Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo Vurdering af gnaver Plasmodium parasitæmi og merozoit Invasion ved flowcytometri

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Malariaparasitten invaderer og gentagelser inden røde blodlegemer. Den nøjagtig vurdering af merozoit invasion og parasitæmi er derfor afgørende for vurderingen løbet af malaria infektion. Her beskriver vi en flowcytometri baseret protokol til måling af disse parametre i en musemodel af malaria.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den politik, Macquarie University og var i overensstemmelse med Sundhed og Medicinsk National Research Council (NHMRC) australske kodeks. Arbejdet blev udført i henhold til aftalen Etik Ingen ARA 2012/017 godkendt og opnået fra Animal etiske komité på Macquarie University. Alle eksperimenter blev udført på SJL / J-mus, medmindre andet er angivet.

1. Mus og Eksperimentel Malaria Infektion

  1. Husmus under kontrolleret temperatur (21 ° C) med en 12:12 timers lys-mørke cyklus.
  2. Optø en portion af kryopræserveret P. chabaudi Adami DS med 5% parasitized RBC (pRBCs) og injicere 200 pi til intraperitoneal hulrum C57BL / 6 donor mus.
  3. Overvåg donor mus parasitæmi hver 1 - 2 dage ved hjælp af flowcytometri, som beskrevet i Afsnit 3 - 4 i denne protokol. Når donorerne når 5 - 15% parasitæmi, indsamle blod ved hjertepunktur som følger:
    1. Aspirer 100 pi heparin-opløsning (300 U / ml heparin i muse Ringer opløsning (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 10 mM glucose, 30 U / ml heparin, pH 7,4, 0,22 um filter steriliseret)) i en 1 ml sprøjte med en 26 G nål.
    2. Bedøver musen ved indånding med 5% isofluoran, bekræfter den ønskede dybde af bedøvelse ved manglende tilbagetrækning pedal respons og hornhinden reflekser.
    3. Placer musen på sin side og vinkelret insert nålen lige under albuen gennem ribbenene, og ind i hjertet. Træk sprøjtens stempel langsomt og dreje nålen indtil 0,5-1 ml blod opnås.
    4. Udfør human aflivning ved cervikal dislokation under anæstesi.
  4. Beregn pRBCs pr volumen af donorblod antager blodtælling på 9 x 10 6 RBC / ul (dvs. hvis donor var på 10% parasitæmi når ofret, vil blod indeholde 9 x 10 5PRBC / pl). Fortynd parasitiseret blod i Krebs-bufret saltvand (126 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,2% glucose, pH 7,2, 0,22 um filter steriliseret) således at koncentrationen er 1 x 10 4 pRBCs pr 200 pi og injicere 200 pi til intraperitoneal hulrum af mus, der er nødvendige for RBC mærkning og transfusion eksperiment.
  5. Overvåg parasitæmi hver 1 - 2 dage ved hjælp af flowcytometri, som beskrevet i sektion 3 - 4 i denne protokol.

2. Mærkning af røde blodlegemer og transfusion

  1. Saml hepariniseret blod fra mus ved hjertepunktur som beskrevet i trin 1.3, og anbring på is. Hold blod ved 4 ° C på alle tidspunkter. Saml ca 200 pi blod per mus, der skal injiceres. Hvis det er nødvendigt, opdelt blod i to prøver og behandle én prøve som ønsket.
    BEMÆRK: I denne måde, invasion af det behandlede SAMPle kan sammenlignes med en kontrol, ubehandlede prøve (se figur 1 for skematisk).
  2. Forbered en 2x opløsning af hver fluorescerende RBC etiket.
    1. En 2 mg / ml stamopløsning af Atto 633-N-hydroxysuccinimid (Atto 633-NHS) i MTR fortyndes, således at koncentrationen er 20 ug / ml.
    2. En 25 mg / ml stamopløsning af biotin-N-hydroxysuccinimid (biotin-NHS) i MTR fortyndes, således at koncentrationen er 250 ug / ml.
  3. Split blodprøver i to rør og tilsæt et lige stort volumen af ​​2X Atto 633-NHS løsning på et rør, og et lige så stort volumen af ​​2X Biotin-NHS til det andet rør. Bland omgående. Inkuber blod ved 4 ° C i 1 time med konstant langsom blanding, eller alternativt blandes prøven hver 10 - 15 min.
  4. Vask mærkede blod 3 gange med MTRC (MTR + 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 0,22 um filter steriliseret) som følger:
    1. Tilsæt mindst 2 volumener MTRC, centrifugeres ved 750 xg i 5 min, supernatanten fjernes, og resuspend pellet i mindst 2 volumener MTRC. Gentag 2 gange mere.
    2. Efter den sidste vask, centrifugeres ved 750 xg i 5 minutter, og kombinere det pelleterede blod i forskellige kombinationer (dvs. ubehandlet Atto 633 / behandlet Biotin, ubehandlet Biotin / behandlet Atto 633). Tilføj MTR fyldes op til et volumen på 200 pi per mus, der skal injiceres.
  5. Sprøjt mærkede blod intravaskulært i gnaver malaria inficerede mus eller ikke-inficerede kontrol som følger:
    1. Udfør transfusion ved 2 - 15% parasitæmi på toppen af ​​parasitten schizogony.
      BEMÆRK: dette sker omtrent halvvejs gennem den mørke cyklus (dvs. mellem 12-2 am på en normal lys cyklus, eller 12-2 pm på en omvendt lys cyklus).
    2. Varm mus ved hjælp af en varmelampe i 5-10 minutter for at øge blodgennemstrømningen, men tage forholdsregler for ikke at overophede musene. Placer mus i en fastholdende enhed og intravaskulært injicere 200 pi mærket blod (ca. 1-2 x 10 9 RBCs) via halevenen.
  6. Saml blodprøver på forskellige tidspunkter efter injektion, som beskrevet i afsnit 3.
    BEMÆRK: invasion satser kan kvantificeres mindre end 10 minutter efter injektion, afhængigt af parasitæmi modtagerens musen.

3. Indsamling af blodprøver og Forberedelse til flowcytometri

  1. Forbered 50 pi farvningsopløsning per prøve, plus ekstra, på dagen for eksperimentet som følger:
    1. Optøning en alikvot af 6 mM JC-1 opbevaret ved -20 ° C i dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Varm 50 pi MTRC per prøve, plus ekstra, til 37 ° C.
    3. Mens kontinuerligt vortex det foropvarmede MTRC tilsættes JC-1, således at den endelige koncentration er 12 uM. Dette gøres for at reducere dannelsen af ​​JC-1 aggregater; hvis aggregater gør danner, ikke centrifugerør, da dette vil forhindre farvning.
      BEMÆRK: En lille mængde af sammenlægning vil ikke påvirke resultatet.
    4. Tilføj anti-CD45 APC eFluor 780 og anti-CD71 PerCP eFluor 710, således at den endelige koncentration 1 ug / ml. Hvis der udføres det mærkede RBC eksperiment tilsættes streptavidin PE-Cy7 således at den endelige koncentration 1 ug / ml.
  2. Udfør hale blødning ved amputation af spidsen af ​​halen eller sønderrivning af blodkarret inden halen. Placer en dråbe hale blod på en lille vejer båd eller objektglas. Efter blodprøvetagning, sikre, at blødningen er stoppet. Pipette 3 pi hale blod i 50 pi farvningsopløsning forvarmet til 37 ° C og inkuberes prøverne ved 37 ° C i 20 minutter.
  3. Optøning en alikvot af 4 mM Hoechst 33342 opbevaret ved -20 ° C i destilleret vand (hvis der anvendes en 355 nm laser) eller 2 mM Hoechst 34580 opbevaret ved -20 ° C i destilleret vand (hvis der anvendes en 405 nm laser). Forbered 500 pi per prøve, plus ekstra, af en 4 pm eller 2 uM opløsning af Hoechst i MTRC hhv.
  4. Tilføj 500 pi af 4 uM Hoechst33342 eller 2 pM Hoechst 34580 prøver og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min.
  5. Centrifuger cellerne ved 750 x g i 3 minutter ved 4 ° C, discard supernatant, tilsættes 700 pi MTRC og analysere ved flowcytometri.

4. Flowcytometri

  1. Analysere prøver ved hjælp af en 355/488/633 nm laser eller 405/488/633 nm laser instrument.
  2. Filter prøver gennem en 35 uM cellefilter umiddelbart før analyse. Skyl cellefilter med destilleret vand mellem prøver og genbrug.
  3. Optag nok begivenheder, således at den mindste befolkning indeholder mindst 500 arrangementer (som regel 1.000.000 - 10.000.000 alt hændelser per prøve).
  4. Excite Hoechst 33342 ved hjælp af en 355 nm laser og opdage hændelser gennem en 460/50 filter. Excite Hoechst 34580 ved hjælp af en 405 nm laser og opdage hændelser gennem en 460/50 filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 og Streptavidin PE-Cy7 ved hjælp af en 488 nm laser og opdage hændelser gennem en 530/40, 692/40, og 750LP filter respektively. Excite Atto 633 og anti-CD45 APC eFluor 780 ved hjælp af en 633 nm laser og opdage begivenheder gennem et 670/30 eller 750LP filter hhv.
  5. Udfør analyse og erstatning ved anvendelse af passende flowcytometri analyse software som følger:
    1. Vælg hele celler og eksklusive støj, snavs og blodplader baseret på FSC / SSC egenskaber (figur 2A). Vælg enkelte celler baseret enten på aftrækkeren impulsbredde (figur 2B) eller ved hjælp af FSC toparealet højdeforholdet (figur 2C).
    2. Vælg modne røde blodlegemer, og udelukke RBC stamfædre og leukocytter, baseret på negativ fluorescens i PerCP eFluor 710 og APC eFluor 780 kanaler (figur 2D).
    3. Hvis der udføres det mærkede RBC eksperimentet, skal du vælge hver population af mærkede RBC baseret på PE-Cy7 og Atto 633 fluorescens og analysere disse separat (figur 3A).
    4. Vælg pRBCs baseret på positiv fluorescens både JC-1 og Hoechst (

5. Beregninger og statistik

  1. Beregn parasitæmi ved at dividere antallet af pRBCs med det samlede antal af RBC (dvs. antal hændelser i gate Q2 divideret med antal hændelser i gate G4). Ved udførelse invasionen assay parasitæmi af de to mærkede populationer kan beregnes ved at dividere antallet af mærkede pRBCs med antallet af mærkede RBC i denne population (dvs. antal begivenheder, der er i begge porte L1 og Q2, divideret med antallet af arrangementer i gate L1).
    BEMÆRK: Mærket parasitæmi varierer betydeligt afhængigt af faktorer som endogen parasitæmi og antal cirkulerende merozoiter. Af denne grund er det nyttigt at rapportere parasitæmi ratio, der er beregnet som parasitæmi af den behandlede mærkede population divideret med parasitæmi af kontrollen mærkede population i hvert enkelt mus. For at korrigere for eventuelle dye effekter, resultater rapporten ens en gennemsnitlig parasitæmi forhold på tværs af de to dye kombinationer.
  2. Bestem statistiske signifikans af forhold ved hjælp af en prøve t-test med 1 som den hypotetiske middelværdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Måling af parasitæmi.

Til måling af parasitæmi, skal først vælges blodlegemer, og støj, snavs og blodplader udelukket på grundlag af FSC / SSC egenskaber (figur 2A). Afhængigt af cytometret der anvendes, så udvælges enkelte celler baseret enten trigger impulsbredde (figur 2B) eller FSC tophøjde til arealforhold (figur 2C). Resterende begivenheder bør bestå af leukocytter, farves positive for APC eFluor 780, RBC stamfædre (inklusive reticulocytter), farves positive for PerCP eFluor 710, og modne røde blodlegemer, negative for begge disse pletter (figur 2D). Efter valg af modne RBC befolkning bør begivenheder adskilt i fire populationer, når JC-1 fluorescensen er plottet mod Hoechst 33342 (figur 2E, F) eller Hoechst 34580 (figur 2G, H) fluorescens. Den dobbelte positive befolkning udgør parasitized RBC, mens remaining populationer er enten ikke-inficerede røde blodlegemer (dobbelt negativ), HJ-RBC (Hoechst positiv, JC-1 negativ) eller ukendte celler (JC-1 positive, Hoechst negativ). Især kan JC-1 fluorescens skifte fra et maksimum ved 529 nm til en bred emission topper ved 590 nm, afhængigt af den mitokondrielle membranpotentiale af cellen. Uanset dette skift JC-1 vil fluorescerer kraftigt i 530/40 nm kanal, hvilket gør denne kanal mest egnet til analyse. Men i nogle tilfælde kan det være værd at yderligere post fluorescens i 585/42 nm kanal, hvilket kan give en indikation af den mitokondriske membranpotentiale af celler. I ikke-inficerede prøver mindre end 0,007% af arrangementer bør være dobbelt positive (figur 2E, G). Dette resultat vil afhænge af renholdelse af flowcytometeret og kan variere betydeligt, kan omfattende rengøring før analyse forbedre resultaterne. HJ-RBC udgør 0,3-0,9% af modne RBC'er, at tilsætningen af ​​JC-1 farvestof kritisk for accurat måling af lav parasitæmi.

Vurdering af merozoit invasion.

Efter injektion mærkede RBC i inficerede mus de relative invasion satser i de to mærkede populationer kan bestemmes. Blodprøver skal udtages og klargøres som beskrevet for parasitæmi måling med tilføjelse af Streptavidin PE Cy7. Det tidspunkt, hvor prøven udtages, afhænger af de eksperimentelle forhold og ønskede resultat af analysen. I almindelighed vil et tidligere tidspunkt bedst afspejler en invasion fænotype, selvom det kan være fordelagtigt at samle forskellige tidspunkter for at øge nøjagtigheden. Til analyse af flowcytometri data bør modne RBC'er vælges som i figur 2. Fra disse celler kan Atto 633 og biotin-mærket RBC'er identificeres baseret på fluorescens i 670/30 og 750LP kanaler (figur 3A). Herfra på de tre RBC populationer (Atto 633, biotin, og umærket)bør analyseres særskilt. I hver af disse populationer parasitæmi kan bestemmes ud fra farvning med Hoechst og JC-1 (figur 3B-D).

Figur 1
Figur 1. Skematisk af in vivo parasit invasion assay. Et eksempel på hvordan dette assay kan anvendes til at bestemme de relative invasion satser i RBC behandlet ifølge brugerens biologiske spørgsmål er vist. Blod opsamlet fra inficerede mus er opdelt i to rør. Et rør behandles som ønsket, mens den anden prøve efterlades ubehandlede (A). Rør igen opdelt med en mærket med NHS-biotin og den anden med NHS-Atto 633 (B). Prøver kombineres derefter i to kombinationer; Biotin mærket behandlet RBC med Atto 633 mærkede ubehandlede røde blodlegemer og Atto 633 mærket behandlet RBC med Biotin mærket ubehandlede RBC (C). Disse to kombinationer injiceres separat i to partier inficerede mus under schizogony 2 - 15% parasitæmi (D). Der anbefales en alt 6 recipientmus for at opnå statistisk signifikans i resultatet, selv om mere eller mindre kan anvendes, hvis nødvendigt. Tilpasset fra Lelliott et al. 14, der oprindeligt udgivet af BioMed Central.

Figur 2
Figur 2. Måling af parasitæmi ved flowcytometri. Er Debris, støj og blodplader fjernes fra analyse baseret på FSC / SSC egenskaber (A). Enkelte celler udvælges derefter fra de resterende celler baseret på enten triggerimpuls bredde (B) eller FSC spids til arealforhold (C). Celletyper kan derefter skelnes på grundlag af positiv farvning med CD45 APC eFluor780 (leukocytter), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC progenitorer) eller negativ farvning (modne RBC'er) (D). Når du har valgt modne røde blodlegemer, celler er enten: Hoechst og JC-1 positive (parasitbehandlede RBC), Hoechst positiv og JC-1 negativ (RBC indeholder Howell Jolly organer), JC-1 positive og Hoechst negative (ukendte celler) eller dual negativ (ikke-inficerede RBC). Ikke-inficerede og P. chabaudi inficerede prøver farvet med Hoechst 33342 (E, F), eller Hoechst 34580 (G, H), vises. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Vurdering af merozoit invasion i to mærkede RBC populationer in vivo. Plots er af modne røde blodlegemer, gatedsom i figur 2. kan vælges to mærkede RBC populationer baseret på deres etiket (A). Atto 633 mærkede celler fluorescerer i 670/30 kanal (L1), biotin-mærket celler binder til streptavidin og fluorescerer i PE-Cy7 kanal (L3), og umærkede celler er negative for disse pletter (L4). I hver af disse populationer parasitbehandlede RBC kan identificeres på grundlag af Hoechst og JC-1 positiv farvning (Q2) (BD). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har beskrevet en fremgangsmåde til måling af både parasitæmi og merozoit invasion af in vivo-prøver. Med hensyn til parasitæmi måling denne metode giver en fordel i forhold til tidligere metoder 10-13 i at HJ-RBC kan skelnes fra pRBCs og dermed reducere antallet af falske positive begivenheder. Mens HJ-RBC er normalt sjældne i mennesker, nogle undersøgelser rapporterer høje niveauer i mus 15,16 at skelne mellem disse celler og pRBCs vigtige til nøjagtig måling af gnaver parasitæmi. Ved hjælp af denne metode detektionsgrænsen for parasitæmi er ca. 0,007% 14, selv om det er muligt at reducere det så lavt som 0,0005% under de rette betingelser. Især er denne grænse dikteret af renholdelse af flowcytometeret anvendes, og evnen til at opnå et stort antal hændelser i en rimelig tid. Det mest almindelige problem er forbundet med anvendelsen af ​​denne teknik er utilstrækkelig farvning with JC-1. Fluorescensen af ​​JC-1 afhænger mitokondriemembranpotentiale af parasitten, og parasitter skal være sunde for at opnå optimal farvning. Langvarig opbevaring af parasitter eller fiksering bør derfor undgås før farvning.

Man skal også udvises, når man analyserer parasitter, der har været genstand for narkotika interventioner, da dette også kan påvirke omfanget af farvning med JC-1. I disse tilfælde kan det være nyttigt at analysere parasitæmi baseret på Hoechst fluorescens alene, sammenlignet med parasitæmi med tilsætning af JC-1 farvestof. Faktisk kan dette giver et mål for parasit tæller, samt en samlet indikation af parasit sundhed. Endelig kan JC-1 farvestof flytte sin fluorescens fra en top ved 529 nm til en top ved 590 nm ved at danne J-aggregater. Dannelsen af ​​disse aggregater afhænger farvestofkoncentration, som igen afhænger af den mitokondrielle membranpotentiale af cellen. Tabet af mitokondriemembran Potential forårsager et skift i fluorescens i retning 529 nm, hvilket kan indikere celler apoptotiske. Det er vores erfaring pRBCs farvet med JC-1 altid udviste en lignende fluorescens mønster, som var omtrent lige intensitet i både 530/40 nm kanal og 585/42 nm kanal. Men i nogle undersøgelser, såsom dem, der anvender narkotika interventioner, kan det være værd at følge ændringer i fluorescens forholdet mellem 530/40 nm kanal og 585/42 nm kanal for indikationer på tabet af mitokondrie membranpotentiale. Det er også vigtigt at bemærke, at JC-1 er særligt modtagelige for nedbrydning og skal være frisk fremstillet ud fra en frossen alikvot som beskrevet, mens bør undgås fryse / optøningscykler. Efter farvning, JC-1 fluorescensen er relativt stabil med ringe eller ingen reduktion i fluorescens, i det mindste over flere timer.

Til in vivo invasion assay, de to mest kritiske faktorer er konsistens i RBC mærkning process og tidspunktet for injektion af mærket blod. For RBC mærkning, bør den mindste mængde farvestof anvendes til at forhindre interferens med evnen af parasitten at invadere RBC, der er blevet rejst som en mulighed, når du bruger overflade etiketter 7. Under de mærkningsbetingelser her beskrevne invasion ikke hæmmes 14, dog bør have særlig opmærksomhed opretholde konsistente label koncentrationer og farvestoffer bør skiftes, for at forhindre eventuelle unøjagtigheder pga invasion hæmning af RBC mærket. Som parasitter underkastes en synkroniseret invasion cyklus, er det vigtigt, at mærkede celler injiceres på det rigtige tidspunkt i parasitter livscyklus. Dette bør gøres for at maksimere antallet af invasion begivenheder og derfor nøjagtigheden af ​​assayet. Det er vores erfaring toppen af ​​invasion opstår omtrent halvvejs gennem den mørke cyklus, hvilket gør en omvendt lys cyklus plads fordelagtigt for denne analyse.

Two label invasion assay giver en præcis metode til at bestemme merozoit invasion effektivitet i forskellige typer af RBC in vivo. Denne fremgangsmåde tillader derfor en sammenligning mellem behandlede røde blodlegemer, dvs. trypsineret og kontrol roede blodlegemer. Alternativt kunne RBC'er fra genetisk modificerede mus sammenlignes med dem af kontrolmus eller RBC'er af forskellige fysiologiske parametre eller forskellig alder kunne sammenlignes. Mens en lignende assay er blevet beskrevet til måling af invasion in vitro 9 assayet her har potentiale til at redegøre for virkninger kun til stede in vivo, herunder påvirkning af immunsystemet, som potentielt kan ændre parasit invasion mekanismer 17-19. Endelig, dette assay har også potentiale til at give indsigt i patologier, såsom immun clearance af pRBCs og parasit vækst, hvis pRBCs inden de mærkede populationer overvåges over en længere periode.

Overall, er en detaljeret protokol til nøjagtig måling af parasitæmi i in vivo prøver beskrevet, som har en fordel i forhold til de tidligere analyser i at HJ-RBC kan skelnes fra pRBCs. Endvidere er en analyse beskrevet for kvantificering af invasion effektivitet i forskellige RBC typer in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender at finansiere støtte fra National Health og Medical Research Council (indrømme APP605524, 490.037 og 1.047.082), Australian Research Council (indrømme DP12010061), infrastruktur Strategi National Collaborative Research i Australien og Uddannelse investeringsfond fra Institut for Innovation, industri , videnskab og forskning. PML er en modtager af en australsk Postgraduate award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>In vivo</em> Vurdering af gnaver <em>Plasmodium</em> parasitæmi og merozoit Invasion ved flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter