Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Macquarie University en gelijkvormig aan de National Health en Medical Research Council (NHMRC) Australische gedragscode. Het werk werd uitgevoerd onder de overeenkomst Ethiek Geen ARA 2012/017 goedgekeurd en verkregen van de Animal Ethics Committee aan de Macquarie University. Alle experimenten werden uitgevoerd op SJL / J-muizen, tenzij anders vermeld.

1. Muizen en Experimentele malaria-infectie

  1. Huismuizen onder gecontroleerde temperatuur (21 ° C) met een 12:12 uur licht-donker cyclus.
  2. Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. chabaudi adami DS met 5% geparasiteerde RBC (pRBCs) en injecteer 200 ul in de intraperitoneale holte van C57BL / 6 donor muis.
  3. Monitor donor muis parasitemia elke 1-2 dagen met behulp van flowcytometrie zoals beschreven in hoofdstuk 3 - 4 van dit protocol. Zodra donoren 5 bereikt - 15% parasitemia, verzamel bloed door hartpunctie als volgt:
    1. Zuig 100 pl heparine-oplossing (300 E / ml heparine in muizen Ringer oplossing (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 10 mM glucose, 30 U / ml heparine, pH 7,4, 0,22 uM filter gesteriliseerd)) in een 1 ml spuit met een 26 G naald.
    2. Verdoven van de muis door inademing met 5% isofluorane, bevestiging van de gewenste diepte van de anesthesie door afwezigheid van pedaal terugtrekking reactie en hoornvlies reflexen.
    3. Plaats de muis op zijn kant en loodrecht insert naald net onder de elleboog, door de ribben, en in het hart. Trek zuiger langzaam en draai de naald tot 0,5-1 ml bloed wordt verkregen.
    4. Voer humane euthanasie door cervicale dislocatie onder verdoving.
  4. Bereken het pRBCs per volume van donorbloed uitgaande van een bloedbeeld van 9 x 10 6 RBC / ul (dat wil zeggen, als de donor was bij 10% parasitemia toen opgeofferd, bloed zal 9 x 10 5 bevattenPRBC / ul). Verdun geparasiteerde bloed in Krebs gebufferde zoutoplossing (126 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,2% glucose, pH 7,2, 0,22 uM filter gesteriliseerd) zodat de concentratie 1 x 10 4 pRBCs per 200 gl en injecteer 200 ul in de intraperitoneale holte van muizen die voor de RBC etikettering en transfusie experiment.
  5. Monitor parasitemia elke 1-2 dagen met behulp van flowcytometrie, zoals beschreven in de artikelen 3-4 van dit protocol.

2. Etikettering van RBC en Transfusion

  1. Verzamel gehepariniseerd bloed van muizen door hartpunctie zoals beschreven in stap 1.3 en plaats op ijs. Houd bloed bij 4 ° C te allen tijde. Verzamel ongeveer 200 pi bloed per muis worden geïnjecteerd. Indien nodig, gesplitst bloed in twee monsters en behandelen een monster gewenst.
    Opmerking: Zo invasie van de behandelde sample kan worden vergeleken met een controle, onbehandelde monster (zie Figuur 1 voor schematische).
  2. Bereid een 2x oplossing van elke fluorescerende RBC label.
    1. Verdun een 2 mg / ml voorraadoplossing van Atto 633-N-hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) in MTR zodat de concentratie 20 pg / ml.
    2. Verdun een 25 mg / ml voorraadoplossing van biotine-N-hydroxysuccinimide (biotine-NHS) in MTR zodat de concentratie 250 ug / ml.
  3. Splitsen bloedmonsters in twee buizen en een gelijk volume van 2x Atto 633-NHS oplossing voor één buis, en een gelijk volume van 2x biotine-NHS de andere buis. Onmiddellijk mengen. Incubeer bloed bij 4 ° C gedurende 1 uur onder constant traag mengen, of alternatief mengmonster elke 10-15 minuten.
  4. Was gelabeld bloed 3 maal met MTRC (MTR + 0,5% runderserumalbumine (BSA), 0,22 uM filter gesteriliseerd) als volgt:
    1. Voeg minstens 2 volumes MTRC gecentrifugeerd bij 750 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspend de pellet in ten minste 2 volumes MTRC. Herhaal 2 keer.
    2. Na de laatste wasbeurt, centrifuge bij 750 xg gedurende 5 minuten en combineer het ingehulde bloed in verschillende combinaties (dwz onbehandelde Atto 633 / behandeld biotine, onbehandelde Biotine / behandeld Atto 633). Voeg MTR aanvullen tot een volume van 200 pi per muis worden geïnjecteerd.
  5. Injecteren gelabeld bloed intravasculair in knaagdier malaria geïnfecteerde muizen of niet-geïnfecteerde controles als volgt:
    1. Voer transfusie 2-15% parasitemie bij de piek van parasiet schizogony.
      LET OP: dit gebeurt ongeveer halverwege het donker cyclus (dat wil zeggen, tussen 12-2 uur op een normaal licht cyclus, of 12-2 uur op een omgekeerde licht cyclus).
    2. Warm muizen met een warmtelamp gedurende 5-10 minuten om de bloedstroom te verhogen, maar voorzorgsmaatregelen nemen om de muizen geen oververhitting. Plaats muizen in een beveiligingssysteem en intravasculair injecteren 200 pi gelabeld bloed (ongeveer 1-2 x 10 9 RBCs) via de staartader.
  6. Verzamel bloedmonsters op verschillende tijdstippen na de injectie, zoals beschreven in hoofdstuk 3.
    OPMERKING: invasie prijs kan worden gekwantificeerd minder dan 10 min na injectie, afhankelijk van parasitemie van de ontvangende muis.

3. Het verzamelen van bloedmonsters en voorbereiding voor flowcytometrie

  1. Bereid 50 pi kleuroplossing per monster plus extra, op de dag van het experiment als volgt:
    1. Ontdooi een hoeveelheid van 6 mM JC-1 opgeslagen bij -20 ° C in dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Warme 50 ui MTRC per monster plus extra, tot 37 ° C.
    3. Onder voortdurend vortexen de voorverwarmde MTRC toevoegen JC-1, zodat de uiteindelijke concentratie 12 uM. Dit wordt gedaan om de vorming van JC-1 aggregaten verlagen; als aggregaten te vormen, niet centrifugebuis als deze vlekken wordt voorkomen.
      OPMERKING: Een kleine hoeveelheid van de samenvoeging heeft geen invloed op de resultaten.
    4. Voeg anti-CD45 APC eFluor 780 en anti-CD71 PerCP eFluor 710 zodat de uiteindelijke concentratie 1 gg / ml. Bij het uitvoeren van de gemerkte RBC experiment, voeg streptavidine PE-Cy7 zodat de uiteindelijke concentratie 1 gg / ml.
  2. Voeren staart bloeden door amputatie van het puntje van de staart of scheuring van het bloedvat in de staart. Breng een druppel staart bloed op een kleine wegen boot of glasplaatje. Na bloedafname, ervoor zorgen dat het bloeden is gestopt. Pipetteer 3 pl staart bloed in 50 gl kleuroplossing voorverwarmd tot 37 ° C en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 20 min.
  3. Ontdooi een hoeveelheid van 4 mM Hoechst 33342 bij -20 ° C in gedestilleerd water (bij gebruik van een 355 nm laser) of 2 mM Hoechst 34580 bij -20 ° C in gedestilleerd water (bij gebruik van een 405 nm laser). Bereid 500 ul per monster plus extra, van 4 uM of 2 pM oplossing van Hoechst in MTRC respectievelijk.
  4. Voeg 500 ul van 4 uM Hoechst33342 of 2 uM Hoechst 34580 monsters en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
  5. Centrifugeer cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant, voeg 700 ul MTRC en geanalyseerd door flowcytometrie.

4. flowcytometrie

  1. Analyseer monsters met behulp van een 355/488/633 nm laser of 405/488/633 nm laser instrument.
  2. Monsters filter door middel van een 35 uM cel zeef onmiddellijk voor analyse. Spoel cel zeef met gedestilleerd water tussen de monsters en hergebruik.
  3. Noteer genoeg gebeurtenissen, zodat de kleinste populatie bevat ten minste 500 evenementen (meestal 1.000.000 - 10.000.000 totaal gebeurtenissen per monster).
  4. Excite Hoechst 33342 met behulp van een 355 nm laser en opsporen van gebeurtenissen door middel van een 460/50-filter. Excite Hoechst 34580 met behulp van een 405 nm laser en opsporen van gebeurtenissen door middel van een 460/50-filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 en Streptavidine PE-Cy7 met behulp van een 488 nm laser en opsporen van gebeurtenissen door middel van een 530/40, 692/40, en 750LP filteren respectievely. Excite Atto 633 en anti-CD45 APC eFluor 780 met behulp van een 633 nm laser en respectievelijk opsporen van gebeurtenissen via een 670/30 of 750LP filter.
  5. Voeren analyses en compensatie met behulp van geschikte flowcytometrieanalyse software als volgt:
    1. Selecteer hele cellen en sluiten lawaai, puin, en bloedplaatjes op basis van FSC / SSC eigenschappen (Figuur 2A). Selecteer enkele cellen op basis van hetzij trekker pulsbreedte (figuur 2B) of met de FSC piekoppervlak hoogteverhouding (figuur 2C).
    2. Selecteer rijpe RBC, exclusief RBC voorouders en leukocyten, op basis van negatieve fluorescentie in de PerCP eFluor 710 en APC eFluor 780 kanalen (figuur 2D).
    3. Als het uitvoeren van de gelabelde RBC experiment, selecteert elke populatie van gelabelde RBC op basis van PE-Cy7 en Atto 633 fluorescentie en deze afzonderlijk (figuur 3A) te analyseren.
    4. Selecteer pRBCs gebaseerd op positieve fluorescentie voor zowel JC-1 en Hoechst (

5. Berekeningen en Statistiek

  1. Bereken parasitemie door het aantal van pRBCs door het totale aantal erytrocyten (dwz aantal gebeurtenissen in poort Q2 gedeeld door het aantal gebeurtenissen in de poort G4). Bij de uitvoering van de invasie assay parasitemie van de twee gelabelde populaties worden berekend door het aantal gelabelde pRBCs het aantal gelabelde erytrocyten in deze populatie (dwz aantal gebeurtenissen die in beide poorten L1 en Q2, gedeeld door het aantal gebeurtenissen in de poort L1).
    OPMERKING: Gelabeld parasitemia varieert aanzienlijk afhankelijk van factoren zoals de endogene parasitemie en het aantal circulerende merozoïeten. Daarom is het nuttig om de parasitemie verhouding, die wordt berekend als de parasitemie van de behandelde gemerkte populatie gedeeld door de parasitemie van de controle gemerkte populatie in elke afzonderlijke muis melden. Om te corrigeren voor mogelijke dye effecten, rapport resulteert eens een gemiddelde parasitemia verhouding over de twee kleurstof combinaties.
  2. Bepaal statistische significantie van verhoudingen met behulp van het ene monster t-test met 1 als de hypothetische gemiddelde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Meting van parasitemie.

Voor het meten van parasitemia, moet bloedcellen eerst worden geselecteerd, en lawaai, vuil en bloedplaatjes uitgesloten, op basis van FSC / SSC eigenschappen (Figuur 2A). Afhankelijk van de cytometer gebruikt, dienen enkele cellen worden geselecteerd op basis van hetzij trekker pulsbreedte (figuur 2B) of FSC piekhoogte te oppervlakteverhouding (figuur 2C). Resterende gebeurtenissen moet bestaan ​​uit leukocyten, gekleurd positief voor APC eFluor 780, RBC voorouders (inclusief reticulocyten), gekleurd positief voor PerCP eFluor 710, en volwassen RBC, negatief voor deze beide vlekken (figuur 2D). Na het selecteren van de rijpe RBC bevolking, moeten gebeurtenissen scheiden in vier bevolkingsgroepen bij JC-1 fluorescentie wordt uitgezet tegen Hoechst 33342 (figuur 2E, F) of Hoechst 34580 (figuur 2G, H) fluorescentie. De dual positieve bevolking vertegenwoordigt geparasiteerde RBC, terwijl de remaining populatie zijn ofwel niet-geïnfecteerde rode bloedcellen (dual negatief), HJ-RBC (Hoechst positief, JC-1 negatief), of onbekende cellen (JC-1 positieve, Hoechst negatief). Met name kan JC-1 fluorescentie verschuiven van maximum bij 529 nm een ​​brede piek emissie bij 590 nm, afhankelijk van de mitochondriale membraanpotentiaal van de cel. Ongeacht deze verschuiving JC-1 zal sterk fluoresceren in de 530/40 nm kanaal, waardoor dit kanaal het meest geschikt voor analyse. In sommige gevallen voordelig dat bovendien opnemen fluorescentie in het 585/42 nm kanaal, die een indicatie van de mitochondriale membraanpotentiaal van cellen voorzien zijn. In niet-geïnfecteerde monsters moet minder dan 0,007% van de gebeurtenissen dual positief (figuur 2E, G) zijn. Dit resultaat zal afhangen van de netheid van de stromingscytometer en kunnen aanzienlijk verschillen, kan uitgebreid schoonmaken voordat de analyse resultaten te verbeteren. HJ-RBC vertegenwoordigen 0,3-0,9% van rijpe erytrocyten, waardoor de toevoeging van de kleurstof JC-1 essentieel is voor het accuraat meting van lage parasitemia.

Beoordeling van merozoïet invasie.

Na de injectie gelabelde RBC in geïnfecteerde muizen kan worden bepaald de relatieve invasie tarieven in de twee gelabelde populaties. Bloedmonsters worden genomen en bereid zoals beschreven voor de parasitemie meting met de toevoeging van Streptavidine PE Cy7. Het tijdstip waarop het monster wordt genomen afhankelijk van de experimentele omstandigheden en de gewenste uitkomst van het onderzoek. In het algemeen zal een eerder tijdstip best bij een invasie fenotype, hoewel het voordelig om meerdere tijdstippen verzamelen om nauwkeurigheid te vergroten kan zijn. Voor de analyse van flowcytometrie gegevens dient rijpe RBC's worden geselecteerd zoals in figuur 2. Uit deze cellen kunnen Atto 633 en biotine gelabelde erytrocyten worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie in de 670/30 en 750LP kanalen respectievelijk (Figuur 3A). Vanaf hier drie RBC populaties (Atto 633, biotine, en ongelabelde)afzonderlijk moeten worden onderzocht. In elk van deze populaties parasitemie kan worden bepaald op basis kleuring met Hoechst en JC-1 (Figuur 3B-D).

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van de in vivo parasiet invasie assay. Een voorbeeld van deze test kan worden gebruikt om het relatieve invasie prijzen in RB behandeld volgens de gebruiker biologische moeten bepalen getoond. Bloed vanuit geïnfecteerde muizen verdeeld in twee buizen. Een buis wordt behandeld als gewenst, terwijl het andere monster onbehandeld (A). Buizen worden opnieuw verdeeld met een label met NHS-biotine en de andere met NHS-Atto 633 (B). Monsters worden vervolgens gecombineerd in twee combinaties; Biotine gelabeld behandeld RBC met Atto 633 gelabelde onbehandeld RBC en Atto 633 gelabeld behandeld RBC met Biotin gelabeld onbehandeld RBC (C). Deze twee combinaties afzonderlijk geïnjecteerd in twee partijen van geïnfecteerde muizen gedurende schizogony op 2-15% parasitemie (D). Totaal 6 ontvangende muizen wordt aanbevolen om statistische significantie te krijgen in het resultaat, hoewel meer of minder kunnen worden gebruikt indien nodig. Aangepast van Lelliott et al. 14, oorspronkelijk gepubliceerd door BioMed Central.

Figuur 2
Figuur 2. Meting van parasitemia door flowcytometrie. Zijn Debris, lawaai, en bloedplaatjes verwijderd uit analyse op basis van FSC / SSC eigenschappen (A). Enkele cellen worden vervolgens uit het resterende cellen op basis van hetzij trekker pulsbreedte (B) of FSC piek-oppervlakteverhouding (C). Celtypen kunnen vervolgens worden onderscheiden op basis van positieve kleuring met CD45 APC eFluor780 (leukocyten), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC voorouders), of negatieve kleuring (volwassen RBC) (D). Na het selecteren van rijpe rode bloedcellen, cellen zijn ofwel: Hoechst en JC-1 positieve (geparasiteerde RBC), Hoechst positieve en JC-1 negatieve (RBC met Howell Jolly lichamen), JC-1 positieve en Hoechst negatieve (onbekend cellen), of dual negatief (niet-geïnfecteerde rode bloedcellen). Niet-geïnfecteerde en P. chabaudi besmette monsters gekleurd met Hoechst 33342 (E, F) of Hoechst 34580 (G, H), worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Beoordeling van merozoïet invasie in twee gelabelde RBC populatie in vivo. Percelen zijn van rijpe RBC, gatedzoals in figuur 2. De twee gemerkte RBC populaties kunnen worden geselecteerd op label (A). Atto 633 gelabelde cellen fluoresceren in het kanaal 670/30 (L1), biotine gelabelde cellen binden aan streptavidine en fluoresceren in de PE-Cy7 kanaal (L3) en ongelabelde cellen zijn negatief voor deze vlekken (L4). In elk van die populaties geparasiteerde RBC kan worden geïdentificeerd op basis van Hoechst en JC-1 positieve kleuring (Q2) (BD). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

We hebben een werkwijze beschreven voor het meten van zowel parasitemie en merozoïet invasie van in vivo monsters. In termen van parasitemia meting, biedt deze methode een voordeel ten opzichte van eerdere methoden 10-13 in die HJ-rode bloedcellen kan worden onderscheiden van pRBCs, waardoor het aantal valse positieve gebeurtenissen verminderen. Terwijl HJ-RBC's zijn meestal zeldzaam bij de mens, ook onderzoeken met hoge niveaus bij muizen 15,16 het onderscheiden van deze cellen en pRBCs belangrijk voor de nauwkeurige meting van knaagdieren parasitemie. Met deze methode de detectielimiet voor parasitemie ongeveer 0,007% 14, hoewel het mogelijk is om dit zo laag als 0,0005% onder de juiste omstandigheden te verminderen. Met name wordt deze grens bepaald door de netheid van de flowcytometer gebruikt en de mogelijkheid om grote aantallen gebeurtenissen te verkrijgen in een redelijke hoeveelheid tijd. De meest voorkomende probleem bij het gebruik van deze techniek onvoldoende kleuring with JC-1. De fluorescentie van JC-1 afhankelijk van de mitochondriale membraanpotentiaal van de parasiet en parasieten moeten gezond om een ​​optimale kleuring te verkrijgen. Langdurige opslag van parasieten of fixatie moet daarom worden vermeden voordat kleuring.

Zorg moet ook worden betracht bij het analyseren van parasieten die onderworpen zijn aan drugs interventies zijn geweest, want dit kan ook invloed hebben op de mate van kleuring met JC-1. In deze gevallen kan het nuttig zijn parasitemie basis van Hoechst fluorescentie alleen analyseren in vergelijking met parasitemie met de toevoeging van de JC-1 dye. Inderdaad, kan dit een maat parasiet tellen, en in algemene zin parasiet gezondheid. Tenslotte, de JC-1 kleurstof zijn fluorescentie bij 529 nm bij 590 nm verschuiving van een piek naar een piek door het vormen van J-aggregaten. De vorming van deze aggregaten afhankelijk kleurstofconcentratie, die op zijn beurt afhangt van de mitochondriale membraanpotentiaal van de cel. Het verlies van mitochondriale membraan potentiAl veroorzaakt een verschuiving in fluorescentie tot 529 nm, die kunnen duiden cellen apoptotisch. In onze ervaring pRBCs gekleurd met JC-1 altijd vertoonden een vergelijkbare fluorescentie patroon dat was van ongeveer gelijke sterkte in zowel de 530/40 nm-kanaal en de 585/42 nm kanaal. In sommige studies, zoals die gebruik geneesmiddelen toe, kan het nuttig zijn om wijzigingen in de fluorescentie verhouding tussen 530/40 nm kanaal en 585/42 nm kanaal voor aanwijzingen voor het verlies van mitochondriale membraanpotentiaal controleren. Het is ook belangrijk op te merken dat JC-1 is bijzonder gevoelig voor degradatie en moet vers worden bereid uit een bevroren monster beschreven, terwijl vries / dooi cycli moeten worden vermeden. Na het kleuren JC-1 fluorescentie relatief stabiel met weinig of geen vermindering in fluorescentie ten minste gedurende enkele uren.

Voor de in vivo invasie assay, de twee meest kritische factoren zijn consistent in de RBC etiket process en het tijdstip van injectie van gelabelde bloed. Voor RBC etikettering, dient de minimale hoeveelheid kleurstof worden gebruikt om elke interferentie met het vermogen van de parasiet op de RBC, die is opgevoed als een mogelijkheid om bij het ​​gebruik van oppervlaktewater labels 7 binnen te vallen te voorkomen. Onder het etiket beschreven invasie niet geremd 14 echter aandacht worden besteed aan behoud van de label concentraties en kleurstoffen worden geschakeld, om eventuele onnauwkeurigheden door remming invasie door de RBC label voorkomen. Als parasieten ondergaan een gesynchroniseerde invasie cyclus, is het belangrijk dat gemerkte cellen worden geïnjecteerd op het juiste moment op de parasieten levenscyclus. Dit dient om het aantal invasie gebeurtenissen en derhalve de nauwkeurigheid van de bepaling te maximaliseren. In onze ervaring de piek van de invasie vindt ongeveer halverwege het donker cyclus, het maken van een omgekeerde licht cyclus kamer voordelig voor deze test.

De two label invasie assay biedt een accurate manier om merozoïet invasie efficiëntie in verschillende soorten RBC in vivo te bepalen. Deze benadering maakt derhalve een vergelijking tussen behandelde erytrocyten, dwz getrypsiniseerd en controle RBC. Alternatief zou RBC genetisch gemodificeerde muizen worden vergeleken met die van controlemuizen of RBC verschillende fysiologische parameters of andere tijd kunnen worden vergeleken. Terwijl een vergelijkbare bepaling is beschreven voor het meten van de invasie in vitro 9 de assay biedt hier de mogelijkheid om rekening te houden effecten alleen aanwezig in vivo, inclusief de invloed van het immuunsysteem, die mogelijk parasiet invasie mechanismen 17-19 kan veranderen. Tenslotte, deze test heeft ook het potentieel om inzichten verschaffen pathologieën zoals de immuunklaring van pRBCs en parasietgroei, indien de pRBCs binnen de gemerkte populaties worden gevolgd gedurende een langere periode.

Overall, een gedetailleerd protocol voor de nauwkeurige meting van parasitemie in vivo monsters wordt beschreven, hetgeen een voordeel boven eerdere assays die HJ-RBC heeft kunnen worden onderscheiden van pRBCs. Bovendien wordt een test beschreven voor het kwantificeren van invasie efficiëntie in verschillende RBC types in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij erkennen de financiering van de steun van de National Health en Medical Research Council (verlenen APP605524, 490.037 en 1.047.082), de Australian Research Council (verlenen DP12010061), de National Collaborative Research Infrastructure strategie van Australië en de Onderwijs investeringsfonds van het ministerie van Innovatie, Industrie , wetenschap en onderzoek. PML is een ontvanger van een Australische Postgraduate award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>In vivo</em> evaluatie van het knaagdier <em>Plasmodium</em> parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter