Abstract
I ryggradsdjur är hematopoies regleras av induktiva mikromiljöer (nischer). På samma sätt, i ryggradslösa modellorganism Drosophila melanogaster, induktiva mikromiljöer som kallas larv Hematopoietic Fickor (HPs) har identifierats som anatomiska platser för utveckling och reglering av blodkroppar (hemocyter), i synnerhet självförnyande makrofag härkomst. HPs är segment upprepade fickor mellan epidermis och muskelskikt av larven, som också innefattar sensoriska neuroner i det perifera nervsystemet. I larven är bosatta (fastsittande) hemocyter utsätts för anti-apoptotiska, lim och proliferativa signaler från dessa sensoriska neuroner och eventuellt andra komponenter i HPs, såsom foder muskler och epitelceller skikt. Under normal utveckling, gradvis frisättning av inhemska hemocyter från HPs bränslen befolkningen i cirkulerande hemocyter, som kulminerar i utgivningen av most för de inhemska hemocyter i början av metamorfos. Immun övergrepp, fysisk skada eller mekanisk störning utlösa förtida frigivning av inhemska hemocyter i omlopp. Switchen av larv hemocyter mellan inhemska platser och spridning ökar behovet av en gemensam standard / procedur för att selektivt isolera och kvantifiera dessa två populationer av blodceller från enda Drosophila larver. Följaktligen beskriver detta protokoll en automatiserad metod för att frigöra och kvantifiera vårdtagaren och cirkulerande hemocyter från enstaka larver. Metoden underlättar ex vivo metoder, och kan anpassas för att tjäna en mängd olika utvecklingsstadier av Drosophila och andra ryggradslösa organismer.
Introduction
Forskning inom ryggradslösa modellen Drosophila melanogaster har drivit upptäckten av medfödd immunitet 1, och har underlättat förståelsen för olika aspekter av blodcellutveckling 2-4. Drosophila hematopoies kan delas in i härstamningen av embryonala / larver hemocyter, som har sitt ursprung i embryo och expandera i larven och linjen av lymfkörtel hemocyter 4,5. Här presenterar vi ett protokoll som fokuserar på härstamningen av embryonala / larver hemocyter, som i Drosophila larven huvudsakligen består plasmatocytes (makrofager) och några kristallcellerna 4. I larven, hemocyter av embryot kvarstår och koloniserar segment upprepade och terminal Hematopoietic Fickor (HPs) ligger mellan epidermis och muskel skikt av larvkroppen väggen 5,6. Baserat på deras natur som självförnyande makrofager 6, sin dominerande bosättning i lokala vävnadsmikromiljöer 6, 7, och deras härstamning från de tidigaste blodkropparna framväxande under utveckling 6,8, är detta blod cellpopulation anses likna ryggradsdjur självförnyande vävnadsmakrofager, en oberoende myeloid härstamning nyligen identifierats i en mängd olika arter 4,9,10. Men i Drosophila, några eller alla av dessa residensceller visar också plasticitet för att ge upphov till andra blodkroppstyper såsom kristallceller 11,12.
Larver hemocyter är främst bosatta (sessile), men befinner sig i en dynamisk steady-state mellan olika HPs. De successivt släppas ut på marknaden, i synnerhet som den 3: e INSTAR larv närmar pupariation 5-7. Immun utmaningar, skada eller mekanisk störning leder till en för tidig, i det senare fallet reversibla, mobilisering av inhemska hemocyter i hemolymfan 4,6,13.
Tidigare studier har antytt att inhemska och cirkulerarlarver hemocyter är av samma härstamning, men skiljer sig i sina lim eller målsökande egenskaper 6,7,13,14. Selektiv isolering av cirkulerande kontra inhemska hemocyter visade förhöjda halter av proliferation i den bofasta hemocyte befolkningen, vilket tyder på deras exponering för induktiva signaler från HPs 6. Drosophila larv HPs är kantade av epidermis och muskelskikt och ytterligare hyser sensoriska neuron kluster av det perifera nervsystemet (PNS) och leverfunktion som liknar oenocytes 6. Funktionellt har muterade och genetiska cell ablation experiment visade att sensoriska neuroner som finns i HPs stöder trofiska överlevnad och lokalisering av larv hemocyter 6.
Här beskriver vi en metod för den specifika isolering och kvantifiering av inhemska och cirkulerande hemocyter från enda Drosophila larver, och ett protokoll för mekanisk hemocyte mobilisering. Metoderna kan användas för ex vivostudie av hemocyter och kan vidare anpassas till andra Drosophila utvecklingsstadier såsom puppan och vuxna, och andra ryggradslösa system. Eftersom tidigare studier inte skilja mellan inhemska och cirkulerande hemocyter, ger detta protokoll en gemensam standard för studier av inhemska blodceller och kommer att bidra till att öka samstämmigheten ryggradslösa blodcellsforskning.
För det första hemocyte Bleed / Skrapa analys beskriver differential isolering och automatiserad kvantifiering av fluorescerande protein-märkta bosatt och cirkulerande hemocyte populationer från enda Drosophila larver; protokollet finns två alternativ för regelbundna och kakel skanna utrustade mikroskop (Figur 1). Som ett resultat, är den procentuella andelen av cirkulerande hemocyter och det totala antalet av hemocyter per larv erhölls. Metoden bygger på transgen Drosophila larver som uttrycker fluorescerande protein bland deras blodkropparbefolkning. Valet av hemocyte föraren eller reporter avgör resultatet, det vill säga vilken population av blodceller visualiseras och kvantifieras. Att märka huvudsakligen makrofager (plasmatocytes), som utgör den stora majoriteten av inhemska och cirkulerande hemocyte befolkningen i Drosophila larven 6, lämpliga transgener innefattar Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 (genom H. Agaisse 16), eller eater-GAL4 17; för märkning av relativt liten population av kristallceller, lämpliga linjer är BcF6-gemensamma fiskeripolitiken och -GFP 18 eller LZ-GAL4 (J. Pollock 19), för att märka lamellocytes, en specialiserad celltyp främst framkallad av immun utmaningar och skada 13, t.ex. har MSNF9mo-mCherry användas 17. Vissa transgena förare uttrycks i en rad differentierad blodceller och stamceller, såsom han - GAL4 20, vilka etiketter cirka 80% av alla larver blodkroppar 20. Observera att i samtliga fall där GAL4 förare används kombination med UAS-GFP eller annan fluorescerande protein UAS-transgen krävs. I resultatdelen är denna metod används för att övervaka blodcellantalet och cirkulation beteende under loppet av larvutveckling.
För det andra, den hemocyte Störning analys beskriver ett föregående steg utformad att lösgöra inhemska hemocyter genom extern manipulering, som därefter medger utvärdering av förmågan hos hemocyter att åter ansluta sig och hem till HPS inom en begränsad tidsperiod (30 - 60 min) 6. Typiskt denna analys följs av luftnings / Skrapa analys för att bestämma den procentuella andelen av cirkulerande hemocyter per larv. Vi presenterar ett förenklat protokoll för denna analys (figur 1D), som använder störning genom att vortexa with glaspärlor, snarare än manipulering av enstaka larv med en pensel som beskrivits tidigare 6. I avsnittet Resultat, är denna analys som används för att visa att övergående fristående hemocyter flyta i hemolymfa och kan återvinnas i fraktionen av cirkulerande hemocyter. Analysen är också användbar för att kvantifiera skillnaderna i hemocyter i deras målsökande / vidhäftning till inhemska platser, jämför till exempel, olika genetiska bakgrunder eller stimuleringsförhållanden. Observera att denna mekaniska manipulation avspeglar en reversibel process och skiljer sig från Infektions- eller skada inducerad bosatt hemocyte mobilisering, som normalt inte är reversibla på kort tid 4,13.
Protocol
1. hemocyte Bleed / Skrapa-analys
- Framställning av diabilder:
- Alternativ 1 för mikroskop utan kakel skanningsfunktionen: För varje larv som skall analyseras, förbereda en glasskiva med cirka 5 Pap-penna brunnar i 2 mm rutor vardera, motsvarande området bildyta av mikroskopet; Tillsätt ca 5 - 10 | il S2 media till varje (Figur 1A). Håll glasen i fuktig kammare för att förhindra brunnar torkar ut.
- Alternativ 2 för mikroskop med kakel skanningsfunktionen: För varje larv som skall analyseras, förbereda en glasskiva med 3 till 4 Pap-penna brunnar ~ 3-4 mm rutor vardera; lägga till cirka 15 - 20 | il S2 media till varje brunn (Figur 1B). Håll glasen i fuktig kammare för att förhindra brunnar torkar ut.
OBS: Ovanstående rekommenderade antalet brunnar är tillräcklig för summan av upp till 3000 hemocyter per larv (slutet av 2: a INSTAR larver, ~ 2,5-3 mm längd, transgen märkning majoriteten av larval blodkroppar). Vid bedömningen av större blodcellantal, kanske flera brunnar behövas för att undvika trängsel.
- Insamling av larver:
- Sprutar vatten i en fluga flaska innehållande larver och spola larver i en petriskål eller skopa mat som innehåller larver i en petriskål och späd med vatten med hjälp av en sprutflaska.
- Plocka försiktigt larver ur petriskålen med hjälp av en pensel och placera dem i vatten i en hålighet maträtt eller en bild på en kall block.
OBS: Larver kan hållas under en begränsad tid i vatten eller på en kall block; Använd prover inom 45 minuter eller mindre för att undvika larv dödsfall eller oönskade effekter på hemocyter.
- Dissektion:
- Välj larver under ett fluorescensmikroskop på en kall metallblock. Mät storlekar och bild larver om så önskas.
- Isolering av cirkulerande hemocyter ("Bleed"):
- När larver väljs, placera en larv i första Pap-pennan väl (Figur 1C,2A).
- Använd 2 rena nålar eller dissekera sax och pincett för att göra ett snitt på både bakre och främre ändar larven. För att undvika att störa bosatta hemocyter, är det bäst att göra dessa snitt på den ventrala sidan av larven. För konsekventa resultat, göra snitten i samma platser för varje larv. För 1: a INSTAR larver, räcker ett snitt (i den ventrala främre).
- Låt larv att blöda under några sekunder utan något tryck eller fysisk agitation (Figur 2A).
OBS: Om man arbetar på flera larver är det bättre att göra dessa snitt för varje innan du går vidare till nästa steg för att undvika att hålla larver på is för länge som kan påverka proverna integritet. - Lyft försiktigt larven med nålar eller pincett och doppa den i den andra brunnen att skölja eventuella kvarvarande cirkulerande hemocyter. Efter det, följ med lanseringen av inhemska hemocyter.
- Försiktigt överföra larven till nästa brunn (figur 2C).
- Identifiera lymfkörtel av larven, som typiskt ligger ca 1/3 från den främre änden av larven, och som kan fluorescera dorsalt genom larvkroppen väggen. Undvik lymfkörtel samtidigt frigöra bosatta hemocyter genom att fästa ner larven med en nål så nära som möjligt till lymfkörtel att undvika punktering (figur 2C).
OBS: Under normal utveckling mognaden av lymfkörtel hemocyter är fördröjd jämfört med larver hemocyter, och fluorescerande reportrar differentierade hemocyter får inte visa en signal i lymfkörtel unga larver. I dessa fall behöver mindre uppmärksamhet ägnas åt lymfkörtel eftersom ingen kontaminering av differentierade fluorescensmärkta larv hemocyter av lymfkörtel hemocyter förväntas. - Släpp bosatta blodkroppar i ett dissectiom processen för skrapning och / eller jabbing. Använd en needle att effektivt hålla fast larven nära lymfkörtel (se ovan) eller andra kroppsområden som behövs. Använd en annan nål för att jab på kluster av hemocyter som är synliga genom larvkroppsväggen (figur 2C, E), som syftar till att separera hemocyter. Hemocyter kan även släppas i en skrapning rörelse. Emellertid kan riva epidermis tidigt släppa stora kluster av blodkroppar, vilket kan göra automatiserad räkna mer utmanande.
OBS: Beroende på ålder och genotyp larven, kommer det totala antalet hemocyter variera. Fördela releasen som beskrivits ovan under flera brunnar för att undvika överbeläggning i några brunnar med blodkroppar, vilket kan leda till att en enda cell bildanalys svårare. - Om några hemocyter kvar i slut stommen, räkna dessa hemocyter från observation genom mikroskop och användning av en manuell stämmer räknare (Figur 2E). För att underlätta räkning, pspetsar stommen på en ren yta på samma objektglas och sprida det så tunt som möjligt för att minska antalet optiska plan.
- När dissektion är klar, vänta mellan 5-10 minuter för cellerna att bosätta sig (men inte nödvändigtvis följa) innan avbildning brunnarna. Inkubera bilden i en fuktig kammare för att undvika uttorkning och undvika ovarsam hantering av bilderna, som skulle kunna störa de bosatte hemocyter.
OBS: När du bestämmer hemocyte räknas, släpps cellerna inte fasta och cellerna måste avbildas strax efter dissektion, företrädesvis inom 30 minuter efter frisläppandet från larven. Beroende på volymen av medelstora och cellegenskaper, kommer de allra flesta celler har bosatt inom 5-10 minuter, vilket skall bekräftas genom att fokusera genom de optiska plan mediet i brunnen. Dock kommer endast en bråkdel av blodkroppar har anslutit sig till glidytan vid denna tid, ett faktum som måste övervägas om att ändra detta protokoll för cellfixering baserad approaches.
- Ta bilder av de avvecklade hemocyter under ett fluorescensmikroskop (Figur 2B, D, F). Följ med kvantifiering av hemocyter med ImageJ programvara.
- Förbered bilder för ImageJ cellräkning algoritm:
- Öppna bild väl med ImageJ: Arkiv → Öppna → (lokalisera filen och välj).
- Se till att bilden (s) är 8-bitars eller 16-bitars. Justera tröskelvärdet för bilden genom att välja Bild och klicka sedan på Justera och välj Threshold. Observera "Threshold fönstret" (Figur 3A).
- Kontrollera "Mörk bakgrund" alternativet. Välj "Red" och öka den lägre tröskelnivå (se svart pil) tills varje cell i bilden är markerad med en röd prick (celler som inte täcks kommer att ses i gråskala, Figur 3B). Eftersom den lägre tröskelnökar vissa celler blir omarkerad. Detta kan vara indikator för hur långt att ställa in lägre tröskel.
OBS: Ibland kluster av celler kan inte lösas och skulle räknas som en av partikelräknare. I sådana fall kan antalet celler i ett kluster uppskattas genom att undersöka bilden (zooma in vid behov) och manuell räkning med användning av en trådräknare. Alternativt kan ökas det lägre tröskelvärdet för att lösa kluster av celler; eventuella omärkta celler till följd av denna manipulation kan då räknas med hjälp av en sammanställning räknare.
- Analysera mobilnummer med ImageJ:
- Starta Particle Analyzer för att räkna cellerna (figur 3C). Välj Analysera och klicka på Analysera Particle. Alternativt välj "Overlay skisserar" för att se partiklarna algoritmen räkningen (Figur 3D). Alternativt, ange en gräns för storleken eller pixelområde av en enhet (t.ex.., Cell, klump av celler, etc.) för algoritmen att räkna.
- Klicka på OK. Observera en sammanfattande fönster med räkningen (figur 3E).
2. hemocyte Störnings Assay
- Störa hemocyter väljer larver och placera dem i en 2 ml mikrocentrifugrör med cirka 0,5 g glaspärlor (212 - 600 nm) och tillsätt 0,5 ml vatten.
- Vortexa röret, för hand, vid hastighet 10 under en minut.
- Hämta larverna från glaspärlorna genom att spilla innehållet i mikrocentrifugrör i en petriskål och plocka ut larverna med en pensel.
- För återhämtningsfasen, placera larver i tidigare framställda petriskålar med små mängder av flyg mat. Låt larverna att återupprätta sin hemocyte mönster under en period av 45 min eller enligt önskemål.
OBS: Kasta alla larver som har slutat röra sig, eftersom de har dött i processen. Vi ser dock typiskt little skador efter en minut av virvelbildning (se nedan och Kompletterande Figur 1). - Efter återhämtningsperioden, fortsätter med Bleed / Skrapa analys som beskrivs ovan i avsnitt 1.
Representative Results
För att illustrera typiska resultaten av de beskrivna metoder, först använde vi hemocyte Bleed / Skrapa analys för att beskriva utvecklingen av larv hemocyte nummer och deras hemvist under loppet av larvutveckling (Figur 4). Resident och cirkulerande larv hemocyte populationer isolerades från enstaka larver (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP, He-GAL4 att märka den stora majoriteten av larv hemocyter) och kvantifieras med hjälp av ImageJ. Kohorter av larver storlek 1,2 mm (~ 48 h AEL eller 1: a INSTAR), 2,5 mm (~ 80 timmar AEL eller sent 2: a INSTAR), och 3,5 mm (~ 96 timmar AEL eller 3: e stadiet) undersöktes (Figur 4) . Hemocyte nummer expanderat under loppet av larvutveckling, korrelerar med och överträffa tidigare beräkningar baserade på ljusmikroskop färgämne färgas larver 7 och levande räkning av fluorescerande protein märkt hemocyter genom larver nagelbanden 6. I 1 st instjära larver nästan alla hemocyter var bosatt, medan den del av cirkulerande hemocyter successivt ökat under loppet av larvutveckling (Figur 4B, C), i linje med tidigare publikationer 6,7.
Nästa vi undersökte huruvida metoden övervakar troget övergång hemocyter mellan vårdtagaren och cirkulerande befolkningar. Med utnyttjande av fenomenet att inhemska hemocyter kan transient loss genom mekanisk störning och de re-följa sina inhemska platser spontant 6, dispergerades vi inhemska hemocyter genom virvling med glaspärlor som beskrivs i hemocyte Störning Assay. I själva verket, mekanisk störning av larver lett till en dramatisk ökning av befolkningen i cirkulerande hemocyter på bekostnad av inhemska hemocyter (Figur 5). Efter en återhämtningsperiod på 45 minuter, hade hemocyter i stort sett återgått till sin vidhäftande tillstånd, både genom visuell inspektion och genom såsessed procentandel cirkulerande celler (Figur 5D, E). Som väntat förblev totalt hemocyte nummer stabil över tiden, trots förskjutning av hemocyter mellan de cirkulerande och bofasta befolkningen.
Flera ytterligare överväganden har beaktats. För att bekräfta att vortexa inte orsakar betydande vävnadsskada, virvling med glaspärlor utfördes i närvaro av trypanblått (Sigma) under olika tidsperioder (1, 5, 20 min). Både en och fem minuter virvling orsakade inte några synliga vävnads störningar, medan 20 min virvling gav små områden av skada, som påminner om skador orsakade av nål stygn som används som positiv kontroll (Supple Figur 1). Även om det inte kan uteslutas inre skador av epidermis eller andra vävnader utan nagelband skador, verkar detta scenario ganska osannolikt eftersom hemocyter av 1 min och 5 min behandlade larv re-vidhäftade i det förväntade mönstret och tidsramen, vilket tyder på larver integritet var inte kompromissad (Supplemental figur 1). Däremot virvlades larver under 20 minuter lidit av brist på re-adhesion, och inte ens visa fastsättning av cirkulerande hemocyter till epidermala sår platser, som har beskrivits tidigare 14.
Slutligen, för att demonstrera metodens reproducerbarhet, jämförde vi biologiska replikat av 2,5 mm larver från de två experimenten ovan, som genomfördes av distinkta experimentatorer. Såsom illustreras i Supple Figur 2, båda kohorter visade jämförbara totala antalet hemocyter per larv och andelen cirkulerande hemocyter. Students t-testning visade inga statistiskt signifikanta skillnader, vilket tyder på att metoden är reproducerbar och brett tillämpbar.
Figur 1. hemocyte Bleed / Skrapa och Störnings analys s ETUP och schematiska. (A) Single Image Slide Setup: fem 2mm rutor för avbildning med en 5X mål (B) kakel Scan Slide Setup. Fyra 3 mm rutor för avbildning blödning / skrapsår av ≤2.5 mm larver med en bricka scan mikroskop. Rekommenderade mål för avbildning är 5X eller 10X. (C) Bleed / Skrapa Assay schematiska och resulterande kvantifieringar med ImageJ. (D) I Störnings analys är hemocyte mönstret mekaniskt störs av virvel larver med glaspärlor. Larver får återhämta sig under en period av 45 minuter, under vilken hemocyter åter följa de Hematopoietic Fickor. De vidhäftande egenskaperna hos hemocyter kan bedömas genom detta förfarande, kvantifiera andelen hemocyter i omlopp efter störningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bleed / Skrapa analys för att släppa cirkulerande och bosatta hemocyter. (A) att blöda en larv är ventrala snitt på de bakre och främre ändar larven gjorde (sax symbol). (B) hemocyter i omlopp kommer att strömma ut ur snitt och bosätta sig på ytan av bilden. (C) Den lymfkörtel (LG) ligger och nålas ner, utan att punktera den. Resident hemocyter frigörs genom jabbing och / eller skrapning larven med en nål. (D) Resident hemocyter på objektglaset. (E, F) Den Skrapa process upprepas tills alla inhemska hemocyter frigörs. Larver stommen som innehåller den intakta lymfkörtel är kvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Automatiserad kvantifiering av hemocyter med ImageJ. (A, B) Efter att ha öppnat en hemocyte bildfil i ImageJ, Nedre Tröskelnivå justeras för att ta hänsyn till alla celler i bilden. (C, D) Analysera Partiklar kräver inställning av cellpixelstorlek, cirkularitet, och resultatet avläsning format (t.ex. Overlay konturer). (E) Sammanfattning fönster som visar antalet hemocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat (1). Hemocyte nummer och bosatt tillstånd över loppet av larvutveckling. (A) Översikt över larvstadierna som används; 1: a stadiets (48 h AEL, ~ 1,2 mm längd); 2: a stadiet (80 tim AEL, 2,5 mm längd); 3: e stadiet (96 tim AEL, ~ 3,5 mm längd). Genotyp är Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Han-GAL4. Stages bekräftades genom att bedöma larv mouthhooks. (B) Bar diagram av cirkulerande och bosatt hemocyte nummer vid respektive larvstadier. (C) Procent av cirkulerande hemocyter. Notera att den del av cirkulerande hemocyter ökar oproportionerligt under loppet av larvutveckling. (D) Totalt hemocyter, till följd av summan av cirkulerande och inhemska hemocyter per larv. Hemocyter kvantifierades med hjälp av Bleed / Skrapa metod; n ≥ 6 larver / skick, felstaplarna visar standardavvikelse, fynd bekräftats i 3 oberoende replikera experiment.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa resultat (2). Effekter av mekaniska störningar på hemocyte bostad. (AC) Exempel på en larv före och efter vortexa med glaspärlor, följt av 45 min återhämtning (A) Inga störningar kontroll. hemocyter är lokaliserade i ofHematopoetic Fickor (B) Störd hemocyte mönster vid 0 min efter virvel larver i en suspension av glaspärlor och vatten (C) hemocyte mönster vid 45 min av återhämtning efter störningar.. många hemocyter har flyttat till Hematopoietic Fickor; notera förstorad rygg-fartyg tillhörande kluster och rygg ränder som är dominerande områden av tidiga post-störnings ackumulering (pilar). Genotyp är Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Han-GAL4 x yw. (D) Andel av cirkulerande hemocyter kvantifierade av Bleed / Skrapa-metoden. (E) Totalt hemocyter, till följd av summan av cirkulerande och inhemska hemocyter per larv. n ≥ 4 larver / skick, felstaplarna visar standardavvikelse, fynd bekräftats i 3 oberoende replikera experiment. T-test för att bekräfta betydelse, NS (ej signifikant), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här beskriver vi den första metoden för att kvantitativt utvinna bosatta och cirkulerande blodceller från enkelt Drosophila larver, och kvantifiera dessa två hemocyte populationer. Protokollet innefattar den sekventiella frisättningen av cirkulerande och inhemska blodceller, följt av avbildning och automatiserad cellräkning. Larv inhemska hemocyter kan tillfälligt mobiliseras i omlopp genom mekanisk störning, en process som är känd för att vara i stort sett återförda inom en 30-60 min återhämtningsperiod 6. Följaktligen har detta protokoll testades på två sätt, (1) genom att bedöma det totala hemocyte antalet per larv och fraktion av cirkulerande hemocyter under loppet av larvutveckling, och (2) genom experimentellt lossnar bosatta hemocyter med hjälp av en automatiserad metod, som bekräftade tight korrelation mellan hemocyte lokalisering och hemocyte nummer i inhemska och cirkulerande befolkningar. Dessutom var den metodens reproducerbarhet demonstreras genom sammparing två datauppsättningar av biologiska replikat.
I det förflutna, har laboratorier använt en rad tekniker för att kvantifiera larv hemocyter 6,13,21. Detta protokoll upprättas en gemensam standard för att hämta och kvantifiera bosatta och cirkulerande blodcellpopulationer från Drosophila larver, vilket ger en lätt anpassningsbar plattform. Den beskrivna metoden är avgörande för studier som fokuserar på den roll som inhemska hemocyter och deras mikromiljö, fickor Hematopoietic 4-6, och är lämplig för att studera fluorescerande protein transgen bärande Drosophila stammar i vildtyp och genetiskt modifierade bakgrunder. Protokollet är också relevant för studier som fokuserar på hemocyte mobilisering efter immun utmaning eller skada, och genetiskt eller miljömässigt inducerad signalering som utlöser mobilisering av inhemska hemocyter eller förändringar i totalt hemocyte nummer (översikt i 4). Det bör noteras att, i fall av förtida differentiation och frisättning av hemocyter från lymfkörtel, skilja embryonal / larver kontra lymfkörtel linjerna kan begränsas av uttrycksmönstret av det fluorescerande hemocyte reporter används.
Protokollet presenteras här bygger på avbildning levande, fluorescensmärkta hemocyter. I framtiden kan det modifieras för att möjliggöra detektion av frigjorda celler efter fixering, t.ex. med hjälp av immuncytokemi. I detta fall kan protokollet behöva anpassas för att säkerställa fullständig vidhäftning av blodceller, till exempel genom att öka vidhäftning inkubationstider och lägga lim glidbeläggning, såsom concanavalin A. Eftersom metoden tillåter hämtning av hemocyter och deras manipulation ex vivo, kommer det att gynna många av utvecklings-, cellbiologiska och biokemiska studier. Resident och cirkulerande blodkroppar finns under alla postembryonic utvecklingsstadier av Drosophila och andra ryggradslösa 22, suggesting att en anpassning av denna metod kommer att gynna ett brett spektrum av studier utanför Drosophila larv hematopoietiska systemet.
Acknowledgments
Vi tackar Jesper Kronhamn och Dan Hultmark, Michael Galko och Bloomington Stock Centrum för flyga bestånd. Ett särskilt tack till Courtney Onodera för rådgivning med statistisk analys. Vi tackar Katrina Guld för kritisk läsning av manuskriptet, och Kalpana Makhijani, Katrina guld, medlemmar av Derynck laboratorium och medlemmar av Nystul laboratoriet för diskussion och kommentarer på manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från UCSF Program för Genombrott biomedicinsk forskning (PBBR), Broad Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1326268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 och 1R56HL118726-01A1 (till KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
