Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Gli invade parassita della malaria e replicati all'interno delle cellule rosse del sangue. La valutazione accurata di invasione merozoite e parassitemia è quindi fondamentale per la valutazione nel corso di infezione malarica. Qui si descrive un protocollo basato citometria a flusso per la misurazione di questi parametri in un modello murino di malaria.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le politiche di Macquarie University e conformi al Consiglio nazionale della sanità e ricerca medica (NHMRC) Codice australiano di pratica. Il lavoro è stato svolto sotto gli Etica accordo No ARA 2012/017 approvate e ottenuto da parte del Comitato Etico degli animali presso Macquarie University. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su SJL / J topi se non indicato diversamente.

1. Mouse e Sperimentale Malaria Infezione

  1. Mice House a temperatura controllata (21 ° C), con un ciclo luce-buio 12:12 h.
  2. Scongelare una aliquota di crioconservati P. chabaudi adami DS con 5% parassitati globuli rossi (pRBCs) e iniettare 200 ml nella cavità intraperitoneale di C57BL / 6 del mouse donatore.
  3. Monitorare donatore del mouse parassitemia ogni 1 - 2 giorni in citometria a flusso, come descritto nella Sezione 3 - 4 del presente protocollo. Una volta che i donatori raggiunge 5-15% parassitemia, raccogliere il sangue dalla puntura cardiaca come segue:
    1. Aspirare 100 ml di soluzione di eparina (300 U / ml di eparina in soluzione di Ringer topo (MTR) (154 mM NaCl, KCl 5,6 mM, 1 mM MgCl 2, 2.2 mM CaCl 2, 20 mM HEPES, glucosio 10 mM, 30 U / ml eparina, pH 7,4, 0,22 mM filtro sterilizzato)) in una siringa da 1 ml con un ago 26 G.
    2. Anestetizzare il mouse per inalazione con il 5% isofluorane, confermando la profondità desiderata di anestesia per mancanza di risposta ritiro del pedale e riflessi corneali.
    3. Posizionare il mouse sul suo lato e perpendicolarmente ago inserto appena sotto il gomito, attraverso le costole, e nel cuore. Estrarre lo stantuffo della siringa lentamente e ruotare ago fino a 0,5 - si ottiene 1 ml di sangue.
    4. Eseguire l'eutanasia umana da dislocazione cervicale sotto anestesia.
  4. Calcolare i pRBCs per volume di sangue dei donatori assumendo un emocromo di 9 x 10 6 RBC / ml (ossia, se il donatore era al 10% parassitemia quando sacrificati, il sangue conterrà 9 x 10 5pRBC / ml). Diluire il sangue parassitati in Krebs tamponata salina (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 0.2% di glucosio, pH 7,2, 0,22 mM filtro sterilizzato) in modo che la concentrazione è 1 x 10 4 pRBCs per 200 microlitri e iniettare 200 microlitri nella cavità intraperitoneale di topi necessari per l'etichettatura RBC e sperimentare trasfusione.
  5. Monitorare parassitemia ogni 1 - 2 giorni in citometria a flusso, come descritto nei paragrafi 3-4 di questo protocollo.

2. Etichettatura dei globuli rossi e Transfusion

  1. Prelevare il sangue eparinizzato da topi mediante puntura cardiaca come descritto al punto 1.3, e disporli sul ghiaccio. Mantenere il sangue a 4 ° C in ogni momento. Raccogliere circa 200 ml di sangue per il mouse da iniettare. Se necessario, dividere il sangue in due campioni e trattare un campione, se lo desideri.
    NOTA: In questo modo, invasione del samp trattatale può essere paragonato ad un controllo, campione non trattato (vedere Figura 1 per schematica).
  2. Preparare una soluzione 2x di ogni etichetta RBC fluorescente.
    1. Diluire a / ml soluzione madre 2 mg di Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) in MTR modo che la concentrazione è di 20 mg / ml.
    2. Diluire a / ml soluzione madre 25 mg di biotina-N-Hydroxysuccinimide (biotina-NHS) in MTR modo che la concentrazione di 250 ug / ml.
  3. Split campioni di sangue in due provette e aggiungere un volume uguale di soluzione di 2x Atto 633-NHS ad un tubo, e un volume uguale del 2x biotina-NHS per l'altro tubo. Mescolare immediatamente. Incubare sangue a 4 ° C per 1 ora con costante miscelazione lenta, o in alternativa, miscelare campione ogni 10 - 15 minuti.
  4. Lavare etichettati sangue 3 volte con MTRC (MTR + 0,5% di siero albumina bovina (BSA), 0,22 mM filtro sterilizzato) come segue:
    1. Aggiungere almeno 2 volumi di MTRC, centrifugare a 750 xg per 5 min, rimuovere il supernatante e resuspend il pellet in almeno 2 volumi di MTRC. Ripetere 2 volte.
    2. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare a 750 xg per 5 minuti e combinare il sangue pellet in diverse combinazioni (ad esempio, non trattata Atto 633 / trattati biotina, non trattati biotina / trattata Atto 633). Aggiungere MTR per portare a un volume di 200 ml per topo da iniettare.
  5. Iniettare sangue marcato per via intravascolare in roditori malaria topi infettati o controlli non infetti come segue:
    1. Eseguire trasfusione a 2 - 15% parassitemia al culmine di parassita schizogonia.
      NOTA: ciò avviene circa a metà del ciclo di buio (cioè tra 12 - 2 am il normale ciclo di luce, o 12 - 2 pm un ciclo di luce inversa).
    2. Topi calda usando una lampada di calore per 5-10 minuti per aumentare il flusso di sangue, ma di prendere precauzioni per non surriscaldare i topi. Inserire topi in un dispositivo di ritegno e iniettare per via intravascolare 200 microlitri di sangue marcato (circa 1 - 2 x 10 9 RBCs) attraverso la vena della coda.
  6. Raccogliere campioni di sangue in diversi momenti dopo l'iniezione, come descritto nella Sezione 3.
    NOTA: i tassi di invasione possono essere quantificabili in meno di 10 minuti dopo l'iniezione, a seconda parassitemia del mouse destinatario.

3. Raccolta di campioni di sangue e di preparazione per Citometria a Flusso

  1. Preparare 50 ml di soluzione colorante per campione, più extra, il giorno dell'esperimento come segue:
    1. Scongelare una aliquota di 6 JC-1 mM conservati a -20 ° C in dimetil solfossido (DMSO).
    2. Caldo 50 ml di MTRC per campione, più extra, a 37 ° C.
    3. Mentre continua il vortex MTRC pre-riscaldato, aggiungere JC-1 in modo che la concentrazione finale è di 12 micron. Questo viene fatto per ridurre la formazione di aggregati JC-1; se aggregati si formano, fare tubo non centrifuga in modo da evitare la colorazione.
      NOTA: Una piccola quantità di aggregazione non influirà risultati.
    4. Aggiungi anti-CD45 APC eFluor 780 e anti-CD71 PerCP eFluor 710 in modo che la concentrazione finale è di 1 mg / ml. Se si esegue l'esperimento RBC etichetta, aggiungere streptavidina PE-Cy7 in modo che la concentrazione finale è di 1 mg / ml.
  2. Eseguire sanguinamento coda da amputazione della punta della coda o lacerazione del vaso sanguigno nella coda. Mettere una goccia di sangue di coda su una piccola barca o pesare vetrino. Dopo la raccolta del sangue, assicurarsi che l'emorragia si è fermata. Pipettare 3 ml di sangue coda in 50 ml di soluzione colorante pre-riscaldato a 37 ° C e incubare i campioni a 37 ° C per 20 min.
  3. Scongelare una aliquota di 4 mM Hoechst 33342 conservati a -20 ° C in acqua distillata (se si utilizza un laser 355 nm) o 2 mM Hoechst 34580 conservati a -20 ° C in acqua distillata (se si utilizza un laser 405 nm). Preparare 500 microlitri per campione, più extra, di una soluzione di 4 micron o 2 micron di Hoechst in MTRC rispettivamente.
  4. Aggiungere 500 ml di 4 micron Hoechst33342 o 2 mM Hoechst 34580 campioni e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  5. Cellule centrifugare a 750 xg per 3 min a 4 ° C, scarto surnatante, aggiungere 700 microlitri MTRC e analizzare mediante citometria a flusso.

4. Citometria a flusso

  1. Analizzare i campioni utilizzando un laser 355/488/633 nm o 405/488/633 strumento laser nm.
  2. Filtrare i campioni attraverso un colino cella di 35 micron immediatamente prima dell'analisi. Risciacquare filtro cella con acqua distillata tra campioni e riutilizzo.
  3. Registra abbastanza eventi in modo che la popolazione più piccola contiene almeno 500 eventi (di solito 1.000.000 - 10.000.000 eventi totali per campione).
  4. Excite Hoechst 33342 utilizzando un laser 355 nm e rilevare eventi attraverso un filtro 460/50. Excite Hoechst 34580 utilizzando un laser 405 nm e rilevare gli eventi attraverso un filtro 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 e PE-Streptavidina Cy7 utilizzando un laser 488 nm e rilevare gli eventi attraverso una 530/40, 692/40, e 750LP filtrare rispettivoly. Excite Atto 633 e anti-CD45 APC eFluor 780 utilizzando un laser 633 nm e di rilevare, rispettivamente, gli eventi attraverso un filtro 670/30 o 750LP.
  5. Eseguire l'analisi e la compensazione con flusso adeguato citometria software di analisi come segue:
    1. Selezionare cellule intere ed escludere rumore, detriti e piastrine basato su FSC / proprietà SSC (Figura 2A). Selezionare singole cellule basate su entrambi larghezza di impulso di trigger (Figura 2B) o utilizzando l'area del picco FSC al rapporto di altezza (Figura 2C).
    2. Selezionare globuli rossi maturi, ed escludere progenitori e leucociti RBC, sulla base di fluorescenza negativo nei PerCP eFluor 710 e APC eFluor 780 canali (Figura 2D).
    3. Se si esegue l'esperimento RBC etichetta, selezionare ogni popolazione di globuli rossi etichettati sulla base di PE-Cy7 e Atto 633 fluorescenza e analizzare questi separatamente (Figura 3A).
    4. Selezionare pRBCs basata su fluorescenza positiva sia JC-1 e Hoechst (

5. Calcoli e Statistiche

  1. Calcolare parassitemia dividendo il numero di pRBCs per il numero totale dei globuli rossi (cioè, il numero di eventi in cancello Q2 e il numero di eventi in porta G4). Nell'effettuare la parassitemia dosaggio invasione dei due popolazioni etichettati può essere calcolata dividendo il numero di pRBCs etichettate per il numero di globuli rossi etichettati in quella popolazione (cioè, il numero di eventi che sono sia porte L1 e Q2, diviso per il numero di eventi in porta L1).
    NOTA: etichetta parassitemia varia notevolmente a seconda di fattori quali la parassitemia endogena e il numero di merozoiti circolanti. Per questo motivo, è utile per segnalare il rapporto parassitemia, che viene calcolato come parassitemia della popolazione trattata etichettato diviso per il parassitemia della popolazione di controllo etichettata in ciascun topo. Per correggere eventuali effetti tintura, rapporto risulta uns un rapporto medio parassitemia tra i due combinazioni di tintura.
  2. Determinare la significatività statistica dei rapporti con il t-test un campione con 1 come media ipotetica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Misura della parassitemia.

Per la misura di parassitemia, cellule del sangue devono prima essere selezionati, e il rumore, detriti e piastrine esclusi, sulla base di FSC / SSC proprietà (Figura 2A). A seconda del citometro utilizzato, singole cellule devono poi essere selezionati sulla base sia di larghezza di impulso di trigger (Figura 2B), o altezza del picco FSC rapporto dell'area (Figura 2C). Rimanendo eventi dovrebbero consistere di leucociti, colorate positivo per APC eFluor 780, progenitori RBC (compresi i reticolociti), macchiate positivo per PerCP eFluor 710, e globuli rossi maturi, negative per entrambe le macchie (Figura 2D). Dopo aver selezionato la popolazione matura RBC, eventi dovrebbero separare in quattro popolazioni quando JC-1 fluorescenza è tracciata contro Hoechst 33342 (Figura 2E, F) o Hoechst 34580 (Figura 2G, H) di fluorescenza. La popolazione dual positivo rappresenta RBC parassitizzate, mentre il rpopolazioni emaining sono o globuli rossi non infetti (dual negativo), HJ-globuli rossi (Hoechst positivo, JC-1 negativo), o cellule sconosciute (JC-1 positivo, Hoechst negativo). In particolare, JC-1 fluorescenza può passare da un massimo a 529 nm per un ampio picco di emissione a 590 nm, a seconda del potenziale di membrana mitocondriale della cellula. Indipendentemente da questo spostamento JC-1 fluorescenza fortemente nel 530/40 nm canale, rendendo questo canale più idoneo per l'analisi. Tuttavia, in alcuni casi può essere utile per la fluorescenza ulteriormente record nel 585/42 nm canale, che possono fornire un'indicazione del potenziale di membrana mitocondriale di cellule. Nei campioni non infetti meno del 0,007% degli eventi dovrebbe essere dual positivo (Figura 2E, G). Tale risultato dipende dalla pulizia del citometro a flusso e può variare considerevolmente, una pulizia prima analisi può migliorare i risultati. Conto HJ-RBC per 0,3-0,9% di eritrociti maturi, rendendo l'aggiunta del colorante JC-1 critico per l'accMisura urato di bassa parassitemia.

Valutazione della merozoite invasione.

Dopo l'iniezione RBC etichettati in topi infettati le tariffe relative invasione nelle due popolazioni etichettati possono essere determinati. I campioni di sangue devono essere prelevati e preparati come descritto per la misurazione parassitemia con l'aggiunta di Streptavidina PE Cy7. Il momento in cui viene prelevato il campione dipende dalle condizioni sperimentali e dell'esito desiderato dell'analisi. In generale, un punto temporale precedente rifletterà meglio un fenotipo invasione, anche se può essere utile per raccogliere più punti di tempo per aumentare la precisione. Per l'analisi di citometria a flusso di dati, i globuli rossi maturi dovrebbero essere selezionati come in figura 2. Da queste cellule, Atto 633 e biotina marcata globuli rossi possono essere identificati in base a fluorescenza nei canali 670/30 e 750LP rispettivamente (Figura 3A). Da qui in poi i tre popolazioni RBC (Atto 633, biotina, e senza etichetta)vanno indicati separatamente. In ciascuna di tali popolazioni parassitemia può essere determinato sulla base di colorazione con Hoechst e JC-1 (Figura 3B-D).

Figura 1
Figura 1. Schema del test in vivo parassita invasione. Un esempio di come questo test può essere utilizzato per determinare i tassi di invasione relativi a globuli rossi trattati secondo la domanda biologica dell'utente viene mostrata. Il sangue raccolti da topi non infetto è diviso in due tubi. Un tubo viene trattata come desiderato mentre l'altro campione viene lasciata non trattata (A). I tubi sono di nuovo divisi con un marcato con NHS-biotina e l'altro con NHS-Atto 633 (B). I campioni vengono poi combinati in due combinazioni; Biotina etichettato globuli rossi trattati con Atto 633 GR non trattati etichettati e Atto 633 etichettato globuli rossi trattati con Biostagno etichettato globuli rossi trattati (C). Queste due combinazioni sono iniettati separatamente in due lotti di topi infetti durante schizogonia a 2 - 15% parassitemia (D). Un totale di 6 topi riceventi è raccomandato per ottenere significatività statistica nel risultato, anche se più o meno possono essere utilizzate se necessario. Adattato da Lelliott et al. 14, originariamente pubblicato da BioMed Central.

Figura 2
Figura 2. Misura di parassitemia mediante citometria di flusso. Detriti, il rumore e le piastrine vengono rimossi da analisi basate su FSC / SSC proprietà (A). Cellule singole sono poi selezionati dalle cellule rimanenti sulla base sia di larghezza di impulso di trigger (B), o picco FSC rapporto dell'area (C). Tipi di cellule possono essere distinti in base a colorazione positiva con CD45 APC eFluor780 (leucociti), CD71 PerCP eFluor 710 (progenitori RBC), o colorazione negativa (globuli rossi maturi) (D). Dopo aver selezionato globuli rossi maturi, le cellule sono sia: Hoechst e JC-1 positivi (globuli rossi parassitati), Hoechst, JC-1 negativo positivo e negativo Hoechst (cellule sconosciuti), o doppio positivo e JC-1 negativo (globuli rossi contenenti i corpi Howell Jolly) (globuli rossi infetti). Non infetti e P. chabaudi campioni infettati colorati con Hoechst 33342 (E, F), o Hoechst 34580 (G, H), sono mostrati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Valutazione di merozoite invasione in due popolazioni di globuli rossi etichettati in vivo. Parcelle sono di globuli rossi maturi, gatedcome in Figura 2. Le due popolazioni RBC etichettati possono essere selezionati in base alla loro etichetta (A). Atto 633 cellule marcate fluorescenti nel canale 670/30 (L1), cellule biotina marcata legano a streptavidina e fluorescenti nel canale PE-Cy7 (L3), e le cellule senza etichetta sono negativi per queste macchie (L4). In ognuna di queste popolazioni globuli rossi parassitati possono essere identificati in base a Hoechst e JC-1 colorazione positiva (Q2) (BD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Abbiamo descritto un metodo per la misura sia parassitemia e merozoite invasione campioni in vivo. In termini di misurazione parassitemia, questo metodo offre un vantaggio rispetto ai metodi precedenti 10-13 in quella HJ-globuli rossi possono essere distinti da pRBCs, riducendo così il numero di eventi positivi falsi. Mentre HJ-globuli rossi sono di solito rare negli esseri umani, alcuni studi riportano livelli elevati nei topi 15,16 la distinzione tra queste cellule e pRBCs importanti per la misurazione accurata di roditore parassitemia. Usando questo metodo il limite di rilevazione per parassitemia è approssimativamente 0,007% 14, anche se è possibile ridurre questo partire da 0,0005% nelle condizioni giuste. In particolare, questo limite è dettato dalla pulizia del citometro a flusso utilizzato e la capacità di ottenere un gran numero di eventi in un tempo ragionevole. Il problema più comune associato con l'uso di questa tecnica è insufficiente colorazione biancoh JC-1. La fluorescenza di JC-1 dipende dal potenziale di membrana mitocondriale del parassita, e parassiti deve essere sano per ottenere la colorazione ottimale. Stoccaggio prolungato di parassiti o fissaggio deve pertanto essere evitato prima della colorazione.

Si dovrebbe anche essere esercitata quando si analizzano i parassiti che sono stati oggetto di interventi di droga, in quanto ciò potrebbe anche influenzare il grado di colorazione con JC-1. In tali casi può essere utile per analizzare parassitemia basato su Hoechst fluorescenza solo, rispetto al parassitemia con l'aggiunta del JC-1 dye. Infatti, questo può fornire una misura di conteggio parassita, nonché un'indicazione generale di salute parassita. Infine, il JC-1 colorante può spostare la sua fluorescenza da un picco a 529 nm per un picco a 590 nm formando J-aggregati. La formazione di questi aggregati dipende concentrazione di colorante, che a sua volta dipende dal potenziale di membrana mitocondriale della cellula. La perdita di membrana mitocondriale Potential provoca uno spostamento della fluorescenza verso 529 nm, che può indicare cellule sono apoptotico. Nella nostra esperienza pRBCs colorati con JC-1 sempre mostrato un andamento simile a fluorescenza, che era di circa uguale intensità sia nel 530/40 nm del canale e la 585/42 nm canale. Tuttavia, in alcuni studi, come quelli che impiegano interventi droga, può essere utile per monitorare le variazioni nel rapporto di fluorescenza tra il 530/40 nm canale e l'585/42 nm canale per qualsiasi indicazione della perdita di potenziale di membrana mitocondriale. E 'anche importante notare che JC-1 è particolarmente suscettibile alla degradazione e dovrebbe essere preparata da una aliquota congelata come descritto, mentre i cicli di congelamento / scongelamento dovrebbero essere evitati. Dopo la colorazione, JC-1 fluorescenza è relativamente stabile con poca o nessuna riduzione della fluorescenza, almeno per alcune ore.

Per il saggio di invasione in vivo, i due fattori più critici sono la coerenza nell'etichettatura pr RBCocess e il tempo di iniezione di sangue marcato. Per l'etichettatura RBC, la quantità minima di colorante dovrebbe essere usato per evitare qualsiasi interferenza con la capacità parassita di invadere la RBC, che è stata sollevata come una possibilità quando si utilizzano etichette superficie 7. Nelle condizioni di etichettatura qui descritte invasione non è inibita 14, tuttavia attenzione deve essere dedicata a mantenere concentrazioni etichette coerenti, e coloranti deve essere attivata, per evitare eventuali imprecisioni dovute all'inibizione invasione dall'etichetta RBC. Come parassiti subiscono un ciclo invasione sincronizzato, è importante che le cellule marcate vengono iniettate al momento giusto nel ciclo di vita parassiti. Questo deve essere fatto in modo da massimizzare il numero di eventi di invasione, e quindi la precisione del dosaggio. Nella nostra esperienza il picco dell'invasione avviene circa a metà del ciclo di buio, facendo una stanza ciclo di luce retromarcia vantaggioso per questo test.

La two test etichetta invasione offre un metodo accurato per determinare merozoite efficienza invasione in diversi tipi di RBC in vivo. Questo approccio permette dunque un confronto tra RBC trattati, cioè tripsinizzati, e globuli rossi di controllo. In alternativa, i globuli rossi di topi geneticamente modificati potrebbero essere paragonate a quelle di topi di controllo, o globuli rossi di diversi parametri fisiologici o età diversa potrebbe essere paragonato. Mentre un test simile è stato descritto per la misurazione di invasione in vitro 9, il saggio qui fornisce il potenziale per tenere conto di effetti presenti solo in vivo, compresa l'influenza del sistema immunitario, che può potenzialmente alterare meccanismi parassita invasione 17-19. Infine, questo test ha anche il potenziale per fornire approfondimenti patologie quali la raccolta immunitario pRBCs, e la crescita del parassita, se i pRBCs all'interno delle popolazioni etichettati vengono monitorate per un periodo prolungato.

Overall, un protocollo dettagliato per la misurazione accurata di parassitemia in vivo campioni è descritto, che ha un vantaggio rispetto saggi precedenti che HJ-globuli rossi può essere distinto da pRBCs. Inoltre, un test è descritto per la quantificazione dell'efficienza invasione in diversi tipi RBC in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Riconosciamo il finanziamento il sostegno del Consiglio Nazionale Salute e Ricerca Medica (concedere APP605524, 490.037 e 1.047.082), la Australian Research Council (concedere DP12010061), la strategia di National Infrastructure Research Collaborative d'Australia e il fondo di investimento Education del Dipartimento di Innovazione, Industria , Scienza e la ricerca. PML è un destinatario di un premio post-laurea australiano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>In Vivo</em> Valutazione del roditore <em>Plasmodium</em> parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter