Abstract
Proteinsyntesen er en grunnleggende prosess for å genuttrykk påvirker ulike biologiske prosesser særlig tilpasning til miljøforhold. Initiering trinnet, som innebærer montering av ribosomale underenhetene på mRNA initieringskodonet, involvert initiering faktor inkludert eIF4G1. Defekter i dette hastighetsbegrensende trinnet i oversettelse er knyttet til ulike lidelser. Å studere de potensielle konsekvensene av slike dereguleringer, laevis Xenopus oocytter utgjør en attraktiv modell med høy grad av bevaring av viktige cellulære og molekylære mekanismer med menneske. I tillegg, under meiotisk modning, ubefruktede egg er transcriptionally trykt og alle nødvendige proteiner er oversatt fra forhåndseksisterende, maternelle mRNA. Denne rimelige modellen kan eksogene mRNA å bli perfekt integrert med en effektiv oversettelse. Her beskrives en protokoll for vurdering oversettelse med en faktor av interesse (her eIF4G1) bruker lagered mors mRNA som er de første til å bli polyadenylert og oversatt under oocytmodningen som en fysiologisk avlesning. I begynnelsen mRNA syntetisert ved in vitro transkripsjon av plasmider av interesse (her eIF4G1) injiseres i egg og kinetikk av oocytmodningen etter Germinal Vesikkel Sammenbrudd deteksjon er bestemt. Den studerte mors mRNA målet er serin / treonin-protein-kinase mos. Dens polyadenylering og påfølgende oversettelse etterforskes sammen med uttrykk og fosforylering av proteiner av MOS signal involvert i oocytmodningen kaskade. Varianter av den aktuelle protokollen til å legge frem translasjonsforskning defekter er også foreslått å understreke sin generelle egnethet. I lys av nye bevis for at avvikende proteinsyntesen kan være involvert i patogenesen av nevrologiske lidelser, gir en slik modell muligheten til enkelt å vurdere dette verdifall og identifisere nye mål.
Introduction
Proteiner er viktige elementer for cellenes liv og dermed på større skala av organismen. De sikrer de fleste cellulære funksjoner inkludert struktur, transport, reaksjonskatalyse, regulering, genekspresjon etc. Deres uttrykk er resultatet av en kompleks mekanisme for oversettelse tillate konvertering av et mRNA til protein. Oversettelsen er utsatt for forskjellige kontroller for å tilpasse og å regulere genekspresjon i henhold til celle behov, under utvikling og differensiering, aldring, fysiologiske stress eller patologiske manifestasjoner.
Oversettelse er delt inn i 3 faser (initiering, forlengelse og oppsigelse) og presenterer 3 initiering oversettelsessystemer for å svare på disse behovene: cap-avhengig, cap uavhengig via intern ribosom Entry Segment (IRES) strukturer og cap-Uavhengig Oversettelses Enhancers ( CITE).
De fleste eukaryote mRNA er oversatt i en cap-dependent måte via 7-methylguanosine 5'-trifosfat cap som fungerer som en anerkjennelse funksjonen i proteinsyntesen. Dette cap binder seg til eIF4E, en komponent av eIF4F kompleks med eIF4G1 og eIF4A. Assosiert med andre partnere som poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, disse oversettelsesinnvielses faktorene tillate å sirkulær mRNA og forbedre tilgjengeligheten til skjemaer 43s kompleks til AUG initieringskodonet anerkjennelse en. Dette arrangementet svarer til slutten av translasjons-initierings-dvs. det første trinnet av oversettelse.
Cap-uavhengig oversettelse blir brukt av mRNA som koder for essensielle proteiner under stressede forhold som induserer for eksempel celleproliferasjon og apoptose. Denne mekanismen involverer sekundære strukturer i mRNA 5'- utranslaterte region (UTR) kalt IRES, den karboksy-terminale ende av eIF4G1 forbundet med eIF4A og 43s komplekset. Bindingen av dette 43s pre-initiering complex til IRES initierer hetten uavhengig oversettelse uten behov for eIF4E faktor 2,3.
Til slutt, støtter et annet oversettelsesmekanisme fortsatt ikke godt forstått denne lua uavhengig oversettelse aktivitet under stressede forhold via CITE strukturer som ligger innenfor mRNA UTR fire.
Gjennom disse ulike former for oversettelse avviker med sine initiering trinn, spiller oversettelses en avgjørende rolle i cellulær homeostase og en hvilken som helst endring i en av disse prosessene vil derfor påvirke organismen med små til store effekter. Faktisk, er initieringen et hastighetsbegrensende trinn regulerer korrekt oversettelse prosesser av mRNA til proteiner, og er således gjenstand for en rekke kontroller og reguleringspunkter 5. Enten det er for det sistnevnte eller for komponenter av disse prosessene, hvis man viser seg å være defekt, vil det forstyrre den etablerte balansen i cellen, og derved kan føre til patologiske Condisjoner. I denne sammenheng har mutasjoner i omregningsfaktorer vært involvert i flere lidelser inkludert nevrodegenerative lidelser som `leukoencefalopati med forsvinnende hvit matter' (eIF2B1-5 subenhet) 6, i Walcott-Rallison syndrom (EIF2AK3 genet som koder for PERK) 7, potensielt i Parkinsons sykdom (eIF4G1 p.R1205H) 8. Det er derfor viktig å gjennomføre cellulære og molekylære studier av disse muterte proteiner for å øke vår kunnskap om sykdomsutvikling og på den generelle prosessen med oversettelse innvielse.
For å utføre disse undersøkelsene, er det viktig å velge de mest egnede modeller for å observere konsekvensene av disse mutasjonene Xenopus laevis oocytter er spesielt godt tilpasset på grunn av deres fysiologiske og biokjemiske egenskaper:. Fysiologisk synkronitet (blokkert i fase G2 av cellesyklus) Stor kapasitet av proteinsyntese (200-400 ng / dag / oocytt), høyt antall ekstrahert oocytes fra en samme dyr (800-1000 ubefruktede egg / kvinne) og cellestørrelse (1.2 til 1.4 mm i diameter) som letter deres manipulasjon. Mikroinjeksjon av Xenopus oocytter med syntetisert mRNA kan enkelt utføres for å dissekere oversettings trinn. I denne visningen presenterer det andre fordeler. Gitt hastighet av meiose og progresjon av translasjon mRNA etter mikroinjeksjon (~ 24 timer), representerer Xenopus oocytt et fast system sammenlignet med rekonstituert cellulære systemer (utvunnet fra E. coli, hvete bakterier eller kanin retikulocytt ...), hvor et mRNA er settes med en redusert oversettelse hastighet og til en lavere hastighet. I så fall vil effekten av en mutasjon introdusert i et mRNA være raskt observerbar og enkelt studert i flere eggceller. En annen fordel med Xenopus oocytter er at mors mRNAs er latent og protein oversettelsen er blokkert før progesteron stimulering. Tilsetning av progesteron er således et godt middel til å regulere oversettelsen induksjon. Cytoplasmatisk polyadenylation forekommer ikke ved oogenesen. Det begynner i løpet oocytmodningen i progesteron-stimulert ubefruktede egg i en tidsmessig rekkefølge og fortsetter gjennom tidlig utvikling og kan brukes til å studere de ulike trinnene i oversettelse.
Polyadenyleringen av MOS mRNA er blant de første til å skje, og det hører med Aurora A / EG2, Histone-Like B4 mRNA til klassen av "tidlig modning" gener som definert i Charlesworth et al. (2004) 9. Translasjonsforskning induksjon av "sent" mRNA som Cyclin A1 og Cyclin B1 skjer rundt tidspunktet for Germinal vesikkel sammenbrudd (GVBD). Mos mRNA koder for et serin / treonin-protein kinase. Oversettelsen er avgjørende fordi det fremkaller MAP kinase kaskade som indirekte aktiverer oocytmodningen. Faktisk, i respons til progesteron er polyadenylering av mRNA MOS økes via en prosess som omfatter Aurora A / EG2 regulatoriske proteiner og andre RNA-bindende proteiner med the 3'UTR av mos mRNA. Denne økte polyadenylering av mRNA mos fører til en økning av MOS-protein-nivå, som i sin tur aktiverer MEK1. Denne prosessen medierer aktivering av det ekstracellulære signalregulerte kinase 2 (ERK2) (figur 1). Denne signalkaskade kan da utløse modningen M-fase fremme faktorer, et kompleks dannet av syklin B og Cdc2 kinase, og til slutt resulterer i meiotisk gjenopptagelse.
Derfor i Xenopus laevis oocytter, kan studiet av mors mRNA som mos lett brukes til å teste deres translatability med flere endepunkter fra deres effektiv polyadenylering til oversettelse av flere MOS signaleringskomponenter, herunder også bestemmelse av GVBD rate. Dette systemet er derfor interessant å evaluere de første konsekvenser av mutasjoner i translasjonsinitiering faktorer uten innblanding av nylig transkribert mRNA eller av transfeksjonseffektivitet, oppstår ofte problemer med eukaryotiske cellestudier.
Her er en protokoll etablert der mutant eIF4G1 mRNA er mikroinjisert i Xenopus laevis oocytter og oversettelsen av mors mRNA er testet. I nærvær av en defekt i GVBD progresjon, mos mRNA polyadenylering som er avgjørende for progresjon gjennom eggcelle meiotisk cellesyklusen og for den påfølgende oversettelse av tidlige og sene klasse mRNA er konstatert. Fosforyleringen Aurora A / EG2 og ERK blir også undersøkt for å bekrefte konsekvens av MOS deregulation.Thus, Xenopus oocytter representerer en enkel måte for å analysere forskjellige trinn av mRNA oversettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Xenopus forsøkene ble utført på dyr innretningen av Lille 1 Universitetet i henhold til reglene i de europeiske fellesskap Rådets føringer (86/609 / EEC) for laboratorie dyreforsøk. Dyret protokollen ble godkjent av den lokale Institutional Review Board (Comité d'Ethique en Eksperimentering Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Oocyte Håndtering
- Forberede narkosen løsning: Løs opp 1 g Tricaine Metansulfonat pulver i en 1 L sterilt vann.
- Stupe hunn Xenopus laevis inn i denne løsning, dekker begeret for å unngå å unnslippe og vente ca 45 min for dyret å være fullstendig bedøvet (uten noen reaksjon på et ben klemme).
- Vask frosken med såpe og skyll med vann fra springen og sett dyret på ryggen på ren aluminiumsfolie.
- Klem huden av den laterale delen av magen og på eggstokkene nivå med pinsett.Lag et snitt på ca 1 cm med saks rengjøres før bruk med etanol 70%. Kontroller at delen er dypt nok og for å nå den underliggende bukveggen for å tillate fjerning av eggstokkvev hvor flere ubefruktede egg i ulike stadier av utviklingen er funnet.
- Skjær eggstokk fliker, vaskes 4 ganger i en petriskål (50 mm) med ND96 medium (96 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES justert til pH 7,4 med NaOH, supplert med 50 ug / ml streptomycin / penicillin, 225 ug / ml natriumpyruvat, 30 pg / ml soyabønnetrypsin-inhibitor, 1 pl / ml tetracyklin) for å fjerne alle spor av blod og rusk.
Merk: Tetracyclin gir en optimal bevaring og en god bedring etter mikroinjeksjon behandling. - Oppbevar dem i en tildekket petriskål neddykket i mediet ved 14 ° C, slik at deres bevaring i en uke.
- Stitch bukveggen og huden med veterinær absorberbare thread og suturering nål (3 eller 4 masker vil være nødvendig).
- Plasser dyret i et beger uten vann og fukte huden med vann fra springen før frosken er i gang igjen. Dekk begerglasset for å hindre rømning.
- Separer nøye eggstokken lapper i mediet i grupper på 5 til 10 ubefruktede egg ved å bruke 2 par av tang under en stereomikroskop med en 10-fold forstørrelse. Velg ubefruktede egg på scenen VI. De kan bli gjenkjent av i) sin form og farge med en brun pigmentert dyr stang og gul vegetative pole atskilt med en klar belte ii) deres størrelse overlegen til 1,2 mm i diameter 10.
- Inkuber de valgte oocytter i en kollagenaseoppløsning (1 mg / ml kollagenase A fra Clostridium histolyticum, oppløst i ND96 uten tetracyklin) i en petriskål under forsiktig omrøring i løpet av 45 min for å lette oocyte defolliculation (collagenase digests oocytten / follikkelcelleadenom forbindelser). Skyll ubefruktede egg 3 eller 4 ganger med ND96 medium holdt ved 14° C.
Merk: Ikke ruge eggceller mindre eller mer enn 45 min på grunn av faren for å ødelegge eggcelle overflateproteiner og forårsake dårlig levedyktighet. Kollagenase behandling kan indusere spontan GVBD. - Inkuber oocytter i mediet i 3-4 timer. Fjern follikulære celler med fin pinsett etter kikkerten forstørrelsesglass og holde dem ved 19 ° C i ND96 medium.
2. Fremstilling av mRNA Synthesis
- Linear 5 ug av de følgende plasmider ved enzymatisk oppslutning hjelp av PME I enzym.
MERK: pcDNA6.2 / V5-MÅL inneholder et 1599 aminosyrer eIF4G1 cDNA villtype (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-MÅL inneholder en eIF4G1 dominant negativ cDNA (eIF4G1-DN) med mutasjoner c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - og c.2126T> G i området for interaksjon mellom eIF4G1 og eIF4E i posisjon 612 for å 618 av det tilsvarende protein forstyrre samhandling betweno eIF4G1 og eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP inneholder kloramfenikol acetyl transferase (GFP). Forbered 2 blandinger for hver av de 3 plasmidene: den første inkludert PME I enzym, og det andre uten enzym som kontroll. - Utfelles plasmid-DNA ved hjelp av en klassisk prosedyre etanol og resuspender den i 20 pl nukleasefritt H 2 O.
- Bestem konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer. Konsentrasjonen bør være bedre enn 150 ng / mL for å transkribere cRNA.
- Kjør 1 mL av prøvene og deres kontroller med 5 pl av lasting buffer på en 0,8% agarosegel å verifisere plasmidet linear.
- Bruk et kit for in vitro transkripsjon og cRNA rensing i henhold til produsentens instruksjoner. De transkriberte cRNA ble resuspendert i 20 pl nukleasefritt H 2 O. Prøvene kan oppbevares ved -80 ° C hvis det er nødvendig.
- Klargjør MOPS 10X migrasjon buffer som inneholder 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM natriumacetat og 10 mM EDTA (pH 8,0). Steriliser oppløsningen med et 0,45 um filter. Lager løsningen beskyttet mot lyset ved RT for å unngå løsning oksidasjon.
- Rengjør elektroforese tank suksessivt med NaOH, HCl og skylles grundig med dobbel-filtrert vann for en O / N for å unngå RNase og forebygge RNA degradering.
- Kastet en 1,5% agarosegel inneholder mopper og formaldehyd. Varm til fullstendig agarose oppløsning og la den avkjøles til 55 ° C. Under avtrekksskap, tilsett 0,1 volum av MOPS 10X, 6,6% formaldehyd og 4 ug etidiumbromid (10 mg / ml). Hell gelen under avtrekkshette og vente ca 1 time for gelen å stivne.
Merk: Formaldehyd og Ethidiumbromid er giftige. - Forberede prøver for migrasjon i en 0.2 ml rør med 1 mL av cRNA, 8,8% formaldehyd, 60% formamid og 0,1 volum av MOPS 10X. Inkuberes i 3 minutter ved 70 ° C og setter rørene på is i 10 min. Sentrifuger prøver noen sekunder på5000 x g. Tilsett 2 mL av gel loading buffer.
Merk: Formamid er giftig. - Kjør prøvene i 20 min ved 90V. Bløt gel i nukleasefritt H 2 OO / N til destain gelen før analysere den for å sjekke cRNA kvalitet.
- Bestem cRNA konsentrasjon ved anvendelse av et spektrofotometer, og lagre dem ved -80 ° C.
3. Mikroinjeksjon av Synthesized RNA og Oocytter Modning Stimulering
- Forbered nødvendig utstyr for eggceller mikroinjeksjon. Bruk en mikropipette avtrekker å trekke lite glass kapillær. Under stereomikroskop, brekke av den ytterste ende av kapillaren med pinsett for å lage en butt ende. Fyll kapillær mikropipette med mineralolje ved anvendelse av en 1 ml sprøyte med et milliporefilter 0,45 mikrometer filter ved den motsatte ekstremiteten. Monter mikropipette på mikroinjeksjon pipette. Velg en nøyaktig mikropipette kalibrert av produsenten til å gi god nøyaktighet når det brukes med passende glass kapillær.
- Utføre mikroinjeksjon 1-2 timer etter defolliculation, nødvendig forsinkelse for eggcelle utvinning på ubefruktede egg holdes på 14 ° C. Bruk petriskåler med bunnen skrapes med pinsett for å opprette en klebende overflate for oocytter og fylle dem med ND96 medium.
- Ordne oocytter langs en skrapet lane i en petriskål slik at en suksessiv injisering av oocytter med kapillær mikropipette med en vinkel på 45 ° C.
- Injiser i oocytt ekvatoriale sone, under den pigmenterte dyr området for en optimal spredning av prøver i cytoplasma. Sett bare den tynneste delen av kapillær spiss på ca 150-200 mikrometer av dybde.
- Injiser 30 ng av cRNA oppnådd henholdsvis fra de forskjellige plasmider i et volum på 60 nl i en første oocytt. Etter injeksjon, vent 5-10 sek før du fjerner kapillær tips for å unngå å prøve escape (Figur 2A).
Merk: Du må ikke overstige 120 nl. Injisere så sakte som mulig. En kontroll med destillert vann anbefales. - Flytt manuelt petriskål for å injisere den neste eggcelle.
Merk: Pass på at spissen ikke er tett ved å generere en liten puls ut av badekaret løsningen etter 2 til 3 microinjections. - Overfør injisert ubefruktede egg i 24 brønner kulturplater (10 ubefruktede egg / brønn) fylt med 3 ml frisk ND96 medium og la dem ved 19 ° C.
- Inkuber i oocytter ND96 med progesteron (PG) (2 ug / ml) for å utløse meiotisk modning (GVBD) ved 19 ° C, 15 timer eller 4 timer etter mikroinjeksjon av polyadenylerte CRNAs erholdt henholdsvis fra pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 og pcDNA6 0,2 / C-EmGFP anvendt som en kontroll (figur 2A).
Merk: Co-injeksjon av fluoriserende fargestoff med cRNA er et fint verktøy for å sikre at cRNA ble injisert og forble i oocytten. Utføre slike foreløpige eksperimenter ved hjelp av en cRNA av interesse med en GFP tag. - Microinject som i # 3.5 forskjellige forhold (1: 3, 2: 2, 3: 1) av polyadenylert eIF4G1-WT og eIF4G1-DN CRNAs for å test oversettelsen effekten av eIF4G1-WT CRNAs på mutant fenotype (figur 2D).
4. Germinal Vesikkel Sammenbrudd Bestemmelse
- Tell antall modne oocytter etter PG stimulering ved å observere tilstedeværelsen av en hvit flekk på den svarte dyr stang med en stereomikroskop. Gjenta teller hver time før den tjuefjerde time (figur 2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Analyse
- Homogen gruppen av 10 oocytter med frem og tilbake bevegelser med en mikropipette spiss, ved 4 ° C i 200 ul i den følgende buffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg / ml bovint serumalbumin, 10 mg / ml leupeptin, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml soyabønnetrypsininhibitor, 10 mg / ml benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM natriumvanadat.
- Prøvene sentrifugeres i 15 min ved 10.000 xg for å fjerne lipid (øvre fase) og membranen (bunnfasen) fractions. Samle den cytoplasmiske fraksjon, lagre en prøve for å bestemme proteinkonsentrasjonen og fullfører det gjenværende med Laemmli, eller en bis-Tris-prøvebuffer (1: 1).
Merk: Bis-Tris gels og lasting buffer har en mer nøytral pH som beskytter proteiner fra hydrolyse - Varm 20 ug av prøven ved 95 ° C i 10 min. Laste hver prøve inn i brønnene på akrylamid-gel. Plasser gel i en tank med passende buffer.
- Utføre en elektroforese i 1 time ved 200 V.
- Realisere en WB i TBS, pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, inneholdende 10% bovint serum albumin) med et geit anti-Aurora A / EG2 (1: 3 000, 2 timer), eller med et kanin anti -Aurora A / EG2-P (1: 1000, O / N ved 4 ° C), muse-anti-ERK2 (1: 3 000, 2 timer), geite-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3 000, 2 timers ), kanin-anti-mos (1: 5000, 4 timer), kanin-anti-GFP (1: 3 000, 2 timer) antibodies.Use antistoffer mus anti-V5 (1: 10 000, 2 timer) og kanin-anti-RSK (1 : 1000, 2 timer) (som laste kontroller).
- Vaskmembranen 3 ganger i 10 minutter i TBS-Tween og Inkuber 1 time med enten et anti-mus eller anti-kanin eller anti-geit (IgM) pepperrot-peroksidase-merket sekundært antistoff ved fortynninger på 1: 5000, 1: 7500 og 1 : 5000 kroner.
- Utfør 3 vasker av 10 min i TBS-Tween og oppdage de antigen-antistoff komplekser med Advanced ECL Detection system.
6. polyadenylering Analyse
- Eksempel 5 ubefruktede egg per tilstand i en 1,5 ml. Vask dem med 1 ml nukleasefritt PBS 1X (pH 7,4). Følgende trinn vil skje under avtrekkshette.
- Pakk RNA ved hjelp av en klassisk organisk prosedyre (se produsentens instruksjoner).
- Gjenvinne RNA ved sentrifugering (10 000 xg) i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og lufttørk RNA i 10 min.
- Resuspender RNA pellet i 30 mL av nukleasefritt H 2 O.
- Ta 15 ul prøver i et nytt rør og tilsett 85 mL av nukleasefritt H 2 O. Rydde oppSE prøver å forbedre kvaliteten på silika spalte i henhold til produsentens instruksjoner. Eluer RNA ved å bruke 30 ul av nukleasefritt H 2 O
- Kjør 1 mL av prøvene med 5 mL av lasting buffer på en 0,8% agarosegel å sjekke RNA integritet.
- Bestem RNA konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.
- Forbered 2 ligeringsblandingene pr tilstand (dvs. eIF4G1-WT, eIF4G1-DN og H 2 O kontroll) med de følgende reagenser: 10 U av RNA-ligase, 0,1 volum av 10X buffer, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50% 0,1 mikrogram av primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 og bringe det endelige volumet til 10 mL med nukleasefritt H 2 O. Legg i den første blandingen RNA oppnådd fra oocytter uten PG stimulering og i den andre blanding RNA oppnådd fra PG stimulert oocytter.
- Inkuber i 1 time ved 37 ° C og deretter i 20 minutter ved 65 ° C for å inaktivere enzymet.
- Ossea cDNA Reverse Transcription (RT) kit. Forbered RT blanding, per tube: 0,1 volum 10X RT buffer, 0,1 mikrogram av primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP blanding, 50 U av revers transkriptase og komplett med nukleasefritt H 2 O til sluttvolum 10 ul. Tilsett 10 pl av ligeringsreaksjonen erholdt tidligere. Utfør RT under betingelser som er beskrevet av produsenten.
- Forbered Polymerase Chain Reaction (PCR) blanding, per rør: 0,1 volum buffer 10X, 1,5 mM MgCl2, 133 uM dNTP-blanding, 0,2 uM spesifikk primer, 0,2 uM primer P2, 0,025 U Taq-polymerase, 1 pl av cDNA og komplett med nukleasefritt H 2 O til sluttvolum på 50 pl. Utføre PCR i henhold til følgende betingelser: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 min, [95 ° C i 1 min, 56 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek] * 40 sykluser, 72 ° C for 10 min 9. De spesifikke primere er som følger: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone lignende B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyklin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Forbered en 3% agarosegel. Legg i hver PCR produktene 10 ul lasting buffer. Kjør gel med 10 ul prøver ved 110 V for en optimal migrasjon. Analyser gel etter 10 og 20 minutter for å observere en endring i størrelse som følge av lengden av halen poly (A) RNA og således modning som er en forutsetning for deres oversettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinetisk modning av Xenopus oocytter og bestemmelse av prosentandelen eggcelle GVBD etter 24 timers stimulering av PG (figurene 2B, 2C):
For å studere de translasjonelle konsekvensene av eIF4G1-DN mutasjon, responsen til PG i Xenopus laevis oocytter microinjected med cRNA eIF4G1-DN blir sammenlignet med WT-eIF4G1 og til andre kontrollbetingelser (H 2 O, GFP). Kontrollene gjør for å vurdere forekomsten av eggcelle mikroinjeksjon uavhengig av arten av injisert cRNA eller eIF4G1 overekspresjon.
De kinetiske maturations av 10 oocytter kjennetegnet ved mikroinjisert kontrollbetingelser (H 2 O og GFP) er lik WT og antallet gjennomgår GVBD er meget nær hverandre ved 12 og 24 timer etter stimulering PG (figur 2B). Etter 24 timer, modning av oocytter når 95,7% for WT, 97,1% for H 2 O og 97,5% for GFP (Fi gur 2C). Dermed microinjections med H 2 O eller kontroll CRNAs eller eIF4G1 CRNAs ha liten effekt på oocyttmeiose utgivelse. Motsatt åtte timer etter PG stimulering, er antall oocytter microinjected med eIF4G1-DN CRNAs gjennomgår GVBD forsinket i forhold til eIF4G1-WT CRNAs (figur 2B) sikret meiose utgivelsen av eIF4G1-DN versus eIF4G1-WT ubefruktede egg betydelig reduseres med 85,8% og 77,4% ved 12 timer og 24 timer etter stimulering PG henholdsvis (figur 2C). Det er også bemerkelsesverdig at 13 timer etter stimulering PG, antallet modne oocytter når et maksimum for alle forhold med unntak for eIF4G1-DN for hvilken den maksimale oppnås bare 20 timer etter stimulering PG. Tilstedeværelsen av eIF4G1-DN mutasjon fører til dårligere oocyttmeiose frigivelse sammenlignet med eIF4G1-WT.
Restaurering av oocytmodningen i nærvær av eIF4G1-DN takket være eIF4G1-WT (figur 2D):
_content "> For å finne ut om de eIF4G1-DN Crna mikroinjeksjon påvirker eller blokkerer oocytmodningen, ulike prosenter av eIF4G1-WT og eIF4G1-DN CRNAs er co-mikroinjisert. I disse forholdene, er en økning på oocytmodningen observert som nivåene av eIF4G1-WT cRNA heve og de av eIF4G1-DN cRNA decrease.While modning er observert i 17,5% av ubefruktede egg med en dose eIF4G1-DN CRNAs, når denne andelen 76,7% med co-mikroinjeksjon av 3 doser eIF4G1-WT CRNAs og nærvær av en dose av eIF4G1-WT CRNAs fører til 95% av oocytmodningen. Dette forsøk viser at modningen av Xenopus oocytter defekten microinjected med eIF4G1-DN er ikke irreversible og kan være delvis gjenopprettes.Expression mos signaleringsproteiner observert på WB som en indikator for oversettelse egenskaper før og etter stimulering PG (figur 2E):
Proteininnholdet i V5-tag i oocytter uttrykke eIF4G1-WT og eIF4G1-DN er lik reflekterer lignende mikroinjeksjon effektivitet. Nivået av RSK protein brukes som protein lasting kontroll er også lik i alle forhold før og etter PG stimulering. Ekspresjon av GFP-proteinet er også til stede i oocytter microinjected med GFP cRNA stimulert eller ikke med PG. Disse data indikerer at mikroinjeksjon og overekspresjon av eF4G1 ikke forstyrre oversettelsen av GFP. Imidlertid er ingen GFP proteinekspresjon påvises før og etter stimulering PG i oocytter som uttrykker eIF4G1-DN. Som forventet, er ingen endogen mos detekterbar ekspresjon i fravær av PG stimulering. I tillegg mos uttrykk er observert i eIF4G1-WT og H 2 O kontroll forhold etter PG stimulering i overensstemmelse med tidligere resultater som viser at overekspresjon av eIF4G1-WT har små konsekvenser for endogene mos 16. Omvendt er en betydelig reduksjon av MOS ekspresjon merkbar etter PG stimulering.
Den protein ekspresjon av noen komponenter av MOS signalkaskade er også testet. For eksempel, Aurora A / EG2 protein som virker oppstrøms til mos induksjon og ingen påvisning av proteinet eller deregulering av den fosforylerte formen indusert etter PG stimulering observeres. Omvendt er en deregulering av ERK2 fosforylering indusert av mos observert i nærvær av eIF4G1-DN.
Resultatene antydet at den endogene uttrykk for mos RNA til protein og mos avhengig ERK2 aktivering er berørt av uttrykket av eIF4G1-DN.
mRNA polyadenylering (figur 2F):
Polyadenylering av flere mRNA (MOS, Cyclin A1, Cyclin B1 og Histone lignende B4) som er nødvendige for Xenopus oocytter meiose utvinning ble testet. Den utførte analyse gjør det mulig å definere hvorvidt en økning i amplimer størrelse svarende til lengden av den poly (A) halen til mRNA er tilstede etter PG stimulering. Faktisk, med PG stimulering tilsetningen av et poly (A) hale er observert i alle betingelser inkludert eIF4G1-DN mutasjon.
Figur 1. Skjematisk oversikt over MAPK kaskade aktivering. Ved hormonell stimulering av PG raske endringer i virksomheten til flere enzymer oppstår inkludert de av Aurora A / EG2 og CPEB sti. Hyperfosforylering av Aurora A / EG2 fører til CPEB (Cytoplasmatisk polyadenylering Element bindende protein) fosforylering. Fosforylert CPEB gjenkjenner CPE (Cytoplasmatisk polyadenylering Element) på 3'UTR av MOS mRNA, rekrutterer CPSF (Spalting og polyadenylering spesifisitet Factor) og aktiverer mRNA polyadenylering av PAP (Poly (A) Polymerase). PG stimulering fremmer også suksessivt Maskin fosforylering via både handling av PKA og CDK1, Maskin / eIF4E dissosiasjon og eIF4E / eIF4G1 forening. eIF4G1 rekrutterer transningsinnvielses partnere inkludert PABP som samhandler med eIF4G1 og gjenkjenner poly (A) hale. Når syntetisert, mos aktiverer MEK / MAPKK ved fosforylering, som i svinger, aktiverer ERK2 / MAPK ved fosforylering. Denne såkalte MAPK kaskade er involvert i meiotisk prosesser ved å kontrollere M-fase entry kinetisk, spindel morfogenese og inhibering av DNA-syntese. Kaskade er innebygd i en positiv feed-back loop som opprettholder proteinsyntesen. Man må være oppmerksom på at mos er ikke den eneste protein bedt om å bli syntetisert for GVBD aktivering, dvs. er Cyclin B kreves for å bli oversatt til modning prestasjon.
Figur 2. eIF4G1-DN mutant påvirker oocytmodningen og oversettelse i Xenopus laevis. RNA stammer fra plasmider som koder V5-merket eIF4G1 proteiner (WT og DN) ermikroinjisert i Xenopus laevis oocytter. Etter 15 timer blir modning av oocytter stimulert av progesteron (PG) (Forsøk ble utført på minst 3 ganger og representative resultater er vist). (A) Schematicoverview eksperimentering protokollen. Den injeksjoner eIF4G1 og / eller GFP CRNAs representeres av pilespisser før PG stimulering. Prøver for RNA og proteiner analyser er blitt oppnådd fra 2 tidspunkter (PG stimulering og ved slutten av den kinetiske GVBD). (B) Kinetisk modning av oocytter 10 kjennetegnet ved GVBD blir testet under 24 timer etter stimulering PG. En forsinkelse i oocytmodningen er observert i oocytter microinjected med eIF4G1-DN CRNAs sammenlignet med dem mikroinjisert med eIF4G1-WT CRNAs (C) Prosent av modne oocytter 24 timer etter stimulering PG (n = 4; * p <0,05).. En reduksjon i oocytmodningen er observert i de mikroinjisert med eIF4G1-DN CRNAs forhold til eIF4G1-WT CRNAs. (D) Reversion fenotype vurdering av oocytter microinjected med eIF4G1-DN mutante CRNAs og eIF4G1-WT CRNAs viser at oversettelsen maskineri er fremdeles funksjonell når eIF4G1-WT tilsettes til mutanten. (E) Proteiner er hentet fra oocytter og deres nivåer bestemt ved immuno-analyse . Forstyrrelser av ERK2 fosforylering, mos og GFP uttrykk i eIF4G1-DN vilkår er oppfylt. (F) polyadenylering av mos, Cyclin A1, cyklin B1 og histon-lignende B4 mRNA fra ubefruktede egg stimulert eller ikke med PG observert etter PCR forsterkning og migrasjon på 3% agarose gel. Etter stimulering PG, er en økning i størrelse> 100 polyadenylering detektert for alle forhold. Den første bane svarer til stigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oversettelse er en mekanisme involvert i patofysiologien av mange menneskelige lidelser, inkludert flere nevrodegenerative sykdommer. For eksempel ved Parkinsons sykdom flere rapporter antydet at verdifallet i oversettelse i forbindelse med arvelige mutasjoner 8,12,13.
Flere cellemodeller er tilgjengelige for å studere oversettelse. Her, for å studere konsekvensene av translasjonelle en mutasjon i eIF4G1 som virker som negativ dominant mutasjon redusere interaksjonen mellom eIF4G1 og eIF4E partnere 8, Xenopus laevis oocytter blir brukt. Denne modellen har fordelene ved enkelhet, siden det er sammensatt av bare en enkelt kjempecelle å lette mikroinjeksjon av syntetisk mRNA, som fører til en betydelig mengde av materiale for biokjemiske forsøk og tilrettelegging makroskopiske observasjoner av de forskjellige fasene av oocytmodningen. Denne fremgangsmåte er også effektiv tid i forhold til stabil cellelinje generasjon. Videre har flere protokoller for oocytt forberedelse og RNA microinjections allerede blitt beskrevet spesielt for å studere cellesyklus eller nucleocytoplasmic transport 14,15. Når det gjelder grensene for slike protokoller for å studere oversettelse, bør en særlig oppmerksomhet tas hensyn til konsentrasjonen av mRNA. Denne konsentrasjonen bør ikke være for høy (som ikke er høyere enn 30 ng i 120 nl maksimum) for ikke å mette oversettelsesprosessen. Hensyntatt dette elementet, er Xenopus eggcelle en attraktiv modell for å studere protein oversettelse som attestert av data som presenteres i figur 2 med en mutant form av EIF4G1 karakterutskrift.
Faktisk, i nærvær av det muterte eIF4G1, er nedsatt i oversettelsen av MOS-protein observert og korreleres med en reduksjon på 90% av GVBD sammenlignet med WT, og til å kontrollere betingelser. Omvendt, overekspresjon av eIF4G1-WT resulterte ikke i endring i nivået of mos oversettelse i avtale med litteratur data 16,17.
Mange biologiske modifikasjoner kan forklare disse resultater. Å vite at mos mRNA er av maternal opprinnelse og allerede transkribert før meiose aktivering av PG, bør de forstyrrede mekanismer oppstår mellom transkripsjon og oversettelse trinn. Bemerkelsesverdig, mos oversettelse er et resultat av en kaskade av hendelser molekylære som starter fra en latent mRNA uten poly (A) halen til tilsetningen av halen etter PG stimulering til dens oversettelse 18,19. Dermed flere scenarier er mulige inkludert: defekter i oversettelse initiering kan bli mistenkt som årsak til denne feilen, eller defekter i fosforylering av faktoren som fører til mos mRNA polyadenylering eller mislighold av mRNA polyadenylering av mos transkripsjoner av seg selv kan føre til en translasjonell nedgang.
For å vurdere disse siste 2 mekanismer, er uttrykket av disse faktorene ved WB undersøkt. Uttrykkeion nivåer av fosforylert Aurora A / EG2, ansvarlig for fosforylering CPEB viste ingen forstyrrelse i nærvær av det muterte eIF4G1. I samme retning, blir MOS mRNA polyadenylering eller annet mRNA polyadenylering observert i nærvær av det muterte eIF4G1 etter PG stimulering (figur 2F). For å bekrefte ytterligere polyadenylerings profilen Northern blot eksperimenter vil bli anbefalt samt utføre sukrosegradient isolering av polysomes for å etablere hvorvidt rekruttering av mRNA til ribosomer kan forekomme 16.
Så, ved å studere de første og siste elementer av kaskaden, ble opprørt trinnet mistenkes å være nedstrøms for forekomsten av polyadenylering. Det er også viktig å teste om MOS uttrykket defekten ga den forventede effekt på fosforylering av ERK2. I nærvær av mutasjonen, reduksjon av MOS uttrykk førte til en reduksjon av fosforylert ERK2 nivå, og følgelig til en defekt iden GVBD progresjon (figur 1 og 2E). Dermed er eIF4G1 mutasjon forbundet til en forventet nedsettelse av MOS oversettelse. Sletting av eIF4E bindende domene i eIF4G1 sekvens i eiF4G1-DN er trolig ansvarlig for en nedgang i eIF4G1 / eIF4E interaksjoner som tidligere foreslått av en co-immunoprecipitation studie åtte som kan forstyrre eIF4F kompleks formasjon.
Denne protokollen har flere interessante programmer i cellebiologi. Dette oppsettet er ideelt som foreløpige undersøkelser for en rekke grunnleggende spørsmål i cellebiologi som: å bedre forstå rollen av spesifikke domener av innvielses faktorer og å definere de som er avgjørende for å in vivo oversettelse eller oocytmodningen. I denne sammenheng Wakiyama et al. (2000) viste viktig i oocytmodningen av den amino-terminale regionen av eIF4G1 som inneholder bindingsdomener for eIF4E og PABP 17; å studere splicing av initiering faktorer 20; å tyde de mekanismene som brukes av virus kapre vert oversettelsesmaskiner for sine formål via eIF4G1 cleavage for eksempel med hemming av cap-avhengig oversettings og Ires strukturer av deres mRNA, oversatt i cap-uavhengig måte 21; å studere rollen av mutasjon i omregningsfaktorer på cellesyklus siden oocytter er modeller av valg for en slik studie 22; for å studere de viktigste mekanismer som styrer initiering av translasjon dvs. å cap-avhengig og cap-uavhengig bestemme om ett eller flere systemer som er involvert i en proteinsyntesen forstyrrelse. Flere varianter av den aktuelle protokollen kan lett brukes for å nå disse målene, herunder fastsettelse av oversettelsen effektiviteten ved solnedgang method23 eller reporter mRNA mikroinjeksjon. For eksempel, ved bruk av en bicistronisk reporter mRNA inneholder et første cistron i hvilken Renilla luciferase vil være cap-avhengige settesmens den andre cistron inneholder Firefly luciferase vil bli oversatt via IRES strukturer bør sette til å definere modus for initiering å legge frem gode defekter og / eller kompensasjon for å opprettholde oversettelse homeostase. I tillegg er slike luciferase reporter RNA eksperimenter tilby fordel å ikke stole på potensialet forstyrre spesialiserte utviklingsmekanismer skyldes ufullstendig vernemekanismer med menneske.
Parallelt med disse grunnleggende spørsmålene, kan en slik protokoll brukes som et første skritt for å løse uheldige forhold som kan bidra til nevrologiske lidelser. I fysiologiske forhold, oversettelse innvielses trinnene er de privilegerte målene i regelverket under stressede forhold som oksidasjon, hypoksi, temperaturendringer, bestråling og næringsmangel. Under slike forhold, en selektiv oversettelse av transkripter koder for proteiner som er nødvendige for påkjenninger og celleoverlevelse oppstår.Når denne prosessen er overveldet, stresset blir patologisk og delta aktivt i utviklingen av flere nevrologiske følelser. Cellulære stressfaktorer som er involvert i en rekke neurodegenerative sykdommer slik som Alzheimers og Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose eller prionsykdom (Creutzfeldt-Jakob) 24, og disse spenninger indusere aktivering av utfolding protein respons (UPR). En av disse UPR mekanismene fører til en redusert oversettelse via PERK aktivering og fosforylering av eIF2α subenhet med konsekvensene av å stoppe oversettelse ved å hindre binding mellom eIF4F og 43s komplekser 25. I Xenopus oocytter, tilsetning av oxyderende midler og / eller muterte gener som er kjent for å være forbundet til slike sykdomstilstander ville etterligne disse spenninger og avgjøre hvorvidt de muterte gener kan påvirke oversettelsesprosesser. Ved Parkinsons sykdom for eksempel innføring av eIF4G1 p.R1205H i Xenoposs eggcelle forbundet eller ikke mot oksidativt stressfaktorer eller genom-wide analyse av mRNA polysomal profiler kunne ta opp spørsmålet om oversettelsen engasjement i physiopathology 26.
Alle disse programmene som brukes for eggcelle representerer dermed et stort felt av muligheter til å studere oversettings forstyrrelser som nå er kjent for å være assosiert med flere følelser inkludert nevrodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
