den fireogtyvende time (figur 2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Analyse
- Homogenisere gruppe på 10 oocytter ved frem og tilbage bevægelser med en mikropipettespids, ved 4 ° C i 200 pi i følgende buffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg / ml bovint serumalbumin, 10 mg / ml leupeptin, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml sojabønne trypsin inhibitor, 10 mg / ml benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM natriumvanadat.
- Centrifugér prøver i 15 min ved 10.000 xg for at fjerne lipid (øvre fase) og membranen (nederste fase) fractions. Saml den cytoplasmatiske fraktion, gemme en alikvot at bestemme proteinkoncentration og færdiggøre de resterende med Laemmli eller en bis-Tris-prøvebuffer (1: 1).
Bemærk: Bis-Tris-geler og ladningsbuffer har et mere neutralt pH, der beskytter proteiner fra hydrolyse - Varm 20 ug prøve ved 95 ° C i 10 minutter. Indlæse hver prøve i brøndene af acrylamid gel. Gelen anbringes i en tank med passende buffer.
- Udfør en elektroforese i 1 time ved 200 V.
- Realisere en WB i TBS pH 8,0 (Tris-HCI 15 mM, NaCI 150 mM, Tween 0,1%, der indeholdt 10% bovint serumalbumin) med en gede-anti-Aurora A / EG2 (1: 3.000, 2 timer) eller med en kanin-anti -Aurora A / EG2-P (1: 1.000, O / N ved 4 ° C), muse-anti-ERK2 (1: 3.000, 2 timer), gede-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3.000, 2 timer ), kanin-anti-mos (1: 5000, 4 timer), kanin-anti-GFP (1: 3000, 2 timer) antibodies.Use muse-antistoffer anti-V5 (1: 10.000, 2 timer) og kanin-anti-RSK (1 : 1.000, 2 timer) (som læsning kontroller).
- Vaskemembranen 3 gange i 10 minutter i TBS-Tween og inkuberes 1 time med enten et anti-mus eller anti-kanin eller anti-ged (IgM) peberrodsperoxidase-mærket sekundært antistof ved fortyndinger på 1: 5000, 1: 7.500 og 1 : 5.000 hhv.
- Udfør 3 vaske på 10 minutter i TBS-Tween og påvise antigen-antistoffer komplekser med Advanced ECL Detection-system.
6. polyadenylering Assay
- Prøve 5 oocyter pr tilstand i et 1,5 ml. Vaske dem med 1 ml nuklease-fri PBS 1X (pH 7,4). Følgende trin vil blive foretaget under emhætte.
- Uddrag RNA under anvendelse af en klassisk organisk procedure (se fabrikantens anvisninger).
- Recover RNA ved centrifugering (10.000 x g) i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og lufttørre RNA til 10 min.
- Resuspender RNA pellet i 30 pi Nuclease-free H 2 O.
- Tage 15 pi prøver i et nyt rør, og der tilsættes 85 pi Nuclease-free H 2 O. Ryd op iSE prøver at forbedre deres kvalitet på silica kolonne ifølge producentens anvisninger. Eluering af RNA ved anvendelse af 30 pi nukleasefri H2O
- Kør 1 pi prøver med 5 pi loading buffer på en 0,8% agarosegel for at kontrollere RNA integritet.
- Bestem RNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Forbered 2 ligeringsblandinger pr tilstand (dvs. eIF4G1-WT, eIF4G1-DN og H2O kontrol) med følgende reagenser: 10 U RNA-ligase, 0,1 volumen 10X puffer, 1 mM ATP, 10% af PEG8000 50% , 0,1 ug primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 og bringe det endelige volumen til 10 pi med nuclease-frit H 2 O. Tilføj i den første blanding RNA opnået fra oocytter uden PG stimulering og i den anden blanding RNA opnået fra PG stimulerede oocytter.
- Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C, derefter i 20 minutter ved 65 ° C til inaktivering af enzymet.
- OsEA cDNA revers transkription (RT) kit. Forbered RT blandingen, pr røret: 0,1 volumen 10X RT buffer, 0,1 ug primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP-blanding, 50 U revers transkriptase og komplet med nukleasefri H2O til slutvolumen 10 pi. Tilsæt 10 pi ligeringsreaktionen opnået tidligere. Udfør RT under betingelser beskrevet af producenten.
- Forbered Polymerase Chain Reaction (PCR) blanding pr røret: 0,1 volumen puffer 10X, 1,5 mM MgCl2, 133 pM dNTP blanding, 0,2 uM specifik primer, 0,2 uM primer P2, 0,025 U Taq-polymerase, 1 pi cDNA og komplet med nukleasefri H2O til slutvolumen på 50 pi. Udfør PCR under følgende betingelser: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, [95 ° C i 1 min, 56 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek] * 40 cykler, 72 ° C i 10 minutter 9. De specifikke primere er som følger: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA histon-lignende B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Der fremstilles en 3% agarosegel. Tilføj i hver PCR-produkter 10 pi påsætningspuffer. Kør gelen med 10 pi prøver ved 110 V for en optimal migration. Analyser gelen efter 10 og 20 min for at observere en ændring i størrelse afspejler længden af halen poly (A) og dermed RNA modning, som er en forudsætning for deres oversættelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinetisk modning af Xenopus oocyter og bestemmelse af den procentvise oocyt GVBD efter 24 timer af PG stimulering (figur 2B, 2C):
For at undersøge de translationelle konsekvenser af eIF4G1-DN mutation, reaktion på PG i Xenopus laevis oocyter mikroinjiceret med cRNA eIF4G1-DN i forhold til eIF4G1-WT og andre kontrolbetingelser (H2O, GFP). Kontrollerne gøre det muligt at vurdere forekomsten af oocyt mikroinjektion uanset arten af injiceret cRNA eller eIF4G1 overekspression.
De kinetiske maturations på 10 oocytter kendetegnet ved mikroinjicerede kontrolbetingelser (H2O og GFP) svarer til WT og antallet af undergår GVBD er meget tæt på hinanden ved 12 og 24 timer efter PG-stimulering (figur 2B). Efter 24 timer, modning af oocytter når 95,7% for WT, 97,1% for H2O og 97,5% for GFP (Fi figur 2C). Således mikroinjektioner med H2O eller kontrol cRNA'er eller eIF4G1 cRNA'er har ringe effekt på oocyt meiose udgivelse. Omvendt 8 timer efter PG-stimulering, er antallet af oocytter mikroinjiceret med eIF4G1-DN cRNA'er undergår GVBD forsinket i forhold til eIF4G1-WT cRNA'er (figur 2B) .Den meiose frigivelse af eIF4G1-DN versus eIF4G1-WT oocytter væsentligt falder med 85,8% og 77,4% ved 12 timer og 24 timer efter PG-stimulering (figur 2C). Det er også bemærkelsesværdigt, at 13 timer efter PG-stimulering, antallet af modne oocytter når et maksimum for alle forhold undtagen eIF4G1-DN hvor den maksimale opnås kun 20 timer efter PG-stimulering. Tilstedeværelsen af eIF4G1-DN mutation fører til dårligere oocyt-meiose frigivelse sammenlignet med eIF4G1-WT.
Genoprettelse af oocytmodning i nærvær af eIF4G1-DN takket være eIF4G1-WT (Figur 2D):
_content "> For at bestemme, om de eIF4G1-DN cRNA mikroinjektion indskrænker eller blokerer oocytmodning, forskellige forhold mellem eIF4G1-WT og eIF4G1-DN cRNA'er er co-mikroinjiceres. Under disse betingelser er en stigning på oocytmodning observeret som niveauerne af eIF4G1-WT cRNA hæve og de eIF4G1-DN cRNA decrease.While modning er observeret i 17,5% af oocytter med en dosis eIF4G1-DN cRNA'er denne procentdel når 76,7% med co-mikroinjektion af 3 doser eIF4G1-WT cRNA'er og tilstedeværelsen af én dosis eIF4G1-WT cRNA'er fører til 95% af oocytmodning. Dette forsøg viser, at modning defekt i Xenopus-oocytter mikroinjiceret med eIF4G1-DN er ikke irreversibel og kan delvist kan genoprettes.Expression MOS signalproteiner observeret på WB som indikator for translation evne før og efter PG-stimulering (figur 2E):
Proteinet niveau V5-tag i oocytter, der udtrykker eIF4G1-WT og eIF4G1-DN ligner reflekterende lignende mikroinjektion effektivitet. Niveauet af RSK proteinet anvendt som protein loading kontrol er også ens i alle forhold før og efter PG stimulering. Ekspressionen af GFP-proteinet er også til stede i oocytter mikroinjiceret med GFP cRNA stimuleret med eller uden PG. Disse data indikerer, at mikroinjektion og overekspression af eF4G1 ikke forstyrre oversættelsen af GFP. Imidlertid ingen GFP proteinekspression detekteres før og efter PG stimulering oocytter der udtrykker eIF4G1-DN. Som forventet, ingen endogen MOS ekspression kan påvises i fravær af PG stimulering. Desuden mos udtryk observeres i eIF4G1-WT og H 2 O kontrolvilkår efter PG stimulation i overensstemmelse med tidligere resultater viser, at overekspression af eIF4G1-WT har lidt konsekvenser for endogene MOS 16. Omvendt er en betydelig nedgang i MOS udtryk er mærkbar efter PG stimulering.
Protein ekspression af visse komponenter i MOS signaleringskaskade er også testet. For eksempel er Aurora A / EG2 protein handler opstrøms for MOS induktion og ikke påvisningen af det protein deregulering eller dets phosphorylerede form induceres efter observeres PG stimulering. Omvendt ses en deregulering af ERK2 fosforylering fremkaldt af mos i overværelse af eIF4G1-DN.
Disse resultater tydede på, at den endogene ekspression af MOS RNA til protein og mos afhængige ERK2 aktivering påvirkes af ekspression af eIF4G1-DN.
mRNA polyadenylering (figur 2F):
Polyadenylering af flere mRNA (Mos, cyclin A1, cyklin B1 og histon-lignende B4) er nødvendige for Xenopus oocytter meiose opsving blev testet. Den udførte assay gør det muligt at definere, om en stigning i amplimeren størrelse svarende til længden af poly (A) halen af mRNA er til stede efter PG stimulering. Faktisk, med PG stimulering tilsætning af en poly (A) hale er observeret i alle forhold, herunder eIF4G1-DN mutation.
Figur 1. Skematisk oversigt over MAPK kaskade aktivering. Ved hormonal stimulering af PG hurtige ændringer i aktiviteterne i flere enzymer opstår herunder Aurora A / EG2 og CPEB vej. Hyperphosphorylering for Aurora A / EG2 fører til CPEB (Cytoplasmatisk polyadenylering Element bindingsprotein) phosphorylering. Phosphoryleret CPEB anerkender CPE (Cytoplasmisk polyadenylering Element) om 3'UTR af MOS mRNA, rekrutterer CPSF (spaltning og polyadenylering Specificitet Factor) og aktiverer mRNA polyadenylering med PAP (Poly (A) polymerase). PG stimulering fremmer også successivt Maskin fosforylering via både virkningen af PKA og CDK1, Maskin / eIF4E dissociation og eIF4E / eIF4G1 forening. eIF4G1 rekrutterer transLATION initiation partnere, herunder PABP som interagerer med eIF4G1 og anerkender poly (A) hale. Efter syntese, MOS aktiverer MEK / MAPKK ved phosphorylering, der på skift, aktiverer ERK2 / MAPK ved phosphorylering. Denne såkaldte MAPK kaskaden er involveret i den meiotiske processer ved at styre M-fase post kinetisk, spindel morfogenese og inhibering af DNA-syntese. Kaskaden er indlejret i en positiv feed-back-løkke, der opretholder proteinsyntese. Man skal bemærke, at MoS ikke er den eneste protein anmodet om at blive syntetiseret til GVBD aktivering, dvs. at cyklin B forpligtet til at blive oversat til modning præstation.
Figur 2. eIF4G1-DN mutant påvirker oocytmodning og oversættelse i Xenopus laevis. RNA afledt af plasmider, der koder V5-mærkede eIF4G1 proteiner (WT og DN) ermikroinjiceres i Xenopus laevis oocyter. Efter 15 timer, er modning af oocytter stimuleret af progesteron (PG) (Eksperimenter blev udført mindst 3 gange og repræsentative resultater er vist). (A) Schematicoverview af eksperimenter protokol. De injektioner af eIF4G1 og / eller GFP cRNA'er er repræsenteret ved pilespidser før PG stimulering. Prøver til RNA og proteiner analyser er blevet opnået ved 2 tidspunkter (PG stimulation og ved udgangen af GVBD kinetisk). (B) Kinetisk modning af oocytter 10 kendetegnet ved GVBD testes under 24 timer efter PG-stimulering. En forsinkelse i oocytmodning er observeret i oocyter mikroinjiceret med eIF4G1-DN cRNA'er sammenlignet med dem mikroinjiceres med eIF4G1-WT cRNA'er (C) Procentdel af modne oocytter 24 timer efter PG-stimulering (n = 4; * p <0,05).. Et fald i oocytmodning er observeret i dem mikroinjiceret med eIF4G1-DN cRNA'er forhold til eIF4G1-WT cRNA'er. (D) Reversion fænotype vurdering af oocytter mikroinjiceret med eIF4G1-DN mutant cRNA'er og eIF4G1-WT cRNA'er viser, at translationsmaskineriet er stadig funktionel, når eIF4G1-WT sættes til mutant. (E) Proteiner ekstraheres fra oocyter og deres niveauer bestemmes ved immunoblotting-analyse . Forstyrrelser af ERK2 fosforylering, mos og GFP udtryk i eIF4G1-DN betingelser overholdes. (F) polyadenylering af mos, cyclin A1 cyclin B1 og Histon-lignende B4 mRNA fra oocytter stimuleret eller ej med PG observeret efter PCR-amplifikation og migration på 3% agarosegel. Efter PG stimulering, der registreres en stigning i størrelse> 100 polyadenylering for alle forhold. Den første bane svarer til stigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oversættelse er en mekanisme involveret i fysiopatologi af talrige humane forstyrrelser, herunder flere neurodegenerative sygdomme. For eksempel i Parkinsons sygdom flere rapporter foreslog nedskrivninger i oversættelse i forbindelse med arvelige mutationer 8,12,13.
Flere cellulære modeller fås til at studere translation. Her, med henblik på at studere de translationelle følger af en mutation i eIF4G1 der fungerer som dominant negativ mutation reducere interaktionen mellem eIF4G1 og eIF4E partnere 8, Xenopus laevis oocyt anvendes. Denne model har fordelene ved enkelthed, da det er sammensat af kun et enkelt kæmpecelle lette mikroinjektion af syntetisk mRNA, hvilket fører til en betydelig mængde materiale til biokemiske eksperimenter og lette makroskopiske observationer af de forskellige faser af oocytmodning. Denne proces er også tid effektiv i forhold til stabil celleline generation. Desuden har flere protokoller oocyt forberedelse og RNA mikroinjektioner allerede blevet beskrevet især til at studere cellecyklus eller nucleocytoplasmic transport 14,15. Vedrørende grænserne for sådanne protokoller til at studere translation, bør der træffes en særlig opmærksomhed med hensyn til koncentrationen af mRNA. Denne koncentration bør ikke være at høj (ikke højere end 30 ng i 120 nl maksimum) for ikke at mætte oversættelsesprocessen. Under hensyntagen til dette element, Xenopus oocyt er en attraktiv model til at studere protein oversættelse som attesteret af data præsenteret i figur 2 med en mutant form af EIF4G1 udskrift.
Faktisk, i nærværelse af det muterede eIF4G1, nedskrives i oversættelsen af MOS protein observeret og korreleret med et fald på 90% af GVBD forhold til WT og kontrollere forhold. Omvendt havde overekspression af eIF4G1-WT ikke medføre ændringer i niveauet of MOS oversættelse efter aftale med litteratur data 16,17.
Adskillige biologiske modifikationer kan forklare disse resultater. Vel vidende, at MoS mRNA er af moderens oprindelse og allerede transskriberet før meiose aktivering af PG, skulle opstå de forstyrrede mekanismer mellem transskription og oversættelse trin. Bemærkelsesværdigt, mos oversættelse er resultatet af en kaskade af molekylære begivenheder, der starter fra en latent mRNA uden poly (A) hale til tilsætning af halen efter PG stimulation til oversættelse 18,19. Således er mulige herunder flere scenarier: fejl i oversættelse initiering kunne mistænkes som årsag til denne fejl, eller fejl i phosphorylering af faktoren, der fører til MOS mRNA polyadenylering, eller misligholdelse af mRNA polyadenylering af MOS afskrifter af sig selv kunne føre til en translationel fald.
For at vurdere disse sidste 2 mekanismer, er udtryk for disse faktorer, som WB undersøgt. Hurtigion niveauer af phosphoryleret Aurora A / EG2, der er ansvarlige for CPEB fosforylering viste ingen forstyrrelse i nærværelse af det muterede eIF4G1. På samme måde, observeres MOS mRNA polyadenylering eller anden mRNA polyadenylering i nærværelse af det muterede eIF4G1 efter PG-stimulering (figur 2F). For yderligere at bekræfte polyadenylerings profil Northern blot eksperimenter ville blive anbefalet samt udfører sucrosegradient isolation af polysomer med henblik på at fastslå, om ansættelse af mRNA til ribosomet kan forekomme 16.
Så ved at studere den første og sidste elementer i hierarkiet, blev perturbed fase mistænkt for at være nedstrøms for forekomsten af polyadenylering. Det er også vigtigt at teste, om MOS udtryk defekt gav de forventede konsekvenser for phosphorylering af ERK2. I nærværelse af mutationen, faldet i MOS ekspression førte til et fald af phosphoryleret ERK2 niveau og dermed en defekt iden GVBD progression (Figur 1 og 2E). Således er eIF4G1 mutation associeret med en forventet nedgang i MOS oversættelse. Sletning af eIF4E bindende domæne i eIF4G1 sekvens i eiF4G1-DN er formentlig ansvarlig for et fald i eIF4G1 / eIF4E interaktioner som ved en co-immunopræcipitering undersøgelse 8, der kan forstyrre den eIF4F kompleksdannelse tidligere foreslået.
Denne protokol har flere interessante anvendelser i cellebiologi. Dette set-up er ideel som forundersøgelser for en række grundlæggende spørgsmål i cellebiologi som: for bedre at forstå betydningen af specifikke domæner af initieringsfaktorer og definere dem, der er afgørende for in vivo oversættelse eller oocytmodning. I denne sammenhæng Wakiyama et al. (2000) viste vigtigheden oocytmodning af den aminoterminale region eIF4G1 indeholder bindingsdomæner til eIF4E og PABP 17; at studere splicing af indvielse faktorer 20; at dechifrere de mekanismer, der anvendes af virus kapring vært oversættelse maskiner til deres formål via eIF4G1 spaltning for eksempel med hæmning af cap-afhængig oversættelse og IRES strukturer af deres mRNA, oversat i cap-uafhængig måde 21; at studere den rolle, mutation i oversættelse faktorer på cellecyklus, da oocytter er modeller af valg til en sådan undersøgelse 22; at studere de vigtigste mekanismer, der styrer initiering af translation dvs at cap-afhængige og hætte-uafhængig definere, om en eller flere systemer er involveret i en proteinsyntese forstyrrelser. Flere variationer af den nuværende protokol kunne nemt blive anvendt for at nå disse mål, herunder fastsættelse af oversættelsen effektivitet ved solnedgang method23 eller reporter mRNA mikroinjektion. For eksempel brugen af et bicistronisk reporter mRNA indeholder en første cistron, hvor Renilla-luciferase bliver cap-afhængig oversatmens den anden cistron indeholder ildflueluciferase vil blive oversat via IRES strukturer bør gøre det muligt at definere den form for indvielse at fremsætte fine defekter og / eller kompensationer for at opretholde oversættelse homeostase. Desuden sådanne luciferase reporter RNA eksperimenter tilbyde den fordel at ikke stole på potentielle forstyrrelser, som specialiserede udviklingsmæssige mekanismer på grund af ufuldstændig bevarelse mekanismer med human.
Sideløbende med disse grundlæggende spørgsmål, kunne en sådan protokol anvendes som et første skridt til at løse skadelige forhold, der kan bidrage til neurologiske lidelser. I fysiologiske forhold, translationsinitierings- trin er de privilegerede mål for forskrifter i henhold stressede forhold såsom oxidation, hypoxi, temperaturændring, bestråling og næringsstoffer afsavn. Under sådanne forhold, en selektiv translation af transkripter, der koder for proteiner, der er væsentlige mod spændinger og celleoverlevelse forekommer.Når denne proces er overvældet, spændinger bliver patologisk og deltage aktivt i udviklingen af flere neurologiske følelser. Cellulære stressfaktorer er involveret i talrige neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers og Parkinsons sygdomme, amyotrofisk lateral sklerose eller prionsygdom (Creutzfeldt-Jakobs) 24, og disse spændinger inducere aktiveringen af udfoldet protein Response (UPR). En af disse UPR mekanismer fører til en nedsat oversættelse via PERK aktivering og phosphorylering af eIF2α underenhed med konsekvenserne af at stoppe oversættelse ved at forhindre binding mellem eIF4F og 43S komplekser 25. I Xenopus oocytter, at tilsætning af oxidative midler og / eller muterede gener kendte være forbundet med sådanne patologier ville efterligne disse spændinger, og fastslå, om de muterede gener kan påvirke den oversættelse processer. Ved Parkinsons sygdom for eksempel indførelse af eIF4G1 p.R1205H i Xenopos oocyt forbundet eller ikke at oxidativ stressfaktorer eller genom-dækkende analyse af mRNA polysomalt profiler kunne behandle spørgsmålet om oversættelsen involvering i fysiopatologi 26.
Alle disse programmer anvendes på ægget udgør således et stort felt af muligheder for at studere oversættelse forstyrrelser, der nu vides at være forbundet til flere følelser, herunder neurodegenerative sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
