Abstract
タンパク質合成は、多様な生物学的プロセスに影響を与える遺伝子発現環境条件に特に適応への基本的なプロセスです。 mRNAの開始コドン、eIF4G1含む関与の開始因子でリボソームサブユニットの組み立てを伴う開始段階、。翻訳のこの律速段階の欠陥は、多様な疾患にリンクされています。そのような規制緩和の潜在的な影響を検討するために、 アフリカツメガエル卵母細胞が、ヒトとの本質的な細胞および分子メカニズムの保全度の高い魅力的なモデルを構成しているアフリカツメガエル 。また、減数分裂成熟中に、卵母細胞は、転写抑制され、すべての必要なタンパク質は、既存の、母体由来のmRNAから翻訳されます。この安価なモデルは、効果的な翻訳と完全に統合になるために、外因性のmRNAを可能にします。ここではSTORを使用して（ここではeIF4G1）興味の率で翻訳を評価するためのプロトコルに記載されています生理的な読み出しとして、卵母細胞の成熟中にポリアデニル化および翻訳することが最初のものである母性mRNAのエド。最初に、関心のプラスミドのインビトロ転写（ここeIF4G1）によって合成さmRNAは卵核胞崩壊検出が決定されることにより、卵母細胞および卵成熟の速度で注入されます。研究母性mRNA標的は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼモスです。そのポリアデニル化およびその後の翻訳は、卵母細胞の成熟に関与するシグナル伝達カスケードMOSのタンパク質の発現およびリン酸化と一緒に検討しています。現在のプロトコルのバリエーションが提唱する翻訳の欠陥は、その一般的な適用性を強調するために提案されています。異常なタンパク質合成は、神経疾患の病因に関与し得ることを新たな証拠に照らして、そのようなモデルは、簡単にこの障害を評価し、新たな標的を同定するための機会を提供します。
Introduction
タンパク質は、細胞の生命の本質的な要素であり、したがって、生物の大規模で。彼らは、それらの発現はmRNAのタンパク質への変換を可能にする翻訳の複雑な機構の結果であるなど構造、輸送、反応触媒、規制、遺伝子発現を含む細胞機能の大部分を確保します。翻訳に適応するために、開発および分化、老化、生理学的ストレスまたは病理学的徴候の間、細胞の必要に応じて遺伝子発現を調節するために様々な制御に供されます。
キャップ依存性、キャップ非依存の内部リボソーム侵入セグメント（IRES）の構造とキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ 経由 ：翻訳は、3開始翻訳システムこれらのニーズに対応するために3段階（開始、伸長及び終了）やプレゼントに分割され、 ）CITE。
ほとんどの真核生物のmRNAはキャップDEPEに翻訳されていますタンパク質合成の間に認識機能として機能7-メチル5'-三リン酸キャップ経由 ndentの方法。このキャップは、eIF4Eの、eIF4G1とeIF4AとeIF4F複合体の成分に結合します。ポリ（A）結合タンパク質（PABP）のような他のパートナーに関連する、EIF2-GTP-Metの-tRNAのMetは 、これらの翻訳開始因子は、mRNAを環状と認識1 AUG開始コドンまで、フォームに43S複合体をそのアクセス性を向上させることができます。このイベントは、翻訳開始、すなわち、翻訳の最初のステップの終わりに相当します。
キャップ非依存性翻訳は、例えば細胞増殖およびアポトーシスのために誘導するストレスの条件下で必須タンパク質をコードするmRNAによって使用されます。このメカニズムは、mRNA中の二次構造を伴う5'-非翻訳領域（UTR）はIRES、eIF4Aおよび43S複合体と会合しeIF4G1のカルボキシ末端と呼ばれます。この43S開始前Cの結合IRESにomplexは、eIF4Eの係数2,3を必要とせずにキャップ依存性翻訳を開始します。
mRNAのUTR 4内に配置された構造をCITE を経由して最後に、まだよくわかっていない別の変換メカニズムは、ストレス条件下では、このキャップ非依存性翻訳活性をサポートしています。
彼らの開始段階によって異なる翻訳のこれらの様々なモードを通じ、翻訳が細胞の恒常性に重要な役割を果たし、これらのプロセスのいずれかの変化は、このように大規模な効果のために小さなと生物に影響を与えるだろう。実際、開始は、タンパク質へのmRNAの正しい翻訳プロセスを支配する律速段階であるため、多数のコントロールの対象と規制点5です。一つは欠陥があることが判明した場合、それは後者のために、またはこれらのプロセスのコンポーネントのためのものであるかどうか、それが細胞内で確立されたバランスを乱すますので、病理学的コンディにつながる可能性ション。この文脈では、翻訳因子における変異は、潜在的に、ウォルコット-Rallison症候群（PERK用EIF2AK3をコードする遺伝子）7に 、白matter'（eIF2B1-5サブユニット）6を消失して、そのような`巣性白質脳症などの神経変性疾患を含むいくつかの疾患に関与してきましたパーキンソン病（eIF4G1のp.R1205H）8。それは、疾患の開発に、翻訳開始の一般的な方法で知識を高めるために、これらの変異体タンパク質の細胞および分子の試験を実施することが重要です。
これらの研究を行うためには、これらの変異の影響を観察するための最も適切なモデルを選択することが重要であるアフリカツメガエルの卵母細胞は、特によく、それらの生理学的および生化学的性質に適合されているアフリカツメガエル ：（細胞周期の位相G2にブロックされた）生理的な同期タンパク質合成の、大容量（200〜400 ngの/日/卵母細胞）、抽出されたOOCの数が多いです同じ動物からytes（800〜卵母細胞/女性）と、その操作を容易に細胞の大きさ（直径1.2〜1.4ミリメートル）。合成されたmRNAとアフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションは簡単に翻訳手順を分析するために実施することができます。このビューでは、他の利点を提供します。減数分裂の進行の速さと翻訳のmRNAのマイクロインジェクション（〜24時間）の後を考えると、 アフリカツメガエル卵母細胞は、再構成された携帯（ 大腸菌から抽出された、小麦胚芽やウサギ網状赤血球...）システムmRNAがある、と比較して高速なシステムを表しています縮小翻訳速度とし、低速で翻訳。だから、mRNA中に導入された変異の効果はすぐに観測可能となり、簡単にいくつかの卵母細胞で研究。 アフリカツメガエル卵母細胞のもう一つの利点は、母性mRNAが潜伏しているとタンパク質翻訳がプロゲステロンの刺激の前にブロックされていることです。プロゲステロンの添加は、このように、翻訳の誘導を制御するための良い手段です。細胞質Polyadenylationは卵形成時に発生しません。これは、時間順にプロゲステロンで刺激した卵母細胞で卵成熟の間に始まり、開発の初期段階を通じて継続し、翻訳の異なる段階を研究するために使用することができます。
MOS mRNAのポリアデニル化が起こり、最初のうちであり、それはチャールズワースらに定義されている「早期成熟」遺伝子のクラスにオーロラA / Eg2の、ヒストン様B4 mRNAと属しています。（2004）9。そのようなサイクリンA1およびサイクリンB1と「後期」のmRNAの翻訳の誘導は、胚胞崩壊（GVBD）の頃に発生します。 MOS mRNAは、セリン/スレオニンプロテインキナーゼをコードします。それは間接的に卵成熟を活性化するMAPキナーゼカスケードを誘発するので、その翻訳は非常に重要です。実際には、プロゲステロンに応答して、MOS mRNAのポリアデニル化を目でオーロラA / Eg2の調節タンパク質および他のRNA結合タンパク質を伴うプロセスを介して促進されますMOS mRNAの電子3'UTR。 MOS mRNAのこの増加したポリアデニル化は、次にMEK1を活性化するMOSタンパク質レベルの増加をもたらします。このプロセスは、細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）（ 図1）の活性化を媒介します。このシグナル伝達カスケードは、その後成熟M期促進因子、サイクリンBとはCdc2キナーゼによって形成された複合体をトリガーし、最終的に減数分裂再開につながることができます。
アフリカツメガエル卵母細胞したがって、そのようなMOSなどの母性mRNAの研究では、簡単にいくつかのモス、シグナリング成分もGVBD率の決意を含めての翻訳への効率的なポリアデニル化のいくつかのエンドポイントとその翻訳可能をテストするために使用することができます。このシステムは、新たに転写されたmRNAまたはトランスフェクション効率を妨害することなく、翻訳開始因子の突然変異の最初の結果を評価することは興味深いことである問題がしばしば発生してeukary耳の細胞研究。
ここでは、プロトコルは、 アフリカツメガエル卵母細胞と母性mRNAの翻訳をテストするに変異eIF4G1のmRNAが微量注入される確立されています。卵母細胞の減数分裂細胞周期を通って、初期および後期のクラスのmRNAのその後の翻訳のために進行に不可欠であるGVBD進行中の欠陥、MOSのmRNAのポリアデニル化の存在下で確認されます。リン酸化オーロラA / Eg2のおよびERKものMOS deregulation.Thusの結果を確認するために検討され、 アフリカツメガエル卵母細胞は、mRNAの翻訳の異なるステップを分析するための簡単な方法を表します。
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Protocol
すべてのアフリカツメガエルの実験は、実験動物実験のための欧州共同体理事会のガイドライン（609分の86 / EEC）の規則に従ってリール1大学の動物施設で実施しました。動物プロトコルは、（アン実験ANIMALEノールパドカレ、CEEA 07/2010ComitéドールEthique）ローカルの機関審査委員会によって承認されました。
1.卵母細胞の取り扱い
- 滅菌水1Lにトリカインメタンスルホン酸の粉末1gを溶かす：麻酔液を準備します。
- プランジメスアフリカツメガエルは、エスケープを回避し、完全に（足のピンチに任意の反応なし）鎮静されるべき動物のために約45分を待つようにビーカーをカバーし、この溶液に、 アフリカツメガエル 。
- 石鹸でカエルを洗い、きれいなアルミ箔の上に、その背中に動物を配置した後、水道水ですすいでください。
- 腹部の横部分のとピンセットで卵巣レベルで皮膚を固定します。エタノール70％で使用する前に洗浄はさみで約1cmの切開を行います。セクションでは、十分な深さであることを確認し、開発のさまざまな段階で、いくつかの卵母細胞が発見された卵巣組織の切除を可能にするために、基礎となる腹壁に到達します。
- ND96培地（96ミリモルのNaCl、2mMのKClを含むペトリ皿（50 mm）の中にそれらを4回洗浄し、卵巣葉を分析、1mMのMgCl 2、1.8mMのCaCl 2を、5mMのHEPESは、NaOHでpH7.4に調整補っ50μg/ mlのストレプトマイシン/ペニシリン、225 / mlのピルビン酸ナトリウムと、/ mlの大豆トリプシン阻害剤30μgの、1μL/ mlのテトラサイクリン）の血液や破片の痕跡をすべて削除します。
注意：テトラサイクリンは、最適な保全とマイクロインジェクション処理後の良好な回収を可能にします。 - 一週間のために彼らの保存を可能にする、14℃で培地中に沈め覆われたペトリ皿に保管してください。
- 獣医吸収トンと腹壁と皮膚をステッチhreadと縫合針（3または4のステッチが必要となります）。
- 水なしでビーカー内で動物を置き、カエルが再び移動されるまで、水道水で肌をしっとり。逃げるのを防ぐために、ビーカーをカバー。
- 10倍の倍率での実体顕微鏡下に鉗子の2組を使用して、慎重に5〜10個の卵母細胞のグループで培地中で卵巣ローブを区切ります。第VI段階で卵母細胞を選択します。彼らは、茶色の色素性動物極と直径10 1.2 mmまでⅱ）その大きさの優れた明瞭なベルトで区切られた黄色の栄養極に）iで、その形や色を認識することができます。
- （コラゲナーゼは、卵母細胞/濾胞細胞接続を消化）卵母細胞defolliculationを容易にするために、45分の間、穏やかな攪拌下シャーレ内コラゲナーゼ溶液（テトラサイクリンなしND96に溶解クロストリジウムヒストリチカムから1 mg / mlのコラゲナーゼA）で選択された卵母細胞をインキュベートします。 ND96培地で3〜4回は14に保たれた卵母細胞をすすぎます°C。
注：以下の卵母細胞または卵母細胞表面タンパク質を破壊する、貧しい生存能力を引き起こすリスクに起因する以上45分間インキュベートしないでください。コラゲナーゼ処理は、自発GVBDを誘導することができます。 - 3-4時間のための培地中の卵母細胞をインキュベートします。両眼虫眼鏡の下に細かいピンセットで濾胞細胞を除去し、ND96培地で19℃で保管してください。
mRNAの合成の調製
- Pme I制限酵素の酵素を用いた酵素消化により以下のプラスミド5μgのを線形化。
注：1599のアミノ酸eIF4G1 cDNAを、野生型（eIF4G1-WT; NM_198241）を含むpcDNA6.2 / V5-DEST変異c.2105TでeIF4G1ドミナントネガティブのcDNA（eIF4G1-DN）を含む、pcDNA6.2 / V5-DEST > G c.2106A> C、c.2120-> G、c.2122T> A、2125T> -位置612でeIF4G1とのeIF4E間の相互作用の領域にとc.2126T> G乱す対応するタンパク質の618に対話betweアンeIF4G1とのeIF4E 8、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（GFP）を含むpcDNA6.2 / C-EmGFP。 3プラスミドのそれぞれについて、2の混合物を準備します。I酵素Pmeを含む第1および制御などの酵素なし秒。 - 古典的なエタノールの手順を用いてプラスミドDNAを沈殿し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O20μlに再懸濁し、それを
- 分光光度計を用いてその濃度を決定します。濃度は、cRNAのを転写するμlの150 ngの/よりも優れている必要があります。
- プラスミド線形化を確認するために、0.8％アガロースゲルでのローディングバッファー5μlのサンプルとそのコントロールの1μLを実行します。
- in vitro転写し、製造業者の指示に従ってcRNAを精製するためのキットを使用してください。転写されたcRNAは、ヌクレアーゼフリーの H 2 O20μlに再懸濁し、必要に応じて、サンプルは-80℃で保存することができます。
- 0.2 M MOPS（pH7.0）で、20メートルを含むMOPS 10X移行バッファを準備M酢酸ナトリウムおよび10mM EDTA（pHは8.0）。 0.45μmのフィルターで溶液を滅菌します。溶液の酸化を避けるために、室温で、光から保護した溶液をストック。
- NaOH、HClを用いて連続的に電気泳動槽を清掃し、完全にO / NのRNaseを避け、RNA分解を防ぐためのための二重濾過し、水ですすぎました。
- MOPSおよびホルムアルデヒドを含む1.5％アガロースゲルをキャストします。完全にアガロースに溶解するまで加温し、それが55℃まで冷却しましょう。ヒュームフードの下では、MOPS 10X 0.1容量、ホルムアルデヒドの6.6％エチジウムブロマイドの4μgの（10mg / ml）を追加します。ヒュームフードの下でゲルを注ぎ、ゲルが硬化するのに約1時間を待ちます。
注意：ホルムアルデヒドとエチジウムブロマイドは有毒です。 - cRNAの1μlを、ホルムアルデヒドの8.8％、ホルムアミドの60％とMOPS 10X 0.1容量0.2 mlチューブに移行するためのサンプルを準備します。 70℃で3分間インキュベートし、氷上で10分間、チューブを置きました。遠心サンプル数秒で5,000×gで。ゲルローディング緩衝液2μlのを追加します。
注意：ホルムアミドは有毒です。 - 90Vで20分間、サンプルを実行します。 cRNAの品質をチェックするためにそれを分析する前に、ゲルを脱色するためにヌクレアーゼフリーH 2 OO / Nでゲルを浸し。
- 分光光度計を使用したcRNAの濃度を測定し、-80℃で保存します。
合成されたRNAおよび卵母細胞成熟刺激の3マイクロインジェクション
- 卵母細胞のマイクロインジェクションのために必要な機器を準備します。小さなガラスキャピラリーを引っ張ってマイクロピペットプラーを使用してください。実体顕微鏡下では、平滑末端を作成するために、ピンセットでキャピラリーの先端を断ちます。反対側の先端にミリポア0.45μmのフィルターで1mlシリンジを使用して、鉱物油とキャピラリーマイクロピペットを埋めます。マイクロインジェクションピペットの上にマイクロピペットをマウントします。適切なガラスキャピラリーを使用した場合に良好な精度を得るためにメーカーで校正正確なマイクロピペットを選択してください。
- 、defolliculation後に14℃に保たれた卵母細胞に、卵母細胞の回復のために必要な遅延をマイクロインジェクション1〜2時間を実行します。ボトムでペトリ皿を使用した卵母細胞のための接着面を作成し、ND96媒体でそれらを埋めるためにピンセットで掻き取っ。
- 45℃の角度でキャピラリーマイクロピペットで卵母細胞の連続注入を可能にするペトリ皿で掻き取っレーンに沿って卵母細胞を配置します。
- 細胞質中のサンプルの最適な拡散のための着色された動物のエリアの下に、卵母細胞赤道域に注入します。深さの約150〜200ミクロンのキャピラリー先端の唯一の最も薄い部分を挿入します。
- 最初の卵母細胞における60 NL量の異なるプラスミドからそれぞれ得られたcRNAの30 ngのを注入します。注入後、サンプルエスケープ（ 図2A）を回避するために、キャピラリー先端を除去する前に5〜10秒間待ちます。
注意：120 NLを超えないようにしてください。ゆっくりとすることができますように注入します。蒸留水で制御することをお勧めします。 - 次卵母細胞を注入するために手動でペトリ皿を移動します。
注意：先端が2〜3マイクロインジェクション後、浴溶液から小さなパルスを生成することにより、目詰まりしていないことを確認します。 - 転送が新鮮ND96培地3mlで満たし、19℃でそれらを残す（10卵母細胞/ウェル）を24ウェルの培養プレートに卵母細胞を注入しました。
- pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1とpcDNA6からそれぞれ取得した19°C、ポリアデニル化cRNAをマイクロインジェクション後15時間または4時間で減数分裂成熟（GVBD）をトリガするためにプロゲステロン（PG）（2μg/ ml）でND96で卵母細胞をインキュベート0.2 / C-EmGFPは、コントロール（ 図2A）として使用します。
注：cRNAを蛍光マーカーの同時注入は、cRNAを注入した卵母細胞に残ったことを確実にするために便利なツールです。 GFPタグと利益のcRNAを使用して、このような予備実験を行います。 - TEのためにポリアデニルeIF4G1-WT及びeIF4G1-DNのcRNAの＃3.5異なる比（1：;：; 2 3 3 2 1）のように顕微注入しますST変異体の表現型（ 図2D）にeIF4G1-WTたcRNAの翻訳効果が。
4.卵核胞崩壊の決意
- 実体顕微鏡と黒の動物極に白いスポットの存在を観察することにより、PG刺激後、成熟した卵母細胞の数をカウントします。第二十四時間（ 図2B、2C）までカウントを時間ごとに繰り返します。
5.ウエスタンブロット（WB）分析
- 50mMのHEPES、pHが7.4、500mMのNaCl、0.05％SDS、5mMのMgCl 2、1mgの次のバッファ内の200μl中、4℃で、マイクロピペットチップで前後に動きによって10卵母細胞のグループを均質化/ mlのウシ血清アルブミン、10 mg / mlのロイペプチン、10 mg / mlのアプロチニン、10 mg / mlの大豆トリプシン阻害剤、10 mg / mlのベンズアミジン、1mMのPMSF、1mMのバナジン酸ナトリウム。
- 脂質（上相）および膜（下相）は、fを除去するために万×gで15分間遠心サンプルractions。細胞質画分を集め、タンパク質濃度を決定し、レムリまたはビス - トリスサンプル緩衝液（1：1）を用いて、残りを完了するためにアリコートを格納します。
注：ビス - トリスゲルローディング緩衝液は、加水分解からタンパク質を保護し、より中性のpHを有します - 10分間95℃で試料の20μgのを加熱します。アクリルアミドゲルのウェルに各サンプルをロードします。適切な緩衝液を用いてタンク内にゲルを置きます。
- 200 Vで1時間電気泳動を行います
- またはウサギ抗と共に：ヤギ抗オーロラA / Eg2の（3000、2時間1）を用いてTBS pH8.0の中でWB（トリスHCl 15mMの、NaClを150 mMの、ツイーン0.1％、10％のウシ血清アルブミンを含む）を実現-Aurora A / Eg2の-P（1：4°Cで1,000 O / N）、マウス抗ERK2（1：3000、2時間）、ヤギ抗ERK2-P（Tyr204）（1：3000、2時間）、ウサギ抗MOS（1：5000、4時間）、ウサギ抗GFP（1：10,000 2時間）およびウサギ抗Rskが（1：3000、2時間）antibodies.Useマウス抗V5を（1抗体：1,000、2時間）（）のローディングコントロールとして。
- ウォッシュ膜をTBS-Tween中で10分間3回、抗マウスまたは抗ウサギまたは1の希釈で抗ヤギ（IgM抗体）、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体のいずれかで1時間インキュベートする：5000、1：7500および1 ：それぞれ5,000。
- TBS-Tween中で10分の3回の洗浄を行い、高度なECL検出システムと抗原抗体複合体を検出します。
6.ポリアデニル化アッセイ
- サンプル1.5ミリリットルで条件あたり5卵母細胞。ヌクレアーゼフリーのPBS 1X（pHは7.4）1mlでそれらを洗ってください。次の手順では、ヒュームフードの下で行われます。
- （製造元の説明書を参照してください）古典的な有機の手順を用いてRNAを抽出します。
- 4℃で5分間の遠心分離（10,000×gで）によるRNAを回復します。 10分間上清と空気乾燥RNAを削除します。
- ヌクレアーゼフリーH 2 O30μlの中で再懸濁し、RNAペレット
- 新しいチューブ内のサンプルの15μLを取り、ヌクレアーゼフリーの H 2 Oの85μlを添加しますクリーンアップSEのサンプルを、製造業者の説明書に従って、シリカのカラム上での品質を向上させることができます。ヌクレアーゼフリーの H 2 O 30μLを用いてRNAを溶出
- RNAの完全性を確認するために、0.8％アガロースゲル上のローディングバッファー5μlのサンプルの1μLを実行します。
- 分光光度計を用いてRNA濃度を決定します。
- RNAリガーゼの10 U、10×バッファーの0.1体積、1mMのATP、PEG8000の10％：50％以下の試薬 を用いて（ すなわち、eIF4G1-WT、eIF4G1-DNとH 2 Oコントロール）条件あたり2ライゲーション混合物を準備します、0.1プライマーP1（5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 '）11μgのとヌクレアーゼフリーのH 2 Oで10μlの最終容量をもたらしますPG刺激することなく、卵母細胞から得られた第一の混合物のRNA中に追加して、PGから得られた第2の混合物のRNA中に卵母細胞を刺激しました。
- 酵素を不活性化するために65°Cで20分間、次いで37℃で1時間インキュベートします。
- お問い合わせEA cDNAを逆転写（RT）キット。チューブあたり、RT混合物を準備します。10X RT緩衝液の0.1容量、プライマーP2（5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT）100.1μgの、4 mMののdNTP混合物、逆転写酵素の50 U最終容量にヌクレアーゼフリーのH 2 Oで完全に10μlに。先に得られたライゲーション反応物10μlを追加します。製造業者によって記載された条件の下でRTを実行します。
- バッファ10倍の0.1体積、1.5のMgCl 2、133μMのdNTP混合物、0.2μMの特異的プライマー、0.2μMのプライマーP2、0.025 UのTaqポリメラーゼ 、cDNAの1μlのとで完了：チューブあたりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の混合物を、準備50μlの最終体積にヌクレアーゼフリーH 2 Oを。 * 40サイクル、72°C [30秒、30秒、1分、56℃、95℃、72℃]、10分間、2分間、95°C、50°C以下の条件でPCRを行います10分9用 。次のように特異的プライマーは以下のとおりです。モス、GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAAヒストン様B4、AGTGACAAACTAGGCTGATATACT。サイクリンA1、CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG。サイクリンB1：GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9。
- 3％アガロースゲルを準備します。各PCR産物をローディング緩衝液10μlに追加します。最適な移行のために110 Vでのサンプルの10μlのゲルを実行します。テールポリ（A）の長さとその翻訳するための前提条件であるので、RNAの成熟を反映した大きさの変化を観察するために10と20分後にゲルを分析。
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Representative Results
アフリカツメガエル卵母細胞とPG刺激の24時間後の割合卵母細胞GVBDの決意（ 図2B、2C）のキネティック成熟：
eIF4G1-DN変異の翻訳結果を研究するために、 アフリカツメガエルにおけるPGに対する応答は（H 2 O、GFP）eIF4G1-WTおよび他の制御条件と比較されたcRNA eIF4G1-DNに微量注入した卵母細胞をアフリカツメガエル 。コントロールは関係なく、注入されたcRNAのかeIF4G1過剰発現の自然の卵母細胞のマイクロインジェクションの発生率を評価することができます。
マイクロインジェクション制御条件（H 2 OおよびGFP）によって特徴づけられる10卵母細胞の運動maturationsは、WTと類似しており、GVBDを受けるの数は、PG刺激（ 図2B）の後に、非常に12で互いに近接し、24時間です。 24時間後、卵母細胞の成熟は（Fiを提供して WTための95.7パーセント、GFPのためのH 2 O、および97.5％のための97.1パーセントに達しましたグレ2C）。このように、H 2 OまたはコントロールcRNAを持つマイクロインジェクションまたはeIF4G1たcRNAは、卵母細胞の減数分裂のリリースにほとんど影響を及ぼさありません。逆に8時間PG刺激後、GVBDを受けeIF4G1-DNのcRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞の数はeIF4G1-WTのcRNA（ 図2B）が有意に85.8パーセント減少eIF4G1-WT卵母細胞対 eIF4G1-DNの選択図減数分裂のリリースに比べて遅れていると12時間で77.4パーセントと、それぞれのPG刺激後24時間（ 図2C）。これはPG刺激後13時間で、成熟した卵母細胞の数が最大のPG刺激後わずか20時間で達成されたeIF4G1-DNを除くすべての条件のために最大に達したことも注目に値します。したがって、eIF4G1-DN変異の存在はeIF4G1-WTに比べて劣った卵母細胞の減数分裂の放出を導きます。
eIF4G1-WT（ 図2D）にeIF4G1-DNのおかげの存在下での卵成熟の復元：
_contentは "> eIF4G1-DNのcRNAのマイクロインジェクション損なうまたはブロック卵成熟、eIF4G1-WT及びeIF4G1-DNのcRNAの異なる比率は、マイクロインジェクション共同されているかどうかを判断するには。これらの条件では、卵母細胞の成熟の増加は、レベルとして観測されますeIF4G1-WT cRNAを上げるとeIF4G1-DNのcRNA decrease.While成熟のものはeIF4G1-DNのcRNAを1用量で卵母細胞の17.5％で観察され、この割合はeIF4G1-WTのcRNAの3用量の同時マイクロインジェクションで76.7パーセントに達し、 eIF4G1-WTのcRNAの1用量の存在は、卵成熟の95％につながる。この実験は、eIF4G1-DNに微量注入したアフリカツメガエル卵母細胞の成熟欠陥が不可逆的ではなく、部分的に回復できることを示しています。PG刺激前後の翻訳能力（ 図2E）の指標としてWBに観察シグナル伝達タンパク質MOS発現：
eIF4G1-WTとのeIF4Gを表現する卵母細胞におけるV5タグのタンパク質レベル1-DN同様のマイクロインジェクション効率を反映して似ています。タンパク質負荷対照として用いRskがタンパク質のレベルは、PG刺激の前および後に、すべての条件においても同様です。 GFPタンパク質の発現は、GFP cRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞にも存在するPGで刺激か。これらのデータは、マイクロインジェクションとeF4G1の過剰発現は、GFPの翻訳を乱すていないことを示しています。しかし、GFPタンパク質の発現は、eIF4G1-DNを発現する卵母細胞におけるPG刺激の前および後に検出されません。予想されるように、内因性MOS式はPG刺激の不在下で検出可能です。また、MOS式がeIF4G1-WTの過剰発現は、内因性のMOS 16にはほとんど影響を持っていることを示す以前の結果と一致したPG刺激後eIF4G1-WT および H 2 O制御条件で観察されます。逆に、MOS表現のかなりの減少は、PG刺激後に顕著です。
プロシグナル伝達カスケードMOSのいくつかのコンポーネントのテイン発現はまた、テストされています。例えば、オーロラA / Eg2のタンパク質が誘導し、そのタンパク質の規制緩和やPG刺激が観察された後に誘導され、そのリン酸化形態の無検出をMOS上流作用しています。逆に、MOSによって誘導されるERK2リン酸化の調節解除は、eIF4G1-DNの存在下で観察されます。
これらの結果は、タンパク質とMOS依存ERK2の活性化にMOS RNAの内因性発現がeIF4G1-DNの発現によって影響されることが示唆されました。
mRNAのポリアデニル化（ 図2F）：
アフリカツメガエルのために必要ないくつかのmRNA（MOS、サイクリンA1、サイクリンB1とヒストン様B4）のポリアデニル化は、減数分裂の回復が試験された卵母細胞。実施されるアッセイは、mRNAのポリ（A）テールの長さに対応するアンプライマーのサイズの増加は、PGの刺激後に存在するかどうかを定義することが可能となります。実際、PとG刺激は、ポリ（A）尾部の付加は、eIF4G1-DN変異を含む、すべての条件で観察されます。
図1. MAPKカスケードの活性化の概略図。ホルモン刺激されると、いくつかの酵素の活動にPG急激な変化によっては、オーロラA / Eg2のとCPEB経路のものも含めて発生します。オーロラA / Eg2のの過リンは、リン酸化（細胞質ポリアデニル化要素結合タンパク質）CPEBにつながります。リン酸化CPEBは、MOS mRNAの3'UTRのCPE（細胞質ポリアデニル化要素）を認識しCPSF（切断およびポリアデニル化特異性因子）を募集し、PAP（ポリ（A）ポリメラーゼ）により、mRNAのポリアデニル化を活性化させます。 PG刺激もPKAおよびCDK1、マスキン/ eIF4Eの解離とのeIF4E / eIF4G1協会の両方の作用を介して連続的にマスキンのリン酸化を促進します。 eIF4G1は、トランスを募集eIF4G1と相互作用し、ポリ（A）テールを認識PABP含むレーション開始パートナー。一度モスはターンで、リン酸化によってERK2 / MAPKを活性化し、リン酸化によって、MEK / MAPKKを起動し、合成しました。このいわゆるMAPKカスケードは、M相エントリ運動スピンドル形態形成およびDNA合成の阻害を制御することにより、減数分裂過程に関与しています。カスケードは、タンパク質合成を維持正のフィードバックループに埋め込まれます。一つは、それがMOS注意しなければならないGVBDの活性化のために合成することが要求された唯一のタンパク質ではない、すなわち、サイクリンBは成熟達成のために翻訳する必要があります。
図2.ザ・eIF4G1-DN変異体は、 アフリカツメガエル卵母細胞の成熟と翻訳に影響を与えます 。 V5タグ付きeIF4G1タンパク質をコードするプラスミド由来のRNA（WTとDN）されていますアフリカツメガエルの卵母細胞に微量注入。 15時間後、卵母細胞の成熟を 、（実験は少なくとも3回実施し、代表的な結果が示されている）、プロゲステロン（PG）によって刺激される。実験プロトコルの（A）Schematicoverview。 eIF4G1および/またはGFPのcRNAの注射は、PG刺激の前に矢印の頭で表されます。 RNAとタンパク質の分析のためのサンプルは、2の時点で（PG刺激とGVBDの運動の終わりに）得られた。GVBDによって特徴づけられる10卵母細胞の（B）キネティック成熟がPG刺激後24時間の間にテストされます。卵成熟の遅れはeIF4G1-WTのcRNAをマイクロインジェクションしたものに比べeIF4G1-DNのcRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞で観察された（C）PG刺激後の成熟卵母細胞の割合で24時間（N = 4; * P <0.05）。卵成熟の減少はeIF4G1-WTのcRNAに比べeIF4G1-DNのcRNAをマイクロインジェクションしたもので観察される。（D）ReversioeIF4G1-WTは変異体に追加されたときに翻訳機構がまだ機能していることを示すeIF4G1-DN変異体のcRNAとeIF4G1-WTのcRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞のn個の表現型の評価。（E）タンパク質は卵母細胞から抽出し、それらのレベルは、イムノブロット分析により決定されます。観察されるeIF4G1-DN条件のERK2のリン酸化、MOSおよびGFP発現の摂動。（F）モスのポリアデニル化は、サイクリンA1、卵母細胞からのサイクリンB1とヒストン様B4 mRNAは、PCR増幅および移行の後に観察され、PGで刺激か3％のアガロースゲル。 PG刺激後、サイズの増加が> 100ポリアデニル化は、すべての条件のために検出されます。最初のレーンはラダーに対応しています。
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Discussion
翻訳は、いくつかの神経変性疾患を含む多数のヒトの疾患の生理病理学に関与する機構です。パーキンソン病における例えばいくつかの報告は、遺伝性突然変異8,12,13に関連付けられている訳で障害を示唆しました。
いくつかの細胞モデルは、翻訳を勉強するために利用可能です。ここでは、eIF4G1とeIF4Eのパートナー8との間の相互作用を減少させるなどのドミナントネガティブ変異を働きeIF4G1における突然変異の翻訳結果を研究するために、 アフリカツメガエル卵母細胞が使用されているアフリカツメガエル 。それは、生化学的実験のための材料のかなりの量をもたらし、卵成熟の異なる段階の肉眼観察を容易にする、合成mRNAの微量注入を容易にするただ1つの巨細胞から構成されているので、このモデルは、単純化の利点を有します。このプロセスは、安定した細胞と比較しても、時間効率的ですラインの生成。また、卵母細胞の準備とRNAマイクロインジェクションのいくつかのプロトコルは既に細胞周期または核-細胞質間輸送14,15を研究するため 、特に記載されています。翻訳を勉強するようなプロトコルの制限については、特に注意は、mRNAの濃度については注意が必要です。この濃度は、翻訳プロセスを飽和させないために高い（120 NL最大でより高くない30 NG）にあってはなりません。 EIF4G1転写産物の変異型と、図2に示すデータによって証明として口座にこの要素を考えると、 アフリカツメガエル卵母細胞は、タンパク質の翻訳を研究するための魅力的なモデルです。
実際に、変異したeIF4G1の存在下で、MOS型タンパク質の翻訳における障害が観察され、WTの条件をコントロールと比較GVBDの90％の減少と相関しました。逆に、eIF4G1-WTの過剰発現は、レベルOに変更をもたらさありませんでした文献データ16,17と一致してF MOS翻訳。
いくつかの生物学的な修正は、これらの結果を説明するかもしれません。それはmRNAが母体起源のものであり、すでにPGにより減数分裂の活性化の前に転写さMOS知って、摂動メカニズムは、転写および翻訳のステップの間で発生する必要があります。注目すべきは、モスの翻訳は、その翻訳18,19にPG刺激後の尾部のほかに、ポリ（A）テールなし潜伏mRNAから開始分子事象のカスケードの結果です。このように、いくつかのシナリオは、以下を含むことが可能です。それだけで、翻訳開始の欠陥、この障害の原因として疑われるかもしれない、またはMOS mRNAのポリアデニル化につながる要因のリン酸化の欠陥、またはMOS転写物のmRNAのポリアデニル化のデフォルトは、につながる可能性翻訳減少。
これらの最後の2つのメカニズムを評価するために、WBによってこれらの因子の発現を調べます。エクスプレスCPEBリン酸化の原因でリン酸化オーロラA / Eg2のイオンのレベルは、変異したeIF4G1の存在下での乱れを示さありませんでした。同じ静脈では、mRNAのポリアデニル化、または他のmRNAのポリアデニル化MOSトランジスタPG刺激（ 図2F）後の突然変異しeIF4G1の存在下で観察されます。さらにポリアデニル化プロファイルを確認するためのノーザンブロット実験を推奨だけでなく、リボソームへのmRNAの募集は、16を生じることができるかどうかを確立するために、ポリソームのショ糖勾配分離を行うことになります。
だから、カスケードの最初と最後の要素を研究することによって、摂動ステージはポリアデニル化の発生の下流であることが疑われました。これは、MOS発現欠陥がERK2のリン酸化に予想される影響を与えたかどうかをテストすることも重要です。突然変異の存在下では、MOS表現の減少は、リン酸化ERK2レベルの減少をもたらし、その結果としての欠陥へGVBDの進行（ 図1および図2E）。したがって、eIF4G1変異は、MOS翻訳の予想減少に関連しています。以前eIF4F複合体形成を乱す可能性が共免疫沈降の研究8により示唆されるようにeiF4G1-DNでeIF4G1シーケンス内のeIF4E結合ドメインの欠失は、おそらくeIF4G1 / eIF4Eの相互作用の減少の責任があります。
このプロトコルは、細胞生物学におけるいくつかの興味深い用途を有します。より良い開始因子の特定のドメインの役割を理解し、in vivoでの翻訳や卵成熟に不可欠であるものを定義するには：このセットアップは、以下のような細胞生物学の基本的な質問の数のための予備調査として理想的です。この文脈において、Wakiyama ら 。 （2000）のeIF4EとPABP 17に対する結合ドメインを含むeIF4G1のアミノ末端領域の卵母細胞の成熟に重要であることを示しました。 splicを勉強します開始のINGは、20因子;キャップ非依存的に翻訳21そのmRNAのキャップ依存性翻訳およびIRES構造の阻害とインスタンスのeIF4G1切断を経由してその目的のために宿主翻訳機構を乗っ取るウイルスによって使用されるメカニズムを解読します。卵母細胞は、このような研究の22のために選択されるモデルであるので、細胞周期における翻訳因子における突然変異の役割を研究します。 1つまたはいくつかのシステムは、タンパク質合成の妨害に関与しているかどうかを定義するために変換、すなわち、キャップ依存性およびキャップ非依存性の開始を支配する主なメカニズムを研究します。現在のプロトコルのいくつかのバリエーションが簡単に日没method23またはレポーターmRNAのマイクロインジェクションによって、翻訳効率の決意を含め、これらの目的に到達するために適用することができます。例えば、二シストロン性レポーターmRNAの使用は、 ウミシイタケルシフェラーゼは、キャップ依存性翻訳されている第1シストロンを含みますホタルルシフェラーゼを含む第二のシストロンは、IRES構造を経由して変換されるのに対し、翻訳の恒常性を維持するために、前方微小欠陥および/ または補償を入れて開始モードを定義するために有効にする必要があります。また、このようなルシフェラーゼレポーターRNA実験は、ヒトでの不完全な保全メカニズムに起因する潜在的な破砕特殊な発達のメカニズムに依存しないために利点を提供します。
これらの基本的な質問に平行に、そのようなプロトコルは、神経障害に寄与し得る有害な条件に対処するための最初のステップとして適用することができます。生理学的条件下で、翻訳開始工程は、酸化、低酸素状態、温度変化、照射および栄養欠乏などのストレス条件下での規則の特権的な標的です。このような条件では、転写物の選択的な変換は、ストレスに対する不可欠であり、細胞の生存が生じるタンパク質をコードします。このプロセスは圧倒された場合、応力が病理学的になり、積極的にいくつかの神経学的な愛情の開発に参加。細胞ストレッサーは、アルツハイマー病やパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症またはプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ）24と、これらのストレスは、小胞体ストレス応答（UPR）の活性化を誘導するような多数の神経変性疾患に関与しています。これらのUPRメカニズムの一つは、PERKの活性化を介して減少翻訳と25を複合体eIF4Fと43Sとの間の結合を防止することにより、翻訳を停止させる結果とeIF2αサブユニットのリン酸化につながります。 アフリカツメガエル卵母細胞では、酸化剤および/ またはそのような病態に関連することが知られている突然変異遺伝子の添加は、これらのストレスを模倣し、変異した遺伝子は、翻訳プロセスに影響を与えることができるかどうかを確立します。例えば、パーキンソン病、 がxenopでeIF4G1 p.R1205Hの導入で私たちは、卵母細胞関連またはストレス因子または生理病理学26における翻訳の関与の問題に取り組むことができたmRNAポリソームプロフィールのゲノムワイド解析を酸化的するものではありません。
卵母細胞に適用されるすべてのこれらのアプリケーションは、このようになりました、神経変性疾患を含むいくつかの愛情に関連することが知られている翻訳障害を研究する可能性の大きなフィールドを表しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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