Abstract
Em vertebrados, hematopoiese é regulada por microambientes indutivas (nichos). Do mesmo modo, no modelo de invertebrados organismo Drosophila melanogaster, microambientes indutivas conhecidos como Pockets hematopoéticas larvais (HPs) foram identificados como sítios anatômicos para o desenvolvimento e regulação de células sanguíneas (hemócitos), em particular da linhagem de macrófagos auto-renovação. HPs são segmentalmente repetido bolsas entre a epiderme e camadas de músculo da larva, que também compreendem os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. No larva, residentes (séssil) hemócitos são expostas a anti-apoptótica, adesivo e sinais proliferativos a partir destes neurónios sensoriais e potencialmente outros componentes dos hps, tais como o músculo e as camadas de revestimento epiteliais. Durante o desenvolvimento normal, liberação gradual de hemócitos residentes dos combustíveis HPs a população de hemócitos circulantes, que culmina com a liberação de most dos hemócitos residentes no início da metamorfose. Assaltos imunológico, danos físicos ou perturbação mecânica desencadear a liberação prematura de hemócitos residentes em circulação. O interruptor de hemócitos entre larvas locais residentes e circulação aumenta a necessidade de uma norma / procedimento comum para isolar selectivamente e quantificar essas duas populações de células sanguíneas a partir de larvas Drosophila único. Por conseguinte, este protocolo descreve um método automatizado para liberar e quantificar o residente e hemócitos circulantes do único larvas. O método facilita abordagens ex vivo, e pode ser adaptado para servir uma variedade de fases de desenvolvimento da Drosophila e outros organismos invertebrados.
Introduction
Pesquisa no modelo de invertebrados Drosophila melanogaster tem impulsionado a descoberta de uma imunidade inata, e facilitou a compreensão dos vários aspectos do desenvolvimento de células do sangue 2-4. Drosophila hematopoiese podem ser divididos em linhagem de hemócitos embrionários / larvas, que se originam no embrião e expandir no larva, e da linhagem de glândula linfática Hemócitos 4,5. Aqui, apresentamos um protocolo que incide sobre a linhagem de hemócitos embrionários / larval, que no larva Drosophila compreende principalmente plasmatócitos (macrófagos) e algumas células de cristal 4. Na larva, hemócitos do embrião persistem e colonizam segmentally repetidas e terminais Pockets hematopoéticas (SPH), localizado entre a epiderme e camadas musculares da parede do corpo larval 5,6. Com base na sua natureza de auto-renovação macrófagos 6, a sua residência predominante no microambiente do tecido 6 locais, 7, e as suas linhagens de células sanguíneas primeiros emergentes durante o desenvolvimento 6,8, esta população de células de sangue é considerada semelhante aos macrófagos de tecidos de vertebrados auto-renovação, uma linhagem mielóide independente recentemente identificados numa variedade de espécies 4,9,10. No entanto, em Drosophila, algumas ou todas estas células residentes, também apresentam plasticidade para dar origem a outros tipos de células do sangue, tais como células de cristal 11,12.
Hemócitos larvais são predominantemente residente (sessile), mas estão em um estado estacionário dinâmico entre vários HPs. Eles estão progressivamente liberada na circulação, em particular, como a instar larva 3º aproxima pupariation 5-7. Desafios imunológicos, lesão ou perturbação vantagem mecânica para um prematuro, neste último caso reversíveis, mobilização de hemócitos residentes na hemolinfa 4,6,13.
Estudos anteriores sugeriram que residem e circulamhemócitos larvas são da mesma linhagem, mas diferem nas suas propriedades adesivas ou homing 6,7,13,14. Isolamento selectivo de circulantes contra hemócitos residentes revelou níveis elevados de proliferação na população de hemócitos residente, sugerindo a sua exposição a estímulos indutores de os HPs larvares da HP 6. Drosophila são revestidas por epiderme e camadas musculares e ainda abrigam conjuntos de neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico (PNS) e função hepática que se assemelha oenocytes 6. Funcionalmente, experimentos de ablação de células mutantes e genéticos demonstraram que os neurônios sensoriais presentes nas HPs suportar a sobrevivência trófica e localização de hemócitos larvais 6.
Aqui nós descrevemos um método para o isolamento específica e quantificação de residente e hemócitos circulantes de larvas Drosophila single, e um protocolo de mobilização hemócito mecânica. Os métodos podem ser utilizados para o ex vivoestudo de hemócitos e pode ainda ser adaptado para outras fases de desenvolvimento de Drosophila, tais como a pupa e do adulto, e outros sistemas de invertebrados. Uma vez que estudos anteriores não fez distinção entre residentes e hemócitos circulantes, este protocolo prevê uma norma comum para o estudo de células sanguíneas residentes e vai ajudar a aumentar a consistência da pesquisa com células do sangue de invertebrados.
Primeiro, o hemócito sangramento / Raspe Ensaio descreve o isolamento diferencial e quantificação automática de residente marcado proteína fluorescente e populações hemócitos de larvas Drosophila único de circulação; o protocolo fornece duas opções para digitalizar microscópios equipados regulares e telha (Figura 1). Como resultado, a percentagem de hemócitos circulantes e o número total de hemócitos por larva são obtidos. O método baseia-se em larvas de Drosophila transgênicos que expressam a proteína fluorescente entre seu glóbulopopulação. A escolha do condutor de hemócitos ou repórter determina o resultado, ou seja, qual a população de células de sangue é visualizado e quantificado. Para etiquetar principalmente macrófagos (plasmatócitos), que constituem a vasta maioria da população circulante residente e hemócitos da larva Drosophila 6, os transgenes adequados incluem Hml Δ DsRed-6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 (por H. Agaisse 16), ou comedor-GAL4 17; para rotular a população relativamente pequena de células de cristal, linhas adequadas são BcF6-PCP e -GFP 18, ou LZ-GAL4 (por J. Pollock 19); para lamellocytes de rotulagem, um tipo de célula especializada induzida principalmente por desafios e lesões imunológicas 13, por exemplo, MSNF9mo-mCherry pode ser utilizado 17. Alguns controladores transgénicos são expressos numa variedade de sangue diferenciadae células progenitoras, tais como ele - 20 de GAL4, que rotula cerca de 80% de todas as células sanguíneas larvais 20. Por favor, note que em todos os casos em que são utilizados os motoristas GAL4, combinação com UAS-GFP ou outra proteína fluorescente UAS-transgene é necessária. Na secção de resultados, esse método é utilizado para monitorizar o número de células de sangue e o comportamento da circulação ao longo do desenvolvimento das larvas.
Em segundo lugar, o hemócitos Perturbação Ensaio descreve um passo anterior concebido para separar hemócitos residentes por manipulação externa, que, posteriormente, permite a avaliação da capacidade de hemócitos para re-aderir e casa a HPS dentro de um período de tempo limitado (30 - 60 min) 6. Tipicamente, neste ensaio é seguido pela sangrada / Raspe Ensaio para se determinar a percentagem de hemócitos em circulação por larva. Nós apresentamos um protocolo simplificado para este ensaio (Figura 1D), o qual utiliza perturbação por vórtice witgrânulos de vidro h, em vez de manipulação de larva único com um pincel como descrito anteriormente 6. Na secção de resultados, este ensaio é utilizado para demonstrar que transitoriamente individual flutuador hemócitos na hemolinfa e pode ser recuperado na fracção de hemócitos circulantes. O ensaio também é útil para quantificar as diferenças de hemócitos em sua homing / adesão a sites residentes, comparando, por exemplo, vários fundos genéticos ou condições de estimulação. Por favor, note que esta manipulação mecânica reflete um processo reversível e é distinta da mobilização hemócito residente Infecção- ou induzida por lesão, que normalmente não são reversíveis em um curto espaço de tempo 4,13.
Protocol
1. hemócito sangramento / Raspe Assay
- Preparação de lâminas:
- Opção 1 para microscópios de varrimento sem a função da telha: Para cada larva a ser analisado, preparar uma lâmina de vidro com cerca de 5 poços Pap-pen de 2 mm quadrados cada um, que corresponde à área de visualização do campo do microscópio; adicionar cerca de 5 - 10 ul de meio para cada S2 (Figura 1A). Mantenha as lâminas em câmara úmida para evitar poços sequem.
- Opção 2 para microscópios com função de digitalização telha: Para cada larva a ser analisado, preparar uma lâmina de vidro com 3 a 4 Pap-pen ~ poços de 3 - 4 mm quadrados cada; adicionar cerca de 15 - 20 ul de meios S2 para cada poço (Figura 1B). Mantenha as lâminas em câmara úmida para evitar poços sequem.
NOTA: O número acima do recomendado de poços é suficiente para os totais de até 3.000 hemócitos por larva (tarde larvas 2º, ~ 2,5-3 mm de comprimento, transgene rotular a maioria dos LarVai células do sangue). Ao avaliar o número de células no sangue maiores, mais poços podem ser necessários para evitar a superlotação.
- Coleção de larvas:
- Esguichar água em um frasco contendo larvas de mosca e lave larvas em uma placa de Petri, ou colher algum alimento que contém larvas em uma placa de Petri e diluir com água usando uma garrafa de esguicho.
- Gentilmente pegar larvas fora da placa de Petri usando um pincel e colocá-los em água em um prato de cavidade ou em um slide em um bloco frio.
NOTA: As larvas podem ser mantidos por um tempo limitado em água ou em um bloco de frio; utilizar amostras no prazo de 45 minutos ou menos para evitar a morte das larvas ou efeitos indesejados sobre hemócitos.
- Dissecção:
- Selecione larvas sob um microscópio de fluorescência em um bloco de metal frio. Tamanhos e larvas imagem medir se desejado.
- Isolamento de hemócitos circulantes ("Bleed"):
- Uma vez que as larvas são selecionados, coloque uma larva no primeiro Pap-caneta bem (Figura 1C,2A).
- Use 2 agulhas limpas ou dissecando tesouras e pinças para fazer uma incisão em ambas as extremidades posterior e anterior da larva. Para evitar perturbar hemócitos residentes, é melhor para fazer estas incisões no lado ventral da larva. Para obter resultados consistentes, fazer as incisões nas mesmas localizações para cada larva. Para 1º larvas, uma incisão (no anterior ventral) é suficiente.
- Permitir que a larva sangrar durante alguns segundos sem qualquer pressão ou agitação física (Figura 2A).
NOTA: Se trabalhando em larvas múltipla é melhor para fazer essas incisões para cada um deles antes de prosseguir para o próximo passo para evitar manter larvas no gelo por muito tempo o que poderia afetar a integridade das amostras. - Levante cuidadosamente a larva com as agulhas ou pinças e mergulhe-o no segundo poço para lavar quaisquer hemócitos circulantes restantes. Depois disso, siga com a liberação de hemócitos residentes.
- Suavemente transferir a larva para o poço seguinte (Figura 2C).
- Identificar o gânglio linfático da larva, que, tipicamente, situa-se aproximadamente igual a 1/3 da extremidade anterior da larva, e que pode fluorescer dorsalmente através da parede do corpo larval. Evite a glândula linfática ao liberar hemócitos residentes por fixar para baixo a larva com uma agulha tão perto quanto possível da glândula linfática para evitar a perfuração (Figura 2C).
NOTA: Durante o desenvolvimento normal da maturação de hemócitos glândula linfática está atrasado em comparação com hemócitos de larvas, e os repórteres fluorescentes de hemócitos diferenciadas não podem mostrar um sinal na glândula linfática de larvas jovens. Nesses casos, menos atenção tem de ser pago ao gânglio linfático como nenhuma contaminação dos diferenciados hemócitos larvais fluorescência-rotulados por hemócitos dos gânglios linfáticos é esperado. - Solte glóbulos residentes em um dissectino processo de raspagem e / ou espetando. Utilize uma tapeçaria de fixar eficazmente a larva para baixo perto do gânglio linfático (ver acima) ou outras áreas do corpo, conforme necessário. Utilize outra agulha para espetar na aglomerados de hemócitos que são visíveis através da parede do corpo larval (Figura 2C, E), com o objetivo de separar os hemócitos. Hemócitos também pode ser liberado em um movimento de raspagem. No entanto, rasgando a epiderme precoce pode liberar grandes aglomerados de células do sangue, o que poderia fazer a contagem automatizada mais desafiador.
NOTA: Dependendo da idade e do genótipo da larva, o número total de hemócitos irá variar. Distribua o processo de liberação acima descrito ao longo de vários poços para evitar a superlotação de alguns poços com células do sangue, o que poderia fazer análise de imagem única célula mais difícil. - Se alguns hemócitos permanecer na carcaça final, contar estes hemócitos por observação através do microscópio e uso de um contador de contagem manual (Figura 2E). Para facilitar a contagem, pate a carcaça numa área limpa do mesmo deslize e espalhá-lo tão fina quanto possível para reduzir o número de planos ópticos.
- Uma vez que a dissecção é completa, esperar entre 5 - 10 min para as células para resolver (mas não necessariamente aderir) antes de imagem dos poços. Incubar as lâminas em câmara úmida para evitar a secagem, e evitar o manuseio brusco dos slides, que poderia perturbar os hemócitos assentadas.
NOTA: Quando determinam a contagem de hemócitos, as células liberadas não são fixos e as células devem ser fotografada logo após a dissecação, de preferência dentro de 30 minutos após o lançamento da larva. Dependendo do volume e das propriedades médias de células, a grande maioria das células vai ter resolvido dentro de 5 - 10 min, o que deve ser confirmado, concentrando-se através dos planos ópticos do meio no poço. No entanto, apenas uma fracção das células do sangue irá ter aderido à superfície da lâmina por esta altura, um facto que tem de ser considerada se modificando este protocolo para approache baseada-fixação das célulass.
- Tome imagens dos hemócitos assentadas sob um microscópio de fluorescência (Figura 2B, D, F). Siga com quantificação de hemócitos usando software ImageJ.
- Prepare imagem para ImageJ algoritmo de contagem de células:
- Abrir imagem de bem usando ImageJ: Arquivo → Abrir → (localizar arquivo e selecione).
- Assegure-se que a imagem (s) é de 8 bits ou 16 bits. Ajuste o limiar para a imagem selecionando Imagem, em seguida, clique em Ajustar e selecione Threshold. Observe a "janela Threshold" (Figura 3A).
- Marque a opção "Background Dark". Selecione "Red" e aumentar o limiar mais baixo nível (ver seta preta) até que cada célula na imagem está marcado com um ponto vermelho (células que não estão sendo cobertos serão vistos em escala de cinza; Figura 3B). À medida que o limiar mais baixoé aumentada algumas células se tornará não marcado. Este pode ser o indicador de quão longe para definir o limiar mais baixo.
NOTA: Ocasionalmente aglomerados de células não pode ser resolvido e seria contado como um pelo contador de partículas. Em tais casos, o número de células em um cluster pode ser estimado por análise de imagem (zoom e, se necessário) e a contagem manual utilizando um contador de contagem. Alternativamente, o limite mais baixo pode ser aumentada para resolver os conjuntos de células; quaisquer células não marcadas resultantes desta manipulação pode então ser contadas utilizando um contador de contagem.
- Analisar o número de células usando ImageJ:
- Inicie o Analisador de Partículas para contar as células (Figura 3C). Selecione Analisar e clique em Análise de Partículas. Opcionalmente, selecione "Overlay Contornos" para ver as partículas a contagem algoritmo (Figura 3D). Em alternativa, define um limite para o tamanho do pixel ou área de uma unidade (por exemplo,., Celular, aglomerado de células, etc.) para o algoritmo para contar.
- Clique em OK. Observe uma janela de resumo com a contagem (Figura 3E).
2. hemócito Disturbance Assay
- Para perturbar hemócitos, seleccione larvas e colocá-los num tubo de microcentrifugação de 2 ml com cerca de 0,5 g de esferas de vidro (212 - 600 um) e adicionar 0,5 ml de água.
- Vortex do tubo, por lado, a uma velocidade de 10 durante 1 min.
- Recuperar as larvas a partir das pérolas de vidro por derramar o conteúdo do tubo de microcentrífuga para uma placa de Petri e escolhendo as larvas com um pincel.
- Para a fase de recuperação, larvas colocar em placas de Petri previamente preparadas com pequenas quantidades de comida mosca. Permitir que as larvas para re-estabelecer o seu padrão de hemócitos durante um período de 45 minutos ou se o desejar.
NOTA: Elimine qualquer larvas que tenham parado de se mover, como eles morreram no processo. No entanto, se costuma ver ldanos ittle após 1 min de agitação em vórtex (veja abaixo suplementar e Figura 1). - Após o período de recuperação, continue com o sangramento / Raspe Ensaio como descrito acima na Seção 1.
Representative Results
Para ilustrar resultados típicos de métodos descritos, primeiro usamos o hemócito sangramento / Raspe Ensaio para delinear a progressão de números de hemócitos larvais e à sua residência, ao longo do desenvolvimento larval (Figura 4). Residente e populações de larvas de hemócitos circulantes foram isolados a partir único larvas (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 para rotular a grande maioria dos hemócitos larval) e quantificada utilizando ImageJ. Coortes de larvas de tamanho 1.2 mm (~ 48 AEL h ou 1 r instar), 2,5 mm (~ 80 h AEL ou tardia 2º instar), e 3,5 mm (~ 96 h AEL ou 3 rd instar) foram examinados (Figura 4) . Números de hemócitos expandido ao longo do desenvolvimento larval, correlacionando-se com e superando as estimativas anteriores com base em microscopia de luz de corante manchado larvas 7 e contando ao vivo da proteína marcada hemócitos fluorescentes através da cutícula larval 6. Em 1º inslarvas de alcatrão de quase todos os hemócitos foram residente, enquanto que a fracção de hemócitos circulantes progressivamente aumentada durante o curso do desenvolvimento larvar (Figura 4B, C), consistente com publicações anteriores 6,7.
Em seguida, examinou se o método monitora fielmente a transição de hemócitos entre a residentes e populações circulantes. Aproveitando-se do fenômeno que hemócitos residentes podem ser transitoriamente destacado por perturbação mecânica e eles re-aderir a seus locais residentes espontaneamente 6, que dispersa hemócitos residentes em vortex com contas de vidro, conforme descrito na hemócito Disturbance Ensaio. Com efeito, a perturbação mecânica das larvas levou a um aumento dramático na população de hemócitos em circulação à custa de hemócitos residentes (Figura 5). Depois de um período de recuperação de 45 min, em grande parte hemócitos tinha retornado ao seu estado aderente, tanto por inspeção visual e pelo comoliada percentagem de células em circulação (Figura 5D, E). Como esperado, o número total de hemócitos manteve-se estável ao longo do tempo, apesar da mudança de hemócitos entre as populações que circulam e residentes.
Várias considerações adicionais foram tomadas em consideração. Para confirmar que vórtice não causar danos nos tecidos principais, vortex com esferas de vidro foi realizada na presença de azul de tripano (Sigma) durante vários períodos de tempo (1, 5, 20 min). Ambos 1 e 5 min vórtice não provocar qualquer disrupção óbvia do tecido, enquanto vórtex 20 min resultou em pequenas áreas de danos, assemelhando-se os danos causados por pontos de agulha utilizadas como controlo positivo (Figura Suplementar 1). Enquanto danos internos da epiderme ou outros tecidos sem danos cutícula não pode ser excluída, este cenário parece bastante improvável como hemócitos de 1 min e 5 re-aderidas larvas tratadas-mínimo no modelo esperado e período de tempo, o que sugere integridade larval não foi compromissod (Figura Suplementar 1). Em contraste, as larvas vórtex durante 20 min sofrido com a falta de re-adesão, e nem sequer mostram a ligação de hemócitos em circulação para locais de feridas epidérmicas, como foi descrito anteriormente 14.
Por último, para demonstrar a reprodutibilidade do método, foram comparados réplicas biológicas de 2,5 mm larvas das duas experiências acima, os quais foram conduzidos por experimentadores distintas. Como ilustrado na Suplementar Figura 2, ambos os grupos apresentaram números totais comparáveis de hemócitos por larva, eo percentual de hemócitos circulantes. Teste t de Student não mostraram diferenças estatisticamente significativas, o que sugere que o método é reprodutível e amplamente aplicável.
Figura 1. hemócito sangramento / Raspe e Disturbance Ensaio s etup e esquemático. (A) Imagem Única Deslize instalação: cinco quadrados de 2 mm para imagens com um objetivo 5X (B) telha Slide Setup da varredura:. Quatro quadrados 3 mm de sangria de imagem / arranhões de ≤2.5 larvas mm com um microscópio de varredura telha. Objetivos recomendadas para imagens são 5X ou 10X. (C) Sangre / Raspe Ensaio quantificações esquemáticos e resultantes usando ImageJ. (D) No Disturbance Assay, o padrão de hemócitos é interrompido mecanicamente em vortex larvas com contas de vidro. As larvas são deixados a recuperar durante um período de 45 minutos durante o qual re-hemócitos aderir aos bolsos hematopoiéticas. As propriedades adesivas de hemócitos pode ser avaliada por este método, quantificar a porcentagem de hemócitos em circulação após a perturbação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Sangramento / Raspe Ensaio para liberar hemócitos circulantes e residentes. (A) a sangrar uma larva, as incisões ventral com as posterior e anterior extremidades da larva são feitas (tesoura símbolo). (B) Hemócitos em circulação irá fluir para fora das incisões e assentar sobre a superfície da lâmina. (C) A glândula linfática (LG) é localizado e preso, sem sua punção. Hemócitos residentes são liberados por espetando e / ou raspando a larva com uma agulha. Hemócitos (D) residentes no slide. (E, F) O processo é repetido até que Raspe todos os hemócitos residentes são liberados. A carcaça larval contendo o gânglio linfático intacto é deixado para trás. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. automatizado quantificação de hemócitos utilizando o ImageJ. (A, B) Depois de abrir um arquivo de imagem de hemócitos em ImageJ, o nível de limiar inferior é ajustado para ter em conta todas as células na imagem. (C, D) Analisar partículas exige definir o tamanho do pixel celular, circularidade, ea leitura de resultado formato (por exemplo, sobreposição de contornos). (E) Resumo janela exibindo o número de hemócitos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os resultados representativos (1). Número de hemócitos e estado residente sobre o curso do desenvolvimento das larvas. (A) Visão geral das fases larvares utilizados; 1º instar (48 hr AEL; ~ 1,2 milímetros de comprimento); 2º instar (80 hr AEL; 2,5 mm de comprimento); 3º instar (96 hr AEL; ~ 3,5 mm de comprimento). A genotipagem é Hml Δ-GAL4 UAS-GFP; He-GAL4. Estágios foram confirmados por avaliar mouthhooks larvares. (B) diagrama Bar de circular e números de hemócitos residente nas respectivas fases larvares. (C) Percentagem de hemócitos circulantes. Note-se que a fracção de hemócitos em circulação aumenta desproporcionalmente ao longo do desenvolvimento das larvas. (D) Total de hemócitos, resultante da soma de circular e hemócitos residentes por larva. Hemócitos foram quantificados utilizando o método de sangria / Raspe; n ≥ 6 larvas / condição, barras de erro mostram o desvio padrão, resultados confirmados em 3 experiências duplicadas independentes.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os resultados representativos (2). Efeitos da perturbação mecânica em hemócitos residência. (AC) Exemplo de uma larva antes e depois vortex com contas de vidro, seguido por 45 min de recuperação (A) no controle de distúrbios.; hemócitos são localizadas em bolsos hematopoéticas (B) padrão hemócitos de Perturbação a 0 min após vortex larvas em uma suspensão de contas de vidro e água (C) padrão hemócito a 45 min de recuperação pós-perturbação..; muitos hemócitos foram realocados para os bolsos hematopoéticas; Observe alargada dorsal do navio de grupos ligados, e as listras dorsais que são os locais predominantes de acumulação pós-perturbação cedo (setas). A genotipagem é Hml Δ-GAL4 UAS-GFP; He-GAL4 x yw. (D) Percentagem de hemócitos quantificados pelo método de sangria / Raspe circulante. (E) Total de hemócitos, resultante da soma de circular e hemócitos residentes por larva. n ≥ 4 larvas / condição, barras de erro mostram o desvio padrão, resultados confirmados em 3 experiências duplicadas independentes. O teste t de Student para confirmar significado, NS (não significativa), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui, descrevemos o primeiro método para recuperar quantitativamente células sanguíneas residentes e que circulam a partir de larvas Drosophila único, e quantificar essas duas populações hemócitos. O protocolo compreende a libertação sequencial de circulação e residentes células do sangue, seguido por imagem e contagem de células automatizado. Hemócitos residentes larval pode ser transitoriamente mobilizados em circulação por perturbação mecânica, um processo que é conhecido por ser em grande parte revertida dentro de um 30 - período de recuperação min 60 6. Assim, o protocolo foi testado em duas formas, (1), avaliando o número total de hemócitos por larva e fracção de circulação de hemócitos ao longo do desenvolvimento das larvas, e (2) pelo experimentalmente desalojar hemócitos residentes utilizando um método automatizado, o que confirmou a estreita correlação da localização e número de hemócitos hemócitos na populações residentes e circulantes. Além disso, a reprodutibilidade do método foi demonstrada por comparing dois conjuntos de dados de repetições biológicas.
No passado, os laboratórios têm usado uma variedade de técnicas para quantificar hemócitos larval 6,13,21. Este protocolo estabelece um padrão comum para recuperar e quantificar populações de células do sangue e residentes que circulam a partir de larvas Drosophila, fornecendo uma plataforma facilmente adaptável. O método descrito é fundamental para estudos que enfocam o papel dos hemócitos residentes e seu microambiente, o Hematopoietic Pockets 4-6, e é adequado para estudar estirpes de Drosophila proteína fluorescente portadores de transgene em tipo selvagem e origens geneticamente modificados. O protocolo também é relevante para os estudos que incidem sobre a mobilização de hemócitos após o desafio imunológico ou lesão, e sinalização induzida geneticamente ou ambientalmente que desencadeia a mobilização de hemócitos residentes ou mudanças no número de hemócitos total (revisto em 4). Deve notar-se que, em casos de di prematurafferentiation e liberação de hemócitos da glândula linfática, distinguindo embrionário / larval contra linhagens dos gânglios linfáticos pode ser limitada pelo padrão do repórter hemócito fluorescente usada expressão.
O protocolo aqui apresentado baseia-se na imagem ao vivo, hemócitos fluorescentemente marcados. No futuro, pode ser modificada para permitir a detecção de células libertadas após a fixação, por exemplo, usando imunocitoquímica. Neste caso, o protocolo pode necessitar de ser adaptados para assegurar a aderência completa das células sanguíneas, por exemplo, aumentando os tempos de incubação de adesão, e a adição de revestimento da lâmina adesiva, tal como concanavalina A. Uma vez que o método permite a recuperação de hemócitos e sua manipulação ex vivo, que irá beneficiar de uma ampla gama de estudos biológicos e bioquímicos de desenvolvimento, de células. Células residentes e do sangue circulante são encontrados durante todas as etapas pós-embrionário de desenvolvimento da Drosophila e outros invertebrados 22, suggesting que a adaptação deste método irá beneficiar de uma ampla gama de estudos para além do sistema hematopoiético das larvas de Drosophila.
Acknowledgments
Agradecemos Jesper Kronhamn e Dan Hultmark, Michael Galko, eo Bloomington da Centro para as unidades populacionais de voar. Um agradecimento especial a Courtney Onodera para o conselho com análise estatística. Agradecemos a Katrina ouro para a leitura crítica do manuscrito, e Kalpana Makhijani, Katrina ouro, os membros do laboratório Derynck, e os membros do laboratório Nystul para discussão e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações do Programa de UCSF para Breakthrough de Pesquisa Biomédica (PBBR), Broad Center, Fundação Hellman, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, Institutos Nacionais de Saúde e 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (a KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
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