Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Abstract

La synthèse des protéines est un processus fondamental de l'expression du gène impact divers processus biologiques, notamment d'adaptation à des conditions environnementales. L'étape d'initiation, qui implique l'ensemble des sous-unités ribosomiques à l'ARNm codon d'initiation, facteur d'initiation impliqués y compris eIF4G1. Les défauts de ce taux étape limitante de la traduction sont liées à divers troubles. Pour étudier les conséquences potentielles de ces dérégulations, Xenopus laevis ovocytes constituent un modèle attractif avec des degrés élevés de conservation des mécanismes cellulaires et moléculaires essentiels avec l'homme. En outre, au cours de la maturation de la méiose, les ovocytes sont transcriptionnellement réprimés et toutes les protéines nécessaires sont traduits à partir préexistantes, ARNm maternels. Ce modèle peu coûteux permet ARNm exogène pour devenir parfaitement intégrés avec une traduction efficace. Ici, on décrit un protocole pour l'évaluation de la traduction avec un facteur d'intérêt (ici eIF4G1) en utilisant stored ARNm maternel qui sont les premiers à être polyadénylé et traduits au cours de la maturation ovocytaire comme une lecture physiologique. Dans un premier temps, l'ARNm synthétisé par transcription in vitro de plasmides d'intérêt (ici eIF4G1) sont injectés dans des ovocytes et la cinétique de maturation de l'ovocyte par la détection de panne Germinal vésicule est déterminé. La cible de l'ARNm maternelle étudié est la sérine / thréonine mos-protéine-kinase. Son polyadénylation et sa traduction subséquente sont étudiées conjointement avec l'expression et la phosphorylation de protéines des mos cascade impliqué dans la maturation des ovocytes de signalisation. Variations de l'actuel protocole à mettre en avant les défauts de traduction sont également proposées pour souligner son applicabilité générale. À la lumière de la preuve que la synthèse protéique aberrante peut être impliquée dans la pathogenèse de troubles neurologiques émergents, un tel modèle offre la possibilité d'évaluer facilement l'dépréciation et d'identifier de nouvelles cibles.

Introduction

Les protéines sont des éléments essentiels de la vie cellulaire et donc à plus grande échelle de l'organisme. Ils assurent la majorité des fonctions cellulaires, y compris la structure, le transport, la réaction de catalyse, la réglementation, l'expression des gènes, etc. Leur expression est le résultat d'un mécanisme complexe de traduction permettant la conversion d'un ARNm en protéine. La traduction est soumise à divers contrôles d'adapter et de réguler l'expression des gènes en fonction des besoins de la cellule, au cours de la différenciation et le développement, le vieillissement, les stress physiologiques ou manifestations pathologiques.

La traduction est divisé en 3 phases (initiation, l'élongation et la terminaison) et présente 3 systèmes de traduction d'initiation afin de répondre à ces besoins: cap-dépendante, coiffe-indépendante par l'intermédiaire interne des ribosomes Entrée Segment (IRES) structures et les exhausteurs de traduction cap-indépendante ( CITE).

La plupart des ARNm eucaryotes sont convertis dans un bouchon-dependent manière par la 7-méthylguanosine capuchon 5'-triphosphate qui sert de caractéristique de reconnaissance pendant la synthèse de la protéine. Ce bouchon se lie à eIF4E, un composant du complexe eIF4F avec eIF4G1 et eIF4A. Associé à d'autres partenaires tels que le poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-ARNt ^Met, ces facteurs d'initiation de traduction permettent de circulariser l'ARNm et améliorer son accessibilité à des formes complexes 43S jusqu'à ce que le codon d'initiation AUG reconnaissance ^1. Cet événement correspond à la fin de l'à-dire d'initiation de traduction, la première étape de la traduction.

Traduction cap-indépendante est utilisée par les ARNm codant pour les protéines essentielles de conditions de stress qui provoquent la prolifération cellulaire et de l'apoptose de l'instance. Ce mécanisme comporte des structures secondaires dans l'ARNm 5 'non traduite (UTR) appelé IRES, l'extrémité carboxy-terminale de eIF4G1 associé à eIF4A et le complexe 43S. La liaison de ce 43S pré-initiation complex à IRES initie la traduction indépendante de cap sans la nécessité pour le facteur eIF4E ^2,3.

Enfin, un autre mécanisme de translation pas encore bien compris soutient cette activité de traduction coiffe-indépendante dans des conditions stressées, par la CITE structures situées dans l'ARNm UTR ^4.

Grâce à ces différents modes de traduction différant par leurs étapes d'initiation, la traduction joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire et tout changement dans l'un de ces processus serait donc un impact sur l'organisme auprès des petites et grandes effets d'échelle. En effet, l'initiation est une étape limitante taux régissant les processus de traduction correcte de l'ARNm en protéines et est donc la cible de nombreux contrôles et des points ⁵ de régulation. Que ce soit pour ce dernier ou des composants de ces processus, si l'on se révèle être défectueux, il sera perturber l'équilibre établi dans la cellule et donc pourrait conduire à Condi pathologiquetions. Dans ce contexte, les mutations dans les facteurs de conversion ont été impliqués dans plusieurs maladies dont les maladies neurodégénératives telles que `leucoencéphalopathie avec fuite matter' blanc (eIF2B1-5 de sous-unité) ^6, dans le syndrome de Walcott-Rallison (EIF2AK3 gène codant pour PERK) ^7, éventuellement en maladie (eIF4G1 la p.R1205H) de Parkinson ^8. Il est donc important de mener des études cellulaires et moléculaires de ces protéines mutantes d'accroître nos connaissances sur le développement de la maladie et sur le processus général d'initiation de la traduction.

Pour mener à bien ces études, il est essentiel de choisir les modèles les plus adéquats pour observer les conséquences de ces mutations ovocytes de Xenopus laevis sont particulièrement bien adaptés en raison de leurs propriétés physiologiques et biochimiques:. Synchronicité physiologique (bloqué en phase G2 du cycle cellulaire) , grande capacité de synthèse des protéines (200-400 ng / jour / ovocyte), nombre élevé de ooc extraitytes à partir d'un même animal (800-1000 ovocytes / femme) et la taille des cellules (1,2-1,4 mm de diamètre), qui facilite leur manipulation. Microinjection d'ovocytes de Xenopus avec synthétisé ARNm peut facilement être effectuée à disséquer étapes de traduction. Dans cette vue, il présente d'autres avantages. Compte tenu de la vitesse de progression de la méiose et de la traduction de l'ARNm après la micro-injection (~ 24 h), des ovocytes de Xenopus représente un système rapide par rapport aux systèmes reconstitués cellulaires de E. coli (extrait de germes de blé, ou de reticulocytes de lapin ...) dans laquelle est un ARNm traduit par un taux de conversion réduit et à une vitesse inférieure. Ainsi, les effets d'une mutation introduite dans un ARNm seront rapidement et facilement observable étudié dans plusieurs ovocytes. Un autre avantage d'ovocytes de Xenopus est que les ARNm maternels sont latente et la traduction des protéines est bloqué avant la stimulation de la progestérone. L'addition de la progestérone est donc un bon moyen de commande de l'induction de la traduction. P cytoplasmiqueolyadenylation ne se produit pas lors de l'ovogenèse. Il commence au cours de la maturation ovocytaire dans des ovocytes de progestérone stimulée dans un ordre temporel et se poursuit durant le développement précoce et pourrait être utilisé pour étudier les différentes étapes de la traduction.

La polyadénylation du mos ARNm est parmi les premiers à se produire et il appartient à Aurora A / Eg2, Histone-Like B4 ARNm à la classe des gènes «maturation précoce» au sens de Charlesworth et al. (2004) ^9. L'induction de la traduction de l'ARNm "tardives" tels que la cycline A1 et B1 cycline se produit autour du moment de la rupture de la vésicule germinale (GVBD). Mos ARNm code pour une sérine / thréonine protéine-kinase. Sa traduction est cruciale car elle induit la cascade de kinase MAP qui active indirectement la maturation de l'ovocyte. En effet, en réponse à la progestérone, la polyadénylation de l'ARNm mos est renforcée par un processus impliquant Aurora A / Eg2 protéines régulatrices et d'autres protéines de liaison d'ARN avec ee 3'UTR de l'ARNm mos. Cette augmentation de polyadénylation de l'ARNm mos conduit à une augmentation du niveau de protéine de mos, qui à son tour active MEK1. Ce processus médie l'activation de la kinase extracellulaire régulée de signalisation 2 (ERK2) (Figure 1). Cette cascade de signalisation peut alors déclencher la maturation phase M facteurs favorisant, un complexe formé par la cycline B kinase Cdc2 et, et, éventuellement, conduit à la reprise de la méiose.

Par conséquent, dans ovocytes de Xenopus laevis, l'étude de l'ARNm maternels tels que mos pourrait facilement être utilisé pour tester leur traductibilité avec plusieurs paramètres de leur polyadénylation efficace à la traduction de plusieurs composants MOS de signalisation, y compris également la détermination du taux GVBD. Ce système est donc intéressant d'évaluer les premières conséquences de mutations dans les facteurs d'initiation de traduction, sans ingérence de nouveaux ARNm transcrit ou de l'efficacité de transfection, les problèmes surviennent souvent avec eukaryétudes sur les cellules auriculaires.

Ici, un protocole est établi lorsque ARNm eIF4G1 mutantes sont micro-injectés dans des ovocytes de Xenopus laevis et la traduction de l'ARNm maternelle est testé. En présence d'un défaut de progression GVBD, mos ARNm polyadénylation qui est essentiel pour la progression à travers le cycle cellulaire méiotique des ovocytes et pour la traduction ultérieure des ARNm de classe précoces et tardifs est constatée. La phosphorylation Aurora A / Eg2 et ERK est également étudié pour confirmer la conséquence de mos deregulation.Thus, des ovocytes de Xenopus représentent un moyen simple d'analyser les différentes étapes de traduction de l'ARNm.

Protocol

Toutes les expériences de Xenopus ont été effectuées à l'animalerie de l'Université Lille 1 selon les règles des directives du Conseil de la Communauté européenne (86/609 / CEE) pour l'expérimentation des animaux de laboratoire. Le protocole de l'animal a été approuvé par la commission d'examen institutionnel local (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).

1. Manipulation d'ovocytes

1. Préparer la solution anesthésique: dissoudre 1 g de méthane sulfonate de tricaïne poudre dans un 1 L d'eau stérile.
2. Plunge femme Xenopus laevis dans cette solution, couvrir le bécher pour éviter l'évasion et attendre environ 45 minutes pour que l'animal soit complètement sous sédation (sans aucune réaction à une pincée de la jambe).
3. Laver la grenouille avec du savon et rincer avec de l'eau du robinet puis placez l'animal sur son dos sur une feuille d'aluminium propre.
4. Serrez la peau de la partie latérale de l'abdomen et au niveau des ovaires avec des pinces.Faire une incision d'environ 1 cm avec des ciseaux nettoyés avant utilisation avec de l'éthanol 70%. Assurez-vous que la section est assez profond et d'atteindre la paroi abdominale sous-jacente pour permettre l'excision du tissu ovarien dans laquelle se trouvent plusieurs ovocytes à différents stades de développement.
5. On dissèque les lobes ovaire, les laver 4 fois dans une boîte de Petri (50 mm) avec du milieu ND96 (mM NaCl 96, 2 mM de KCl, 1 _mM de MgCl2, 1,8 _mM de CaCl2, 5 mM de HEPES ajusté à pH 7,4 avec NaOH, complétée avec 50 pg / ml de streptomycine / pénicilline, 225 ug / ml de pyruvate de sodium, 30 ug / ml d'inhibiteur de trypsine de soja, 1 pl / ml de tetracycline) pour éliminer toute trace de sang et de débris.
   Remarque: la tétracycline permet une conservation optimale et une bonne récupération après le traitement de micro-injection.
6. Rangez-les dans une boîte de Petri couverte immergée dans le milieu à 14 ° C, ce qui permet leur conservation pendant une semaine.
7. Piquer la paroi abdominale et la peau avec vétérinaire absorbable tHLit et une aiguille de suture (3 ou 4 points seront nécessaires).
8. Placez l'animal dans un bécher sans eau et plus humide de la peau avec de l'eau du robinet jusqu'à ce que la grenouille se déplace à nouveau. Couvrir le bécher pour empêcher la fuite.
9. Séparer les lobes d'ovaire soigneusement dans le milieu en groupes de 5 à 10 en utilisant des ovocytes de 2 paires de pinces sous un stéréomicroscope avec un grossissement de 10 fois. Sélectionnez ovocytes au stade VI. Ils peuvent être reconnus par i) leur forme et leur couleur avec un pôle animal pigmenté brun et jaune pôle végétatif séparés par une bande claire ii) leur taille supérieure à 1,2 mm de diamètre ^10.
10. Incuber les ovocytes sélectionnés dans une solution de collagénase (1 mg / ml de collagénase A de Clostridium histolyticum, dissous dans ND96 sans tetracycline) dans une boîte de Pétri sous agitation douce pendant 45 min à faciliter la defolliculation de l'ovocyte (collagénase digère les connexions des cellules folliculaires des ovocytes /). Rincer le ovocytes 3 ou 4 fois avec du milieu ND96 maintenus à 14° C.
    Note: Ne pas incuber les ovocytes moins ou plus de 45 min en raison du risque de détruire les protéines de surface de l'ovocyte et de provoquer faible viabilité. Traitement à la collagénase peut induire GVBD spontanée.
11. Incuber ovocytes dans le milieu pendant 3-4 heures. Éliminer les cellules folliculaires avec pinces fines sous loupe binoculaire et gardez-les à 19 ° C dans un milieu ND96.

2. Préparation de l'ARNm de synthèse

1. Linéariser 5 ug des plasmides suivants par digestion enzymatique à l'aide Pme I enzyme.
   REMARQUE: pcDNA6.2 / V5-DEST contenant un amino-acides eIF4G1 ADNc de type sauvage 1599 (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST contenant un ADNc dominant négatif eIF4G1 (eIF4G1-DN) avec des mutations c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - et c.2126T> G dans la région d'interaction entre eIF4E eIF4G1 et à la position 612 à 618 de la protéine correspondante perturber le interaction between eIF4G1 et eIF4E ^8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contenant chloramphénicol acétyl-transférase (GFP). Préparer les mélanges 2 pour chacune des 3 plasmides: la première comprenant Pme I enzyme et la seconde enzyme comme sans contrôle.
2. Précipiter l'ADN plasmidique en utilisant un mode opératoire classique à l'éthanol et remise en suspension dans 20 ul de nuclease-free H _{2 O.}
3. Déterminer sa concentration à l'aide d'un spectrophotomètre. La concentration doit être supérieure à 150 ng / pl pour transcrire l'ARNc.
4. Run 1 pi d'échantillons et leurs commandes avec 5 pl de tampon de charge sur un gel d'agarose à 0,8% afin de vérifier la linéarisation du plasmide.
5. Utilisation d'un kit de transcription in vitro et la purification d'ARNc selon les instructions du fabricant. Les ARNc transcrits sont remises en suspension dans 20 pi de sans nucléase H ₂ O. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C si nécessaire.
6. Préparer le tampon de migration MOPS 10X contenant 0,2 M de MOPS (pH 7,0), 20 mL'acétate de sodium M et EDTA 10 mM (pH 8,0). Stériliser la solution avec un filtre de 0,45 um. Garnissez la solution à l'abri de la lumière à température ambiante pour éviter l'oxydation de la solution.
7. Nettoyer le réservoir d'électrophorèse successivement avec NaOH, HCl et rincer abondamment avec de l'eau filtrée double pour un O / N pour éviter RNase et prévenir la dégradation de l'ARN.
8. Monter un gel d'agarose à 1,5% contenant du formaldehyde et MOPS. Chaud jusqu'à ce que la dissolution de l'agarose complète et laissez-le refroidir à 55 ° C. Sous une hotte, ajouter 0,1 volume de MOPS 10X, 6,6% de formaldéhyde et 4 pg de bromure d'éthidium (10 mg / ml). Verser le gel sous la hotte et attendre environ 1 h pour le gel de durcir.
   Remarque: le formaldéhyde et le bromure d'éthidium sont toxiques.
9. Préparer les échantillons pour la migration dans un tube de 0,2 ml avec 1 pi d'ARNc, 8,8% de formaldéhyde, 60% de formamide et 0,1 volume de MOPS 10X. Incuber pendant 3 min à 70 ° C et de mettre les tubes sur de la glace pendant 10 min. Centrifuger les échantillons quelques secondes à5000 x g. Ajouter 2 ul de tampon de chargement de gel.
   Remarque: Le formamide est toxique.
10. Exécutez échantillons pendant 20 min à 90V. Faire tremper le gel dans exempte de nucléase H _{2 OO} / N pour décolorer le gel avant de l'analyser pour vérifier la qualité ARNc.
11. Déterminer la concentration ARNc aide d'un spectrophotomètre et les stocker à -80 ° C.

3. microinjection d'ovocytes synthétisé l'ARN et de maturation Stimulation

1. Préparer le matériel nécessaire pour les ovocytes microinjection. Utilisez un extracteur micropipette à tirer petite capillaire en verre. Sous stéréoscopique, rompre l'extrémité du capillaire avec la pince à épiler pour créer une extrémité franche. Remplir la micropipette capillaire avec l'huile minérale en utilisant une seringue de 1 ml avec un filtre Millipore de 0,45 um à l'extrémité opposée. Montez la micropipette sur la pipette de micro-injection. Choisissez une micropipette précise calibré par le fabricant pour donner une bonne précision lorsqu'il est utilisé avec capillaire en verre approprié.
2. Effectuer microinjection 1-2 heures après defolliculation, délai nécessaire pour la récupération d'ovocytes sur les ovocytes maintenue à 14 ° C. Utilisez des plats de Pétri avec le fond grattées avec une pince pour créer une surface adhésive pour les ovocytes et les remplir avec du milieu ND96.
3. Disposer ovocytes long d'une voie raclée dans une boîte de Petri permettant une injection successive des ovocytes avec la micropipette capillaire à un angle de 45 ° C.
4. Injecter dans la zone équatoriale de l'ovocyte, sous la zone de l'animal pigmenté pour une diffusion optimale d'échantillons dans le cytoplasme. Insérez seulement la partie la plus mince de la pointe capillaire sur environ 150-200 um de profondeur.
5. Injecter 30 ng d'ARNc obtenues respectivement à partir des plasmides différents dans un volume de 60 nl dans un premier ovocyte. Après l'injection, attendez 5-10 secondes avant de retirer la pointe capillaire pour éviter évasion échantillon (figure 2A).
   Note: Ne pas dépasser 120 nl. Injecter aussi lentement que vous le pouvez. Un contrôle à l'eau distillée est recommandé.
6. Déplacer manuellement la boîte de Pétri pour injecter la prochaine ovocyte.
   Remarque: Assurez-vous que la pointe ne soit pas bouché en générant une petite impulsion sur la solution de bain après 2 à 3 micro-injections.
7. Transfert injecté ovocytes dans 24 puits des plaques de culture (10 ovocytes / bien) rempli avec 3 ml de milieu ND96 fraîche et laissez-les à 19 ° C.
8. Incuber les ovocytes dans ND96 avec de la progestérone (PG) (2 ug / ml) pour déclencher la maturation méiotique (GVBD) à 19 ° C, 15 heures ou 4 heures après la micro-injection d'ARNc polyadénylés obtenus respectivement à partir pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 et pcDNA6 0,2 / C-EmGFP utilisé comme contrôle (figure 2A).
   Remarque: Co-injection de marqueur fluorescent avec l'ARNc est un bel outil pour garantir que l'ARNc a été injecté et est resté dans l'ovocyte. Effectuez ces expériences préliminaires utilisant un ARNc d'intérêt avec une étiquette de la GFP.
9. Micro-injection comme dans # 3.5 différents rapports (1: 3, 2: 2, 3: 1) de polyadénylé eIF4G1-WT et eIF4G1-DN ARNc afin de TEST Le effet de conversion des ARNc eIF4G1-WT sur le phénotype mutant (figure 2D).

4. Répartition des vésicules Germinal Détermination

1. Comptez le nombre d'ovocytes matures après PG stimulation par l'observation de la présence d'une tache blanche au pôle animal noir avec une loupe binoculaire. Répétez le comptage toutes les heures jusqu'à la vingt-quatrième heure (figure 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Analyse

1. Homogénéiser le groupe de 10 ovocytes par allers et retours avec une pointe de micropipette, à 4 ° C dans 200 pi dans le tampon suivant: 50 mM Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% de SDS, 5 mM _MgCl2, 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin, 10 mg / ml de leupeptine, 10 mg / ml d'aprotinine, inhibiteur ml 10 mg / trypsine de soja, 10 mg / ml de benzamidine, 1 mM PMSF, vanadate de sodium 1 mM.
2. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 10 000 x g pour éliminer les lipides (phase supérieure) et la membrane (phase inférieure) fractions. Recueillir la fraction cytoplasmique, stocker une partie aliquote pour déterminer la concentration de protéine et compléter avec le restant Laemmli ou un tampon d'échantillon de Bis-Tris (1: 1).
   Remarque: gels Bis-Tris et le tampon de charge ont un pH plus neutre qui protège les protéines de l'hydrolyse
3. Chauffer 20 ug d'échantillon à 95 ° C pendant 10 min. Charger chaque échantillon dans les puits du gel d'acrylamide. Placer le gel dans un réservoir avec un tampon approprié.
4. Effectuer une électrophorèse pendant 1 h à 200 V.
5. Réaliser un WB dans du TBS à pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween à 0,1%, contenant 10% d'albumine de sérum bovin) avec un anticorps de chèvre anti-Aurora A / Eg2 (1: 3 000, 2 h), ou avec un anti-lapin -Aurora A / Eg2-P (1: 1 000, O / N à 4 ° C), de souris anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), de chèvre anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), de lapin anti-mos (1: 5000, 4 h), de lapin anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use anticorps de souris anti-V5 (1: 10.000, 2 h) et de lapin anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (comme contrôles de chargement).
6. lavagela membrane 3 fois pendant 10 min dans du TBS-Tween et on incube 1 heure avec soit un anticorps anti-souris ou anti-lapin ou anti-chèvre (IgM) d'anticorps secondaire peroxydase de raifort marquée à des dilutions de 1: 5000, 1: 7500 et 1 : 5000 respectivement.
7. Effectuez 3 lavages de 10 min dans du TBS-Tween et de détecter les complexes antigène-anticorps avec le système de détection avancée ECL.

6. Polyadénylation Assay

1. Echantillon 5 ovocytes par état dans un 1,5 ml. Lavez-les avec 1 ml de PBS sans nucléase 1X (pH 7,4). Les étapes suivantes seront effectuées sous une hotte.
2. Extraire l'ARN en utilisant une procédure organique classique (voir les instructions du fabricant).
3. Récupérer l'ARN par centrifugation (10 000 xg) pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et l'ARN sécher à l'air pendant 10 min.
4. ARN Resuspendre le culot dans 30 ul de sans nucléase H ₂ O.
5. Prenez 15 ul d'échantillons dans un nouveau tube et ajouter 85 ul de sans nucléase H ₂ O. Nettoyez leéchantillons soi pour améliorer leur qualité sur colonne de silice le selon les instructions du fabricant. Éluer l'ARN en utilisant 30 pi de sans nucléase H _{2 O}
6. Exécutez 1 pi d'échantillons avec 5 pi de tampon de charge sur un gel d'agarose à 0,8% pour vérifier l'intégrité de l'ARN.
7. Déterminer la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
8. Préparez 2 mélanges de ligation par la condition (c.-à-eIF4G1-WT, eIF4G1-DN et le H ₂ O témoin) avec les réactifs suivants: 10 U d'ARN ligase, 0,1 volume de tampon 10X, 1 mM d'ATP, 10% de PEG8000 à 50% , 0,1 ug de l'amorce P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') ¹¹ et amener le volume final à 10 pi avec sans nucléase H _{2 O.} Ajouter dans le premier ARN obtenu à partir d'ovocytes mélange PG sans stimulation et dans le deuxième ARN mélange obtenu à partir des ovocytes PG stimulée.
9. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C puis pendant 20 min à 65 ° C pour inactiver l'enzyme.
10. NousEA ADNc transcription inverse (RT) kit. Préparer le mélange RT, par tube: 0,1 volume de tampon 10X RT, 0,1 pg de l'amorce P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) ^10, mélange 4 mM dNTP, 50 U de transcriptase inverse et avec sans nucléase H _{2 O} au volume final de 10 ul. Ajouter 10 ul de la réaction de ligature obtenu précédemment. Effectuez la RT dans les conditions décrites par le fabricant.
11. Préparer la réaction en chaîne de la polymérase mélange (PCR), par tube: 0,1 volume de tampon 10X, 1,5 _mM de MgCl2, 133 mélange uM de dNTP, 0,2 uM de l'amorce spécifique, 0,2 uM de l'amorce P2, 0,025 U de Taq polymerase, 1 pi de l'ADNc et avec sans nucléase de H ₂ O à volume final de 50 ul. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, [95 ° C pendant 1 min, 56 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 s] * 40 cycles, 72 ° C ⁹ pendant 10 min. Les amorces spécifiques sont les suivants: G MOS,B4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cycline B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT ^9.
12. Préparation d'un gel d'agarose à 3%. Ajouter dans chaque produits de PCR 10 pi de tampon de charge. Exécuter le gel avec 10 pi d'échantillons à 110 V pour une migration optimale. Analyse du gel au bout de 10 et 20 min pour observer un changement de taille reflétant la longueur de la queue poly (A) et donc la maturation de l'ARN qui est une condition préalable à leur traduction.

Representative Results

Cinétique de maturation des ovocytes de Xenopus et la détermination du pourcentage d'ovocytes GVBD après 24 h de stimulation PG (figures 2B, 2C):

Afin d'étudier les conséquences de translation de la mutation eIF4G1-DN, la réponse de PG dans des ovocytes de Xenopus laevis micro-injectés avec l'ARNc-DN eIF4G1 est comparée à eIF4G1-WT et à d'autres conditions de commande (H ₂ O, GFP). Les contrôles permettent d'évaluer l'incidence des ovocytes micro-injection indépendamment de la nature ou de l'ARNc injecté eIF4G1 de surexpression.

Les cinétiques de maturations 10 ovocytes caractérisées par des conditions de contrôle de micro-injection (H ₂ O) et la GFP sont semblables à WT et le nombre de subir GVBD sont très proches l'une de l'autre à 12 et 24 h après la stimulation PG (figure 2B). Après 24 heures, la maturation des ovocytes atteint 95,7% pour le WT, 97,1% de H _{2 O et de} 97,5% pour la GFP (Fi figure 2C). Ainsi, les micro-injections avec H _{2 O} ou de contrôle ARNc ou ARNc eIF4G1 ont peu d'effet sur ​​la méiose de l'ovocyte de presse. Inversement 8 h après la stimulation PG, le nombre d'ovocytes microinjectés avec ARNc eIF4G1-DN subissant GVBD est retardée par rapport à eIF4G1-WT ARNc (figure 2B) .La sortie de la méiose eIF4G1-DN contre ovocytes eIF4G1-WT diminue significativement de 85,8% et 77,4% à 12 h et 24 h après la stimulation PG respectivement (figure 2C). Il est également intéressant de noter que 13 heures après la stimulation PG, le nombre d'ovocytes matures atteint un maximum dans toutes les conditions, sauf pour eIF4G1-DN pour lequel le maximum est atteint seulement 20 heures après la stimulation PG. Ainsi, la présence de eIF4G1-DN mutation conduit à la détérioration de la méiose ovocytaire libération par rapport à eIF4G1-WT.

Restauration de la maturation des ovocytes en présence d'eIF4G1-DN grâce à la eIF4G1-WT (figure 2D):

_content "> Pour déterminer si les compromet eIF4G1-DN ARNc microinjection ou bloque la maturation des ovocytes, des rapports différents de ARNc eIF4G1-WT et eIF4G1-DN sont co-microinjectés. Dans ces conditions, on observe une augmentation de la maturation de l'ovocyte que les niveaux de eIF4G1-WT ARNc soulever et ceux de l'ARNc-DN eIF4G1 decrease.While maturation est observée chez 17,5% des ovocytes avec une dose d'ARNc eIF4G1-DN, ce pourcentage atteint 76,7% avec co-microinjection de 3 doses de eIF4G1-WT ARNc et la présence d'une dose de eIF4G1-WT ARNc conduit à 95% de la maturation des ovocytes. Cette expérience montre que le défaut de maturation des ovocytes de Xenopus par micro-injection eIF4G1-DN est irréversible et ne peut être partiellement rétablie.

Mos d'expression des protéines observées sur WB comme indicateur de la capacité de traduction avant et après stimulation PG (figure 2E) de signalisation:

Le niveau de protéine de marqueur V5 dans des ovocytes exprimant eIF4G1-WT et eIF4G1-DN sont similaires reflétant l'efficacité de la micro-injection similaire. Le niveau de protéine Rsk utilisé comme contrôle protéine de chargement est également similaire dans toutes les conditions avant et après stimulation PG. L'expression de la protéine GFP est également présent dans des ovocytes micro-injectés avec l'ARNc GFP ou non stimulé avec PG. Ces données indiquent que la micro-injection et la surexpression de eF4G1 ne perturbent pas la traduction de la GFP. Toutefois, aucune expression de la protéine GFP est détectable avant et après stimulation PG dans des ovocytes exprimant le eIF4G1-DN. Comme on s'y attendait, l'expression de non endogène est détectable en l'absence de stimulation PG. En outre, mos expression est observée dans le eIF4G1-WT _et H 2 O conditions de contrôle après PG stimulation en accord avec les résultats antérieurs montrant que la surexpression de eIF4G1-WT a peu de conséquences sur mos endogènes ^16. Inversement, une baisse considérable de mos expression est perceptible après PG stimulation.

Le proexpression protéine de certains composants de la cascade de signalisation MOS est également testée. Par exemple, Aurora A / protéines Eg2 agit en amont pour Mos induction et pas de détection de sa déréglementation de protéines ou de sa forme phosphorylée induite après stimulation PG est observée. A l'inverse, une dérégulation de la phosphorylation induite par ERK2 mos est observée en présence de eIF4G1-DN.

Ces résultats suggèrent que l'expression de l'ARN endogènes de MOS en protéine et l'activation de ERK2 dépend mos sont touchés par l'expression de eIF4G1-DN.

polyadénylation de l'ARNm (figure 2F):

Polyadénylation de plusieurs ARNm (MOS, la cycline A1, B1 et cycline Histone comme B4) nécessaires à la récupération des ovocytes de Xenopus méiose a été testé. Le dosage réalisé permet de définir si une augmentation de la taille de l'amplimère correspondant à la longueur de la queue poly (A) ARNm de PG est présent après la stimulation. En effet, avec PG stimulation addition d'un poly (A) de queue est observée dans toutes les conditions, y compris la mutation eIF4G1-DN.

Figure 1. Aperçu schématique de l'activation en cascade MAPK. Lors de la stimulation hormonale par PG changements rapides dans les activités de plusieurs enzymes se produire, incluant ceux de l'Aurora A / Eg2 et voie de CPEB. Hyperphosphorylation de Aurora A / Eg2 conduit à CPEB (cytoplasmique Polyadénylation Element Binding Protein) phosphorylation. CPEB phosphorylée reconnaît le CPE (de polyadénylation cytoplasmique Element) sur 3'UTR de l'ARNm mos, recrute FSP (clivage et de polyadénylation Facteur Spécificité) et active polyadénylation de l'ARNm par le PAP (poly (A) polymérase). PG stimulation favorise également successivement Maskin phosphorylation à la fois par l'action de la PKA et cdk1, Maskin / eIF4E dissociation et d'association eIF4E / eIF4G1. eIF4G1 recrute translation partenaires d'initiation compris PABP qui coopère avec eIF4G1 et reconnaît le poly (A) queue. Une fois synthétisés, mos active MEK / MAPKK par phosphorylation, qui à son tour, active ERK2 / MAPK par phosphorylation. Ce soi-disant cascade MAPK est impliqué dans les processus de la méiose en contrôlant l'entrée cinétique M-phase, la morphogenèse broche et l'inhibition de la synthèse de l'ADN. La cascade est incorporé dans une boucle de rétroaction positive qui soutient la synthèse des protéines. Il faut noter que MOS est pas la seule protéine demandé à être synthétisé pour l'activation GVBD;-à-dire, la cycline B doivent être traduits pour la réalisation de maturation.

Figure 2. Le eIF4G1-DN mutant affecte la maturation des ovocytes et la traduction dans Xenopus laevis. ARN dérivé de plasmides codant pour des protéines eIF4G1 V5 marqués (WT et DN) sontmicroinjecté en ovocytes de Xenopus laevis. Après 15 heures, la maturation d'ovocytes est stimulée par la progestérone (PG) (expériences ont été réalisées au moins 3 fois et les résultats représentatifs sont présentés). (A) Schematicoverview de protocole d'expérimentation. Les injections de eIF4G1 et / ou GFP ARNc sont représentés par des pointes de flèches avant PG stimulation. Les échantillons destinés à des analyses de protéines et d'ARN ont été obtenus à partir de 2 points temporels (PG de stimulation et à la fin de la cinétique GVBD). (B) Cinétique de la maturation des ovocytes 10, caractérisé par GVBD est testée pendant 24 h après stimulation PG. Un retard dans la maturation de l'ovocyte est observé dans des ovocytes micro-injectés avec eIF4G1-DN ARNc par rapport à ceux micro-injecté avec eIF4G1 ARNc-WT (C) Le pourcentage d'ovocytes matures 24 h après stimulation PG (n = 4; * p <0,05).. Une diminution de la maturation de l'ovocyte est observée dans ceux microinjecté avec eIF4G1-DN ARNc rapport à eIF4G1-WT ARNc. (D) Reversion évaluation phénotypique des ovocytes micro-injectés avec eIF4G1-DN ARNc mutantes et ARNc eIF4G1-WT montrant que la machinerie de traduction est toujours fonctionnel lorsque eIF4G1-WT est ajouté au mutant. (E) Les protéines sont extraites à partir d'ovocytes et leurs niveaux déterminés par immunotransfert analyse . Les perturbations de ERK2 phosphorylation, mos et l'expression de GFP dans les conditions eIF4G1-DN sont observés. (F) polyadénylation de mos, Cyclin A1, cycline ARNm B4 B1 et histone-like de oocytes stimulées ou non avec PG observé après amplification par PCR et la migration sur 3% de gel d'agarose. Après stimulation PG, une augmentation de taille> 100 polyadénylation est détectée pour toutes les conditions. La première voie correspondant à l'échelle.

Discussion

La traduction est un mécanisme impliqué dans la physiopathologie de nombreuses maladies humaines, y compris plusieurs maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie de Parkinson plusieurs rapports ont suggéré la déficience en translation associée à des mutations héréditaires ^8,12,13.

Plusieurs modèles cellulaires sont disponibles pour étudier la traduction. Ici, dans le but d'étudier les conséquences d'une mutation de la traduction en eIF4G1 qui agit mutation dominante négative réduire l'interaction entre les partenaires eIF4E eIF4G1 et ^8, l'ovocyte de Xenopus laevis est utilisé. Ce modèle présente l'avantage de la simplicité car il est composé d'une seule cellule géante faciliter la micro-injection d'ARNm synthétique, conduisant à une quantité considérable de matériau pour les expériences biochimiques et de faciliter les observations macroscopiques des différentes phases de la maturation des ovocytes. Ce processus est également efficace temps par rapport à la cellule stablegénération de ligne. En outre, plusieurs protocoles de préparation de l'ovocyte et d'ARN des micro-injections ont déjà été décrits, en particulier pour l'étude du cycle cellulaire ou de transport nucléocytoplasmique ^14,15. En ce qui concerne les limites de ces protocoles pour étudier la traduction, une attention particulière doit être prise quant à la concentration de l'ARNm. Cette concentration ne devrait pas être à la haute (pas plus de 30 ng à 120 maximale nl) afin de ne pas saturer le processus de traduction. Tenant compte de cet élément, Xenopus ovocyte est un modèle intéressant pour étudier la traduction des protéines comme l'attestent les données présentées dans la figure 2 avec une forme mutante de la transcription EIF4G1.

En effet, en présence de la eIF4G1 mutée, la déficience dans la traduction de protéine est observée mos et en corrélation avec une diminution de 90% de GVBD par rapport à WT et de contrôler les conditions. A l'inverse, la surexpression de eIF4G1-WT n'a pas entraîné de modification du niveau ola traduction de f en accord avec ^16,17 de données de la littérature.

Plusieurs modifications biologiques pourraient expliquer ces résultats. Sachant que mos ARNm sont d'origine maternelle et déjà transcrit avant l'activation de la méiose par PG, les mécanismes perturbés devraient se produire entre les étapes transcription et de traduction. Il convient de noter traduction, mos est le résultat d'une cascade d'événements moléculaires qui commencent à partir d'un ARNm latente sans poly (A) addition à la queue de la queue après stimulation PG de sa traduction ^18,19. Ainsi, plusieurs scénarios sont possibles, y compris: des défauts dans l'initiation de traduction pourraient être soupçonnés comme la cause de cet échec, ou des défauts de la phosphorylation du facteur conduisant à Mos polyadénylation de l'ARNm, ou défaut de polyadénylation de l'ARNm du MOS transcriptions par lui-même pourrait conduire à une diminution de translation.

Pour évaluer ces 2 derniers mécanismes, l'expression de ces facteurs par WB est examinée. Exprimerles niveaux d'ions phosphoryle Aurora A / Eg2, responsables de la phosphorylation de CPEB montré aucune perturbation en présence de la eIF4G1 muté. Dans la même veine, mos ARNm polyadénylation ou autre polyadénylation de l'ARNm est observée dans la présence de la eIF4G1 muté après PG stimulation (figure 2F). Pour confirmer davantage le profil de polyadénylation Des expériences de northern seraient recommandés ainsi que l'exécution de l'isolement gradient de saccharose de polysomes afin d'établir si le recrutement de l'ARNm au ribosome peut se produire ^16.

Ainsi, en étudiant les premier et dernier éléments de la cascade, la scène a été perturbé soupçonné d'être en aval de l'occurrence de polyadénylation. Il est également important de vérifier si le défaut mos d'expression a donné l'impact attendu sur la phosphorylation de ERK2. En présence de la mutation, la diminution de mos expression conduit à une diminution du niveau de ERK2 phosphorylée et par conséquent à un défaut dela progression GVBD (figure 1 et 2E). Ainsi, la mutation eIF4G1 est associé à un diminution attendue de la traduction de mos. La suppression du domaine de liaison eIF4E en séquence eIF4G1 dans le eiF4G1-DN est probablement responsable d'une diminution des interactions eIF4G1 / eIF4E comme suggéré précédemment par une étude co-immunoprécipitation ⁸ qui pourraient perturber la formation du complexe eIF4F.

Ce protocole a plusieurs applications intéressantes en biologie cellulaire. Cette configuration est idéale comme des enquêtes préliminaires pour un certain nombre de questions fondamentales en biologie cellulaire tels que: pour mieux comprendre le rôle des domaines spécifiques de facteurs d'initiation et de définir celles qui sont essentielles à la traduction in vivo ou maturation de l'ovocyte. Dans ce contexte, Wakiyama et al. (2000) ont montré l'importance de la maturation des ovocytes de la région amino-terminale de eIF4G1 contenant les domaines de liaison à eIF4E et PABP ^17; pour étudier splicING des facteurs d'initiation ^20; à déchiffrer les mécanismes utilisés par les virus détournement machinerie de traduction de l'hôte pour leurs fins par eIF4G1 clivage par exemple avec l'inhibition des structures de cap-dépendante traduction IRES et de leur ARNm, traduit en coiffe-indépendante de manière ^21; pour étudier le rôle des facteurs de mutation de la traduction sur le cycle cellulaire depuis les ovocytes sont des modèles de choix pour cette étude ^22; d'étudier les principaux mécanismes régissant initiation de la traduction-à-dire, cap-dépendante et coiffe-indépendante pour définir si un ou plusieurs systèmes sont impliqués dans une perturbation de la synthèse des protéines. Plusieurs variantes du protocole actuel pourraient facilement être appliquées pour atteindre ces objectifs, y compris la détermination de l'efficacité de la traduction par le coucher de soleil ou method23 journaliste ARNm microinjection. Par exemple, l'utilisation d'un journaliste ARNm bicistronique contenant un premier cistron dans lequel la luciférase de Renilla sera cap-dépendante traduittandis que le second cistron contenant Firefly luciférase sera traduit via IRES structures devraient permettre de définir le mode d'initiation à mettre en avant les défauts amende et / ou compensations pour maintenir l'homéostasie traduction. En outre, de telles expériences d'ARN rapporteur de la luciférase offrent l'avantage de ne pas compter sur les mécanismes de développement spécialisés de potentiel de perturbation dues à des mécanismes de conservation incomplètes avec l'homme.

En parallèle à ces questions fondamentales, tel protocole pourrait être appliqué comme une première étape pour remédier aux conditions néfastes qui pourraient contribuer à des troubles neurologiques. Dans des conditions physiologiques, les étapes d'initiation de traduction sont les cibles privilégiées des règlements en vertu des conditions de stress telles que l'oxydation, l'hypoxie, changement de température, irradiation et une carence en nutriments. Dans ces conditions, une traduction sélective de transcrits codant pour des protéines qui sont essentielles contre les contraintes et la survie cellulaire se produit.Lorsque ce processus est débordé, les contraintes deviennent pathologique et participent activement à l'élaboration de plusieurs affections neurologiques. Les facteurs de stress cellulaires sont impliqués dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou maladie à prion (Creutzfeldt-Jakob) ^{24 et} ces contraintes induisent l'activation de la réponse de la protéine dépliée (UPR). Un de ces mécanismes EPU conduit à une diminution de la traduction via l'activation de PERK et la phosphorylation de la sous-unité eIF2α avec les conséquences de l'arrêt de la traduction en empêchant la liaison entre eIF4F et les complexes 43S ^25. Dans les ovocytes de Xenopus, l'addition d'agents oxydants et / ou gènes mutés connus pour être associés à ces pathologies mimeraient ces contraintes et établir si les gènes mutés peuvent influer sur les processus de traduction. Dans la maladie de Parkinson par exemple, l'introduction de eIF4G1 p.R1205H dans Xenopnous ovocyte associés ou non à des facteurs de stress oxydatif ou de l'analyse du génome entier de profils de polysomal d'ARNm pourrait aborder la question de l'implication de la traduction dans la physiopathologie ^26.

Toutes ces applications appliquées à l'ovocyte représentent donc un vaste champ de possibilités pour étudier les perturbations de traduction qui sont maintenant connus pour être associés à plusieurs affections, notamment des troubles neurodégénératifs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine methane sulphonate	Sandoz	MS-222	oocytes handling
Forceps	Moria	Dumont MC40
Streptomycin/penicillin	Sigma	781
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Tetracyclin	Sigma	T7660
Veterinarian absorbable Vicryl thread	Johnson&Johson Intl	JV1205
Collagenase A	Roche diagnostics	10103586001
PmeI	New England Biolabs	R0560S	Preparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2O	Life Technologies	10977
Sodium Acetate	Merck	6268
Absolute ethanol	Sigma	02854
Nano Drop	Thermo Scientific
TBE 10X	Eppendorf	0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/ml	Life Technologies	15585-011
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion by Life Technologies	AM1344
MOPS	Sigma	M1254
EDTA	Fluka	03609
Agarose	Life Technologies	16500-500
Formaldehyde 37%	Merck	1.04003.1000
Formamide	Fluka	47671
Gel Doc Imager	Biorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-510-X	microinjection
Replacement Glass 8"	Drummond Scientific Company	3-000-210-G8
0.45 µm filter	Millipore	SLHA025NB
Progesterone	Sigma	P0130
Hepes	Sigma	H3375	Western Blot
NaCl	Sigma	S5886
SDS	Biorad	161-0301
MgCl2	Sigma	A3294
Bovine serum albumin	Sigma	A4612
leupeptin	Sigma	L8511
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6506
PMSF	Sigma	P7626
sodium vanadate	Sigma	S6508
Laemmli buffer	Biorad	161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX	Biorad	456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting system	W.E.P. Compagny
Glycine	Biorad	161-0718
Tris-HCl	Biorad	161-0719
Hybond ECL Membrane	Amersham Life Science	10401180
Methanol	VWR	20846-292
Ponceau Red (0.5%)	Sigma	P3504
Tween 20	Sigma	P2287
anti-GFP	Life Technologies	A11122
anti-V5	Santa Cruz Biotechnology	sc-58052
anti-Eg2	Santa Cruz Biotechnology	sc-27884
anti-Eg2-P	Cell Signaling	C39D8
anti-ERK2	Santa Cruz Biotechnology	sc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7976
anti-Rsk	Santa Cruz Biotechnology	sc-231
anti-mos	Santa Cruz Biotechnology	sc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2378
Advanced ECL Detection System	Amershan Life Science	RPN2135
PBS 1x	Sigma	P4417	polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)	Qiagen	79306
Chloroform	Sigma	31998-8
Isopropanol	Sigma	278475-1L
RNeasy mini kit	Qiagen	74106
RTL buffer	Qiagen	79216
RNAse free DNAse set	Qiagen	79254
Primers	Eurogentec
T4 RNA ligase 1	New England Biolabs	M0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems, Life Technologies	4368813
Taq polymerase	Life Technologies	10342020