Abstract
I hvirveldyr, er hæmatopoiese reguleres af induktive mikromiljøer (nicher). Ligeledes i hvirvelløse model organisme Drosophila melanogaster, induktive mikromiljøer kendt som larver Hæmatopoietiske Lommer (HPS) er blevet identificeret som anatomiske steder for udvikling og regulering af blodlegemer (hæmocytter), navnlig af selvfornyende makrofag afstamning. HPS er segmentarisk gentagne lommer mellem epidermis og muskellag af larve, der også dækker sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. I larve, er hjemmehørende (fastsiddende) hæmocytter udsat for anti-apoptotiske, klæbemiddel og proliferative signaler fra disse sensoriske neuroner og potentielt andre bestanddele af HPS, såsom foring muskler og epiteliale lag. Under normal udvikling, gradvis frigivelse af hjemmehørende hæmocytter fra HPS brændsler befolkningen i cirkulerende hæmocytter, som kulminerer i frigivelsen af most af de bosiddende hæmocytter i begyndelsen af metamorfose. Immune overgreb, fysisk skade eller mekanisk forstyrrelse udløse tidlig frigivelse af hjemmehørende hæmocytter i omløb. Kontakten af larver hæmocytter mellem hjemmehørende steder og cirkulation hæver behovet for en fælles standard / procedure til selektivt at isolere og kvantificere disse to populationer af blodceller fra enkelt Drosophila larver. Derfor denne protokol beskriver en automatiseret metode til at frigøre og kvantificere beboeren og cirkulerende hæmocytter fra enkelt larver. Metoden letter ex vivo metoder, og kan tilpasses til at tjene en række forskellige udviklingsstadier af Drosophila og andre hvirvelløse organismer.
Introduction
Forskning i hvirvelløse model Drosophila melanogaster har drevet opdagelsen af medfødte immunitet 1, og har lettet forståelsen af forskellige aspekter blodlegemer udvikling på 2-4. Drosophila hæmatopoiese kan opdeles i afstamning af embryonale / larve hæmocytter, som har oprindelse i den embryoner og ekspandere i larve, og afstamning af lymfe kirtel hæmocytter 4,5. Her præsenterer vi en protokol, der fokuserer på den slægt af embryonale / larver hæmocytter, som i Drosophila larve hovedsageligt omfatter plasmatocytes (makrofager) og få krystal celler 4. I larve, hæmocytter af embryo fortsætter og kolonisere segmentvis gentagne og terminal Hæmatopoietiske lommer (HPS) placeret mellem epidermis og muskel lag af larvestadiet kroppen væggen 5,6. Baseret på deres natur som selvstændige forny makrofager 6, deres dominerende bopæl i lokale væv mikromiljøer 6, 7 og deres slægt fra de tidligste blodlegemer nye under udviklingen 6,8, er dette blod cellepopulation for at svare til hvirveldyr selvfornyende væv makrofager, en uafhængig myeloid herkomst nylig identificeret i en række forskellige arter 4,9,10. Men i Drosophila, nogle af eller alle disse residente celler viser også plasticitet at give anledning til andre blodcelletyper såsom krystal celler 11,12.
Larver hæmocytter er overvejende resident (siddende), men er i en dynamisk ligevægt mellem de forskellige HPS. De er gradvist frigives i omsætning, især med den 3. stadiums larve nærmer pupariation 5-7. Immune udfordringer, skader eller mekaniske forstyrrelser fører til en for tidlig, i sidstnævnte tilfælde reversible, mobilisering af hjemmehørende hæmocytter ind i hæmolymfe 4,6,13.
Tidligere undersøgelser har antydet, at hjemmehørende og cirkulerendelarval hæmocytter er af samme slægt, men adskiller sig i deres klæbende eller målsøgende egenskaber 6,7,13,14. Selektiv isolation af cirkulerende versus hjemmehørende hæmocytter afslørede forhøjede niveauer af proliferation i den fastboende hemocyte befolkning, hvilket tyder på deres eksponering for induktive signaler fra HPS 6. Drosophila larver HPS er foret af epidermis og muskellag og videre havnen sensoriske neuron klynger af det perifere nervesystem (PNS) og leverfunktionen ligner oenocytes 6. Funktionelt har mutante og genetiske celle ablation forsøg viste, at sensoriske neuroner til stede i HPS støtte trofiske overlevelse og lokalisering af larver hæmocytter 6.
Her beskriver vi en metode til den specifikke isolering og kvantificering af hjemmehørende og cirkulerende hæmocytter fra enkelt Drosophila larver, og en protokol for mekanisk hemocyte mobilisering. Fremgangsmåderne kan anvendes til ex vivoundersøgelse af hæmocytter og kan desuden tilpasses til andre Drosophila udviklingsstadier såsom puppe og voksen og andre hvirvelløse systemer. Da tidligere undersøgelser ikke skelnede mellem bopæl og cirkulerende hæmocytter, denne protokol giver en fælles standard for studiet af hjemmehørende blodceller og vil bidrage til at øge sammenhængen i hvirvelløse blodlegemer forskning.
For det første Hemocyte Bleed / Skrab-analysen beskriver forskellen isolation og automatiseret kvantificering af fluorescerende protein-mærket hjemmehørende og cirkulerende hemocyte befolkninger mod enkelt Drosophila larver; protokollen giver to muligheder for regelmæssige og fliser scan udstyrede mikroskoper (figur 1). Som et resultat, er den procentdel af cirkulerende hæmocytter og det samlede antal hæmocytter pr larve opnået. Metoden bygger på transgene Drosophila larver, der udtrykker fluorescerende protein blandt deres blodlegemerbefolkning. Valget af hemocyte driver eller reporter bestemmer udfaldet, dvs. som population af blodlegemer, visualiseres og kvantificeres. At mærke hovedsageligt makrofager (plasmatocytes), som omfatter langt størstedelen af beboeren og cirkulerende hemocyte befolkning i Drosophila larve 6, egnede transgener omfatter Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXn -GAL4 16, CRQ-GAL4 (ved H. Agaisse 16) eller eater-GAL4 17; til mærkning af relativt lille population af krystal celler, egnede linjer er BcF6-fælles fiskeripolitik og -GFP 18, eller LZ-GAL4 (ved J. Pollock 19), for mærkning lamellocytes, en specialiseret celletype hovedsageligt fremkaldt af immune udfordringer og skader 13, De må f.eks MSNF9mo-mCherry anvendes 17. Nogle transgene drivere er udtrykt i en række differentieret blodceller og stamceller, såsom han - GAL4 20, som etiketter omkring 80% af alle larver blodceller 20. Bemærk, at i alle tilfælde, hvor der anvendes GAL4 drivere kombination med UAS-GFP eller en anden fluorescerende protein UAS-transgen er påkrævet. I afsnittet Resultater, anvendes denne metode til at overvåge erythrocyttallet og opførsel omsætning i løbet af larveudvikling.
For det andet Hemocyte Forstyrrelse analysen beskriver et foregående trin designet til at løsne residente hæmocytter ved ekstern manipulation, som efterfølgende muliggør evaluering af evnen hæmocytter at re-klæber og hjem til HPS inden for en begrænset tidsramme (30 - 60 min) 6. Typisk dette assay efterfølges af Bleed / skrab assay for at bestemme procentdelen af cirkulerende hæmocytter pr larve. Vi præsenterer en forenklet protokol for denne analyse (figur 1D), som bruger forstyrrelser ved hvirvelbehandling with glasperler, snarere end manipulation af en enkelt larve med en pensel som beskrevet tidligere 6. I afsnittet Resultater er denne analyse bruges til at vise, at forbigående fritliggende hæmocytter flyde i hæmolymfe og kan genfindes i den del af cirkulerende hæmocytter. Analysen er også nyttigt at kvantificere forskelle hæmocytter i deres målsøgende / vedhæftning til hjemmehørende sites, sammenligner fx forskellige genetiske baggrunde eller stimulation betingelser. Bemærk, at denne mekaniske manipulation afspejler en reversibel proces, og er forskellig fra Infektion eller skade-induceret bosiddende hemocyte mobilisering, som typisk ikke er reversible i en kort tidsramme 4,13.
Protocol
1. Hemocyte Bleed / Skrab assay
- Forberedelse af dias:
- Mulighed 1 til mikroskoper uden fliser skannefunktion: For hver larve, der skal analyseres, udarbejde én objektglas med ca. 5 Pap-pen brønde i 2 mm kvadrater, svarende til området synsfelt i et mikroskop; tilføje ca. 5 - 10 pi S2 medier til hver (figur 1A). Hold slides i det fugtige kammer for at forhindre brønde tørrer ud.
- Mulighed 2 for mikroskoper med fliser skannefunktion: For hver larve, der skal analyseres, udarbejde én objektglas med 3 til 4 Pap-pen brønde i ~ 3 - 4 mm firkanter hver; tilføje ca. 15 - 20 pi S2 medier til hver brønd (figur 1B). Hold slides i det fugtige kammer for at forhindre brønde tørrer ud.
BEMÆRK: Ovenstående anbefalede antal brønde er tilstrækkelig til summen af op til 3.000 hæmocytter pr larve (sent 2. instar larver, ~ 2,5-3 mm længde, transgen mærkning størstedelen af Larval blodlegemer). Ved vurderingen af større blodlegemer numre, kan være behov for flere brønde for at undgå over-crowding.
- Indsamling af larver:
- Sprøjte vand i en flue hætteglas indeholdende larver og larver flush i en petriskål, eller øse nogle fødevarer, der indeholder larver i en petriskål og fortyndes med vand ved anvendelse af en sprøjteflaske.
- Forsigtigt plukke larver ud af petriskålen ved hjælp af en pensel og placere dem i vand i et hulrum parabol eller på et dias på en kold blok.
BEMÆRK: Larver kan holdes i en begrænset periode i vand eller på en kold blok; bruge eksemplarer inden for 45 min eller mindre for at undgå larvernes død eller uønskede virkninger på hæmocytter.
- Dissektion:
- Vælg larver under et fluorescensmikroskop på en kold metalblok. Mål størrelser og billede larver, hvis det ønskes.
- Isolering af cirkulerende hæmocytter ("Bleed"):
- Når larverne er valgt, placeres en larve i første Pap-pen godt (figur 1C,2A).
- Bruge 2 rene nåle eller dissekere saks og pincet til at gøre et snit på både de bageste og forreste ende af larve. For at undgå at forstyrre hjemmehørende hæmocytter, er det bedst at gøre disse indsnit på den ventrale side af larve. For ensartede resultater, foretage de snit i de samme steder for hver larve. For 1. instar larver, 1 snit (i ventrale forreste) er tilstrækkelig.
- Tillad larve at bløde i et par sekunder uden tryk eller fysisk omrøring (figur 2A).
BEMÆRK: Hvis arbejder på flere larver er det bedre at gøre disse indsnit for hver en, før man går videre til næste trin for at undgå at holde larver på is for lang hvilket kan påvirke prøverne integritet. - Løft forsigtigt larve med nåle eller pincet og dyppe den i den anden brønd for at skylle eventuelle resterende cirkulerende hæmocytter. Efter dette, skal du følge med udgivelsen af hjemmehørende hæmocytter.
- Overføre forsigtigt larve til næste brønd (figur 2C).
- Identificere lymfeknuder kirtel larve, som typisk ligger ca 1/3 fra den forreste ende af larve, og som kan fluorescere dorsalt gennem larve kropsvæggen. Undgå lymfeknuder kirtel, mens frigive bosiddende hæmocytter ved pinning ned larve med en nål så tæt som muligt til lymfeknuder kirtel at undgå punktering (figur 2C).
BEMÆRK: Under normale udvikling modningen af lymfeknuder kirtel hæmocytter er forsinket i forhold til larver hæmocytter, og fluorescerende indberettere af differentierede hæmocytter muligvis ikke et signal i lymfeknuder kirtel af unge larver. I disse tilfælde skal betales til lymfeknuder kirtel som ingen forurening af differentierede fluorescens-mærkede larval hæmocytter af lymfeknuder kirtel hæmocytter forventes mindre opmærksomhed. - Slip hjemmehørende blodlegemer i en dissectiom processen med at skrabe og / eller jabbing. Brug en Broderi til effektivt pin ned larve nær lymfe kirtel (se ovenfor) eller andre områder af kroppen efter behov. Brug en anden nål til at stikke på klynger af hæmocytter, der er synlige gennem larvestadiet kropsvæggen (figur 2C, E) med henblik på at adskille hæmocytter. Hæmocytter kan også blive frigivet i en skrabende bevægelse. Dog kan rive epidermis tidligt frigive store klynger af blodlegemer, som kunne gøre automatiseret optælling mere udfordrende.
BEMÆRK: Afhængigt af alder og genotype af larve, vil det samlede antal hæmocytter variere. Fordel udgivelsen processen beskrevet ovenfor over flere brønde for at undgå overbelægning af nogle brønde med blodlegemer, som kunne gøre enkelt celle billedanalyse vanskeligere. - Hvis kun få hæmocytter forbliver i den endelige slagtekroppen, tælle disse hæmocytter ved observation gennem mikroskopet og anvendelse af en manuel taelleinstrument (Figur 2E). For at lette optælling, ssnøre slagtekroppen på et rent område af samme glas og sprede det så tyndt som muligt for at reducere antallet af optiske planer.
- Når dissektion er færdig, skal du vente mellem 5 - 10 min for cellerne at afvikle (men ikke nødvendigvis holde sig), før billeddannelse brøndene. Inkubér dias i et fugtigt kammer for at undgå udtørring, og undgå hårdhændet behandling af de dias, der kunne forstyrre afregnet hæmocytter.
BEMÆRK: Når der bestemmer hemocyte tæller, frigives celler ikke fast, og cellerne skal afbildes kort efter dissektion, helst inden for 30 min efter frigivelse fra larve. Afhængigt af mængden af mellem- og celleegenskaber, vil langt de fleste celler har slået sig ned inden for 5 - 10 minutter, hvilket skal bekræftes ved at fokusere gennem optiske planer af mediet i brønden. Dog vil kun en brøkdel af blodceller har levet op til det dias overfladen på dette tidspunkt, et faktum, der skal overvejes, hvis modificere denne protokol for celle fiksering-baserede approaches.
- Tag billeder af afviklede hæmocytter under et fluorescensmikroskop (figur 2B, D, F). Følg med kvantificering af hæmocytter hjælp ImageJ software.
- Forbered billede til ImageJ celletælling algoritme:
- Åbn billede af godt bruge ImageJ: Fil → Åbn → (find filen og vælge).
- Sørg for, at billede (r) er 8-bit eller 16-bit. Juster tærsklen for billedet ved at vælge Billede klik derefter på Juster, og vælg Threshold. Vær opmærksom på "Threshold vindue" (figur 3A).
- Kontroller "Mørk baggrund" valgmulighed. Vælg "røde" og øge den nedre niveau (se sorte pil), indtil hver celle i billedet er markeret med en rød prik (celler, som ikke er dækket vil ses i gråtoner, figur 3B). Da Den lavere tærskelforøges nogle celler bliver umarkeret. Dette kan være indikator for, hvor langt at indstille den laveste tærskel.
BEMÆRK: lejlighedsvis klynger af celler ikke kan løses og vil blive talt som en ved partikel tæller. I sådanne tilfælde kan antallet af celler i en klynge estimeres ved at undersøge billedet (zoom ind hvis nødvendigt) og manuel tælling under anvendelse af et taelleinstrument. Alternativt kan den nedre øges for at løse klynger af celler; eventuelle umarkerede celler som følge af denne manipulation kan derefter tælles ved hjælp af en oversigt tæller.
- Analyser celle nummer ved hjælp ImageJ:
- Start Particle Analyzer at tælle cellerne (figur 3C). Vælg Analyser og klik på Analyser Partikel. Vælge Eventuelt "Overlay konturer" for at se partiklerne algoritmen count (figur 3D). Alternativt sætte en grænse for størrelsen eller pixel område af en enhed (f.eks., Cell, klump af celler, etc.) til algoritmen til at tælle.
- Klik på OK. Observere en oversigt vindue med greven (Figur 3E).
2. Hemocyte Disturbance Assay
- At forstyrre hæmocytter Vælg larver og placere dem i et 2 ml mikrocentrifugerør med ca. 0,5 g glasperler (212 - 600 um), og der tilsættes 0,5 ml vand.
- Vortex røret, i hånden, ved hastighed 10 for 1 min.
- Hent larverne fra glasperlerne ved at spilde indholdet af mikrocentrifugerør i en petriskål og plukke larver med en pensel.
- For inddrivelse fase placere larver i tidligere fremstillede petriskåle med små mængder af flue mad. Tillad larverne at genetablere deres hemocyte mønster for en periode på 45 min eller som ønsket.
BEMÆRK: Kassér enhver larver, der er holdt op med at flytte, da de er døde i processen. Men vi typisk se little skader efter 1 min af vortex (se nedenfor og supplerende figur 1). - Efter tilbagebetalingsperioden, fortsætter med Beskæring / Skrab assay, som beskrevet ovenfor i afsnit 1.
Representative Results
For at illustrere typiske resultater af de beskrevne metoder, vi først brugt Hemocyte Bleed / Skrab Assay at skitsere udviklingen af larver hemocyte numre og deres ophold i løbet af larvernes udvikling (figur 4). Resident og cirkulerende larver hemocyte populationer blev isoleret fra enkelt larver (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP, han-GAL4 at mærke størstedelen af larver hæmocytter) og kvantificeret under anvendelse af ImageJ. Kohorter af larver størrelse 1,2 mm (~ 48 timer AEL eller 1 st instar), 2,5 mm (~ 80 timers AEL eller sent 2. instar), og 3,5 mm (~ 96 timers AEL eller 3. stadiums) blev undersøgt (figur 4) . Hemocyte numre udvidet i løbet af larveudvikling, korrelerer med og overstiger tidligere skøn baseret på lysmikroskopi af farvestof farvede larver 7 og live optælling af fluorescerende protein mærkede hæmocytter gennem larve neglebånd 6. I 1 m instjære larver næsten alle hæmocytter var bosat, mens den del af cirkulerende hæmocytter progressivt øges i løbet af larvernes udvikling (figur 4B, C), i overensstemmelse med tidligere udgivelser 6,7.
Næste vi undersøgt, om metoden trofast overvåger overgang hæmocytter mellem beboeren og cirkulerende befolkninger. Drage fordel af det fænomen, at hjemmehørende hæmocytter kan forbigående løsrevet ved mekanisk forstyrrelse og de re-holde sig til deres bopæl sites spontant 6, vi spredt bosiddende hæmocytter ved vortex med glasperler som beskrevet i Hemocyte Forstyrrelse analysen. Faktisk mekanisk forstyrrelse af larver ført til en dramatisk stigning i populationen af cirkulerende hæmocytter på bekostning af hjemmehørende hæmocytter (figur 5). Efter et opsving periode på 45 minutter, havde hæmocytter stort set vendt tilbage til deres klæbende tilstand, både ved visuel inspektion og af såderet procentdel af cirkulerende celler (figur 5D, E). Som forventet forblev samlede hemocyte numre stabil over tid, på trods af skiftet i hæmocytter mellem de cirkulerende og bosiddende befolkninger.
Adskillige yderligere overvejelser blev taget i betragtning. At bekræfte, at vortexing ikke forårsage væsentlig vævsbeskadigelse, vortexbehandling med glasperler blev udført i nærvær af trypanblåt (Sigma) i forskellige tidsperioder (1, 5, 20 min). Både 1 og 5 min hvirvelbehandling forårsagede ikke nogen åbenbar vævsødelæggelse, mens 20 min hvirvelbehandling resulterede i små områder med skader, der ligner skader forårsaget af nål sting anvendt som positiv kontrol (Supplemental Figur 1). Mens indre forringelser af epidermis eller andre væv uden neglebånd skader ikke kan udelukkes, synes snarere usandsynligt som hæmocytter på 1 min og 5 min-behandlet larver re-klæbet i det forventede mønster og tidsramme dette scenario, hvilket tyder på larvernes integritet ikke var kompromisd (Supplemental Figur 1). I modsætning hertil larver hvirvelbehandlet i 20 min lidt under mangel på re-vedhæftning, og ikke engang vise binding af cirkulerende hæmocytter til epidermale sårsteder, som det er blevet beskrevet tidligere 14.
Endelig at påvise metodens reproducerbarhed, sammenlignede vi biologiske replikater af 2,5 mm larver fra de to ovennævnte forsøg, der blev udført af særskilte experimenters. Som illustreret i figur 2 Supplemental begge kohorter viste sammenlignelige samlede antal hæmocytter pr larve, og procentdelen af cirkulerende hæmocytter. Students t test viste ingen statistisk signifikante forskelle, hvilket tyder på, at metoden er reproducerbar og bredt anvendelig.
Figur 1. Hemocyte Bleed / Skrab og forstyrrelser Assay s etup og skematisk. (A) enkelt billede Slide Opsætning: fem 2mm firkanter til billeddannelse med en 5X målsætning (B) Tile Scan Slide Opsætning:. Fire 3 mm firkanter til billeddannelse bløder / skrammer på ≤2.5 mm larver med en flise scanning mikroskop. Anbefalede mål for billeddannelse er 5X eller 10X. (C) Bleed / Skrab assay skematiske og resulterende kvantificeringer hjælp ImageJ. (D) I Forstyrrelse Assay er hemocyte mønster mekanisk forstyrret af vortexbehandling larver med glasperler. Larver lov til at restituere i et tidsrum på 45 min, hvorunder hæmocytter fornyet overholde de hæmatopoietiske lommer. De klæbende egenskaber hæmocytter kan vurderes ved denne metode, kvantificering procentdelen af hæmocytter i omløb efter forstyrrelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bleed / Skrab Assay til at frigive cirkulerende og bosiddende hæmocytter. (A) For at bløder en larve, der ventrale snit ved den bageste og forreste ende af larve gjort (saks symbol). (B) hæmocytter i omløb vil fragå indsnit og sætte sig på overfladen af dias. (C) lymfeknuder kirtel (LG) er placeret og holdt nede, uden at punktere den. Resident hæmocytter frigives ved jabbing og / eller skrabe larve med en nål. (D) Resident hæmocytter på dias. (E, F) Den Skrab proces gentages, indtil alle bosiddende hæmocytter frigives. Den larver slagtekrop, der indeholder den intakte lymfeknuder kirtel er efterladt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Automatiseret kvantificering af hæmocytter ved hjælp ImageJ. (A, B) Efter åbning en hemocyte billedfil i ImageJ, Lower Threshold niveauet justeres for at tage højde for alle de celler i billedet. (C, D) Analyser Partikler kræver indstilling af cellen pixelstørrelse, cirkularitet, og resultatet udlæsning format (f.eks Overlay konturer). (E) vinduet Oversigt viser antallet af hæmocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative resultater (1). Hemocyte nummer og bopæl tilstand over løbet af larveudvikling. (A) Overblik over larvestadierne anvendte 1. instar (48 timer AEL, ~ 1,2 mm længde); 2. instar (80 timers AEL, 2,5 mm længde); 3. stadiums (96 timers AEL, ~ 3,5 mm længde). Genotype er Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Han-GAL4. Stages blev bekræftet ved at vurdere larval mouthhooks. (B) Bar diagram af cirkulerende og bosat hemocyte numre på de respektive larvestadier. (C) Procentdel af cirkulerende hæmocytter. Bemærk, at den del af cirkulerende hæmocytter stiger uforholdsmæssigt i løbet af larveudvikling. (D) Total hæmocytter, der fremkommer som summen af cirkulerende og bosiddende hæmocytter pr larve. Hæmocytter blev kvantificeret ved hjælp af Beskæring / Skrab metode; n ≥ 6 larver / tilstand, fejlsøjler viser standardafvigelsen, fund bekræftet i 3 uafhængige gentagne eksperimenter.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative resultater (2). Effekter af mekanisk forstyrrelse på hemocyte bopæl. (AC) Eksempel på en larve før og efter vortexbehandling med glaskugler, efterfulgt af 45 min nyttiggørelse (A) ingen forstyrrelse kontrol.; hæmocytter er lokaliseret i Hæmatopoietiske Lommer (B) Forstyrret hemocyte mønster ved 0 min efter vortexbehandling larver i en suspension af glasperler og vand (C) Hemocyte mønster på 45 min for inddrivelse efter forstyrrelser..; mange hæmocytter har flyttet til de hæmatopoietiske lommer; Bemærk forstørret dorsal-fartøj tilknyttede klynger og dorsale striber, som er fremherskende steder for tidlig post-forstyrrelse akkumulation (pile). Genotype er Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Han-GAL4 x yw. (D) Procentdel af cirkulerende hæmocytter kvantificeret af Beskæring / Skrab metode. (E) Total hæmocytter, der fremkommer som summen af cirkulerende og bosiddende hæmocytter pr larve. n ≥ 4 larver / tilstand, fejlsøjler viser standardafvigelsen, fund bekræftet i 3 uafhængige gentagne eksperimenter. T-test for at bekræfte signifikans, NS (ikke signifikant), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi den første metode til kvantitativ genvinde hjemmehørende og cirkulerende blodceller fra enkelt Drosophila larver, og kvantificere disse to hemocyte befolkninger. Protokollen omfatter den sekventielle frigivelse af cirkulerende og bosiddende blodceller, efterfulgt af billedbehandling og automatiseret celletælling. Larver hjemmehørende hæmocytter kan forbigående mobiliseres i omløb af mekanisk forstyrrelse, en proces, der er kendt for at være stort set vendt inden for en 30-60 min restitutionsperiode 6. Følgelig blev denne protokol testet på to måder: (1) ved at vurdere det samlede hemocyte antal pr larve og fraktion af cirkulerende hæmocytter løbet af larveudvikling, og (2) ved eksperimentelt at løsne residente hæmocytter anvendelse af en automatiseret fremgangsmåde, som bekræftede stram korrelation af hemocyte lokalisering og hemocyte nummer i hjemmehørende og cirkulerende befolkninger. Desuden blev reproducerbarheden af fremgangsmåden påvises ved comparing to datasæt af biologiske gentagelser.
Tidligere har laboratorier anvendt en række teknikker til at kvantificere larvernes hæmocytter 6,13,21. Denne protokol fastlægges en fælles standard for at hente og kvantificere hjemmehørende og cirkulerende blod cellepopulationer fra Drosophila larver, hvilket giver en let at tilpasse platform. Den beskrevne metode er afgørende for undersøgelser, der fokuserer på den rolle, som hjemmehørende hæmocytter og deres mikromiljø, hæmatopoietisk Pockets 4-6, og er velegnet til at studere fluorescerende protein transgene-transporterer Drosophila stammer i vildtype og genetisk modificerede baggrunde. Protokollen er også relevant for undersøgelser, der fokuserer på hemocyte mobilisering efter immun udfordring eller skade, og genetisk eller miljømæssigt induceret signalering, der udløser mobilisering af hjemmehørende hæmocytter eller ændringer i den samlede hemocyte nummer (revideret i 4). Det skal bemærkes, at i tilfælde af for tidlig differentiation og frigivelse af hæmocytter fra lymfe kirtel, idet der skelnes embryonale / larver versus lymfeknuder kirtel slægter kan være begrænset af udtrykket mønster af fluorescerende hemocyte reporter anvendes.
Protokollen præsenteres her bygger på billedbehandling levende, fluorescens-mærkede hæmocytter. I fremtiden kan det modificeres for at tillade detektion af de frigivne celler efter fiksering, f.eks, ved hjælp af immuncytokemi. I dette tilfælde kan protokollen skal tilpasses for at sikre fuldstændig adhæsion af blodlegemer, for eksempel ved at øge adhæsion inkubationstider og tilsætning klæbende glassets belægning, såsom concanavalin A. Da metoden tillader udtagning af hæmocytter og deres manipulation ex vivo, vil det gavne en lang række udviklingsmæssige, cellebiologiske og biokemiske undersøgelser. Resident og cirkulerende blodceller findes i alle postembryonic udviklingsmæssige stadier af Drosophila og andre hvirvelløse dyr 22, suggesting, at tilpasningen af denne metode vil gavne en bred vifte af undersøgelser uden for Drosophila larve hæmatopoietiske system.
Acknowledgments
Vi takker Jesper Kronhamn og Dan Hultmark, Michael Galko, og Bloomington Stock Center for flyve bestande. Særlig tak til Courtney Onodera for rådgivning med statistisk analyse. Vi takker Katrina Guld til kritisk læsning af manuskriptet, og Kalpana Makhijani, Katrina Gold, medlemmer af Derynck laboratorium og medlemmer af Nystul laboratorium for diskussion og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra UCSF Program for Gennembrud Biomedical Research (PBBR), Bred Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 og 1R56HL118726-01A1 (i KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
