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Immunology and Infection

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

적혈구 내에서 말라리아 기생충 침입하여 및 복제합니다. merozoite 침공과 기생충의 정확한 평가는 말라리아 감염의 과정을 평가에 따라서 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 말라리아의 마우스 모델에서 이러한 매개 변수의 측정을위한 기반 프로토콜 유동 세포 계측법을 설명합니다.

Protocol

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모든 절차는 맥쿼리 대학의 정책에 따라 수행과 국민 건강과 의학 연구위원회 (NHMRC) 연습 호주 코드를 본했다. 이 연구는 없음 ARA 2012/017 승인하지 맥쿼리 대학의 동물 윤리위원회에서 얻은 계약 윤리에서 수행되었다. 달리 언급하지 않는 한 모든 실험은 SJL / J 마우스에 대해 수행 하였다.

1. 마우스 및 실험 말라리아 감염

  1. 12시 12분 시간의 명암주기 제어 온도 (21 ° C에서) 주택의 마우스.
  2. 냉동 보관 P.의 나누어지는 해동 5 % 기생 적혈구 (pRBCs) 및 C57BL / 6 기증자 마우스의 복강 공동으로 200 μl를 주입와 chabaudi 다미의 DS.
  3. 이 프로토콜의 4 - 3 항에 명시된 유동 세포 계측법 사용하여 2 일 - 매 1 기증자 마우스 기생충을 모니터링합니다. 기증자가 5에 도달하면 - 15 %의 기생충을 다음과 같이 심장 구멍으로 혈액을 수집 :
    1. 대기음 헤파린 용액 (마우스 링거액 300 U가 / ㎖ 헤파린 (MTR) (154 mM의 염화나트륨, 5.6 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2.2 mM의 CaCl2를, 20 mM의 HEPES 100 ㎕, 10 mM의 글루코오스, 30 U / ㎖ 헤파린, pH가 7.4, 0.22 μm의 필터는 26 G 바늘 1 ML의 주사기로)) 멸균.
    2. 페달 탈퇴 응답 및 각막 반사 부재에 의해 마취 원하는 깊이를 확인하는, 5 % 이소 플루오 란으로 흡입에 의한 마우스를 마취.
    3. 갈비뼈를 통해, 단지 팔꿈치 아래에 옆으로 마우스와 수직으로 삽입 바늘을 놓고 마음에. 천천히 주사기의 플런저를 잡아 당겨 0.5까지 바늘을 회전 - 혈액 1ml를 얻을 수있다.
    4. 마취하에 자궁 전위에 의해 인도적인 안락사를 수행합니다.
  4. 희생 할 때 기증자가 10 % 기생충에 있다면, 혈액이 9 × 10 (5)를 포함 즉, 9 × 10 (6) RBC / μL (의 혈액 검사를 가정 기증자 혈액의 볼륨 당 pRBCs을 계산pRBC / μL). 크렙스에 기생 혈액 희석은 (25 mM의 NaHCO3을, 1.2mm의의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의의 MgCl 2, 250 mM의 CaCl2를, 0.2 % 글루코스, pH가 7.2, 멸균 0.22 μM 필터 126 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을) 완충 염수 농도는 200 μL 당 1 × 4 pRBCs하고 RBC 라벨 및 수혈 실험에 필요한 마우스의 복강 공동으로 200 μl를 주입 있도록.
  5. 이 프로토콜의 4 - 3 항에 기술 된 바와 같이 유동 세포 계측법 사용하여 2 일 - 매 1 기생충을 모니터링합니다.

적혈구 수혈 2. 라벨링

  1. 1.3 단계에 설명 된대로 심장 천자에 의해 마우스의 헤파린 혈액을 수집하고 얼음에 배치합니다. 항상 4 ° C에서 혈액을 보관하십시오. 마우스 당 약 200 ㎕의 혈액을 수집하는 주입한다. 필요한 경우, 두 개의 샘플로 혈액을 분할하고 원하는대로 하나의 샘플을 취급합니다.
    주 : 처리 SAMP 이러한 방식으로, 침입르가 대조군에 비해 수 미처리 샘플 (회로도도 1 참조).
  2. 각각의 형광 RBC 라벨의 2 배 솔루션을 준비합니다.
    1. 농도가 20 ㎍ / ㎖의 MTR되도록 아토에서 633-N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS-아토 633)의 2 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 희석.
    2. 농도가 250 ㎍ / ml 인 것을되도록 MTR 비오틴 N 히드 록시 (비오틴 NHS)의 25 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 희석.
  3. 두 튜브에 혈액 시료를 분할 한 관 및 다른 튜브 배 비오틴 NHS 동일 부피의 633 배까지 아토-NHS 용액 동량을 추가한다. 즉시 섞는다. 일정 느린 혼합 1 시간 동안 4 ° C에서 혈액을 품어, 또는 대안 적으로, 매 10 샘플을 혼합 - 15 분.
  4. 다음 MTRC (MTR + 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 멸균 필터 0.22 μM)로 표지 된 혈액 3 회 반복한다 :
    1. 5 분 750 XG에 MTRC의 최소 2 볼륨, 원심 분리기를 추가 상층 액을 제거하고 resuspenMTRC의 2 개 이상의 볼륨에 펠렛을 거라고. 2 번 이상 반복합니다.
    2. 5 분 750 XG에 최종 세척, 원심 분리 후 다른 조합 펠렛 혈액을 결합 (즉, 치료 아토 633 / 처리 비오틴, 치료 비오틴 / 아토 (633) 처리). 주입 마우스에 200 μL의 볼륨을 만들기 위해 MTR을 추가합니다.
  5. 다음과 같이 혈관 내 설치류 말라리아에 감염된 마우스 또는 감염되지 않은 컨트롤에 표시된 혈액을 주입한다 :
    1. 기생충 schizogony의 피크에서 15 %의 기생충 - 2에서 수혈을 수행합니다.
      참고 :이 어둠 사이클을 중간 쯤에 발생합니다 (즉, 12 사이 - 후진 등 사이클 오후 2 - 보통의 빛 사이클 오전 2, 12).
    2. 5-10 분 동안 가열 램프를 사용하여 따뜻한 생쥐 혈액 흐름을 증가 시키지만 생쥐 과열하지 않도록주의를 기울일. 금지 장치에 마우스를 놓고 혈관 내 200 μL라고 표시된 혈액을 주입 (약 1 - 2 × 10 9 RB꼬리 정맥을 통해 CS).
  6. 제 3 항에 기재된 바와 같이 주입 후 상이한 시점에서 혈액 샘플을 수집.
    참고 : 침공 요금은받는 사람 마우스의 기생충에 따라, 주사 후보다 10 분을 정량화 할 수있다.

유동 세포 계측법에 대한 혈액 샘플 및 준비 3. 컬렉션

  1. 다음 실험의 당일에, 염색 용액 샘플 당 플러스 여분의 50 μl를 준비한다 :
    1. 디메틸 설폭 사이드에서 -20 ° C (DMSO)에 저장된 6 mM의 JC-1 분취 제상.
    2. 37 ° C에 따뜻한 50 샘플 당 MTRC의 μL, 플러스 추가.
    3. 최종 농도가 12 μM이되도록 지속적으로 미리 예열 MTRC를 텍싱 동안, JC-1을 추가합니다. 이는 JC-1 응집체의 형성을 감소시키기 위해 수행된다; 골재 형성 경우,이 염색을 차단하므로하지 원심 분리 관을한다.
      참고 : 집계 소량의 결과에 영향을 미치지 않습니다.
    4. 안티 추가CD45 APC eFluor 780 및 항 CD71를 PerCP eFluor 710 최종 농도 1 ㎍ / ml 인 것을되도록. 표지 된 RBC 실험을 수행하면 최종 농도가 1 ㎍ / ㎖의 수 있도록, 스트렙 타비 딘 PE-Cy7을 추가합니다.
  2. 꼬리 내 혈관의 꼬리 또는 열상의 선단의 절단에 의해 꼬리 출혈을 수행한다. 작은 무게 보트 또는 유리 슬라이드에 꼬리 방울의 피를 놓습니다. 혈액 수집 후, 출혈이 중지되었는지 확인합니다. 염색 액의 50 μL에 꼬리 혈액의 피펫 3 μL는 37 ° C로 예열하고 20 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품어.
  3. (355 nm의 레이저를 사용하는 경우)를 증류수에서 -20 ° C에 보관 4mM의 훽스트 33342 또는 (405 nm의 레이저를 사용하는 경우)를 증류수에서 -20 ° C에 보관 2 mM의 훽스트 34580의 분취 제상. 각각 MTRC의 훽스트 (Hoechst)의 4 μM 또는 2 μM 용액, 샘플 당 500 μl를 준비, 플러스 추가.
  4. 4 μM 훽스트 (Hoechst)의 500 μl를 추가33342 또는 샘플에 2 μM의 Hoechst 34580 및 실온에서 20 분 동안 배양한다.
  5. 4 ° C에서 3 분 750 XG, 폐기 뜨는, 원심 분리기 세포는 700 μL MTRC를 추가하고 유동 세포 계측법에 의해 분석한다.

4. 유동 세포 계측법

  1. 355/488/633 nm의 레이저 또는 405/488/633 nm의 레이저 장비를 사용하여 샘​​플을 분석 할 수 있습니다.
  2. 분석 직전 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 샘플. 샘플 및 재사용을 사이에 증류수로 셀 스트레이너를 씻어.
  3. (- 샘플 당 10,000,000 총 이벤트 일반적으로 1,000,000) 가장 작은 인구가 최소 500 이벤트를 포함하도록 충분한 이벤트를 기록합니다.
  4. 355 nm의 레이저를 사용 훽스트 33342 익사이트 50분의 460 및 필터를 통해 이벤트를 검출한다. 405 nm의 레이저를 사용 훽스트 34580 익사이트 50분의 460 및 필터를 통해 이벤트를 검출한다. 여기 JC-1, 항 CD71를 PerCP eFluor 710 스트렙 타비 딘 PE-Cy7는 488 nm의 레이저를 사용하여 40분의 530를 통해 이벤트를 탐지, 40분의 692, 및 750LP는 각각의 필터LY. 633 nm의 레이저를 이용하여 아토 (633) 및 항 CD45 APC eFluor 780 익사이트 각각 30분의 670 또는 750LP 필터를 통해 이벤트를 감지합니다.
  5. 다음과 같이 분석 소프트웨어 세포 계측법 적절한 흐름을 사용하여 분석 및 보정을 수행합니다
    1. 전체 셀을 선택하고 FSC / SSC 특성 (그림 2A)를 기반으로 소음, 먼지, 혈소판을 제외 할 수 있습니다. 어느 트리거 펄스 폭 (도 2b) 또는 높이의 비율 (도 2C)로 FSC 피크 면적을 사용하여 단일 세포를 기반으로 선택한다.
    2. 성숙한 적혈구를 선택하고를 PerCP eFluor (710)와 APC eFluor 780 채널 (그림 2D)에서 음의 형광을 기반으로 적혈구 전구 세포와 백혈구를 제외합니다.
    3. 표지 된 RBC 실험을 수행하는 경우, PE-Cy7 및 아토 633 형광을 기반으로 표시된 적혈구의 각각의 인구를 선택하고이 별도로 (그림 3A)를 분석 할 수 있습니다.
    4. (두 JC-1과 훽스트 (Hoechst)에 대한 긍정적 인 형광 기반으로 pRBCs를 선택

5. 계산 및 통계

  1. 적혈구의 전체 숫자로 pRBCs의 수를 분할함으로써 기생충을 계산 (즉, 게이트 G4의 이벤트로 나눈 게이트 Q2의 이벤트의 수). 두 표지 개체군 침입 검정 기생충을 수행 할 때 (즉, 집단에서 표지 된 RBC의 숫자로 표시된 pRBCs의 개수를 나눔으로써 계산 될 수있다, 즉, 게이트들 L1 및 Q2 모두에있는 이벤트의 수, 이벤트로 나눈 게이트 L1에서).
    참고 : 레이블이 기생충은 크게 내인성 기생충 및 순환 merozoites의 수 등의 요인에 따라 달라집니다. 이 때문에, 각 개별 마우스에 표시된 제어 인구의 기생충에 의해 분할 처리 표지 인구 기생충로서 계산된다 기생충 율을보고하는 것이 도움이된다. 가능한 염료 효과를 해결하려면, 보고서 결과두 염료 조합에서 평균 기생충 비율이야.
  2. 가상의 수단으로 1 일 표본 t의 -test를 사용 비율의 통계적 유의성을 확인합니다.

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Representative Results

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기생충의 측정.

기생충의 측정을 위해, 혈액 세포를 먼저 선택되어야하고, 소음, 파편 및 혈소판 FSC / SSC 속성 (도 2A)에 기초하여, 배제. 사용 된 세포 계측기에 따라, 단일 세포를 면적비 (도 2c)에 대한 하나의 트리거 펄스 폭 (도 2B), 또는 FSC 피크 높이에 기초하여 선택되어야한다. 이벤트가 백혈구로 구성되어야 남은, APC eFluor 780에 대한 긍정적 인 얼룩진를 PerCP eFluor (710), 이러한 얼룩 (그림 2D) 모두에 대한 부정적인 성숙한 적혈구, 양성 염색 (망상 적혈구 포함) 적혈구 전구 세포. JC-1 형광 훽스트 33342 (그림 2E, F) 또는 훽스트 34580 (그림 2G, H) 형광 역모를 꾸몄다 때 성숙한 적혈구 인구를 선택한 후, 이벤트는 네 개의 집단으로 분리해야합니다. 이중 긍정적 인 인구는 기생 적혈구를 나타내는 R 동안emaining 인구 중 감염되지 않은 적혈구 (이중 부정)이며, HJ-적혈구 (훽스트 긍정적, 부정적 JC-1), 또는 알 수없는 세포 (JC-1 양성, 훽스트 음). 특히, JC-1 형광은 세포의 미토콘드리아 막 전위에 따라, 590 nm의 넓은 발광 피크를 529 nm에서 최대로 이동할 수있다. 에 관계없이 이러한 변화의 JC-1은 분석을 위해이 채널이 가장 적합하다 40분의 530 nm의 채널에서 강한 형광을합니다. 그러나, 몇몇 경우에 그것은 세포의 미토콘드리아 막 전위의 표시를 제공 할 수있다 42분의 585 nm의 채널에 추기 형광에 가치가있을 수있다. 감염되지 않은 샘플 이벤트 미만 0.007 %가 듀얼 긍정적 (그림 2E, G)를해야한다. 이 결과는 흐름 cytometer의 청결에 따라 달라집니다 상당히, 분석하기 전에 광범위한 청소 결과를 향상시킬 수 있습니다 다를 수 있습니다. ACC 용 JC-1 염료의 첨가는 중요하게, 성숙한 적혈구 0.9 % - HJ-적혈구 0.3 차지낮은 기생충의 요산 측정.

merozoite 침공의 평가.

감염된 마우스로 표지 된 RBC를 주입 후 두 집단으로 표시된 상대 침입 속도가 결정될 수있다. 혈액 샘플을 취하여 스트렙 Cy7 PE가 추가 기생충 측정 기술 한 바와 같이 제조한다. 샘플이 촬영되는 시간은 실험 조건과 분석의 원하는 결과에 의존한다. 이 정확성을 높이기 위해 여러 시점을 수집 도움이 될 수 있지만 일반적으로, 이전 시점에 가장, 침략 표현형을 반영합니다. 데이터의 유세포 분석을 위해, 성숙한 적혈구는도 2에서와 같이 선택되어야한다. 이러한 균체로부터, 633 아토 및 비오틴 표지 된 RBC를 각각 30분의 670 750LP와 형광 채널 (도 3A)에 기초하여 식별 될 수있다. (아토 (633), 비오틴, 및 레이블이없는) 여기에 세 RBC 개체군에서개별적으로 분석해야한다. 이들 개체군의 기생충 각각 훽스트 및 JC-1 (도 3B-D)와 함께 염색에 기초하여 결정될 수있다.

그림 1
생체 내 기생충 침입 분석법 도식도.이 분석은 사용자의 질문에 따라 생물학적 처리 적혈구 상대 내습 요금을 결정하는 데 사용될 수있는 방법의 예를 나타낸다. 감염되지 않은 쥐에서 수집 된 혈액은 두 개의 튜브로 나누어진다. 하나의 튜브는 다른 미처리 샘플 (A)에 남아있는 동안 원하는대로 처리된다. 튜브는 다시 NHS - 비오틴으로 표지 하나 NHS-아토 633 (B)와 서로 구분된다. 샘플은 두 개의 조합으로 결합; 비오틴은 아토와 633 표시된 치료 적혈구를 처리 적혈구를 표시하고 아토 (633)는 바이오와 적혈구를 처리라고 표시된주석 표시 치료 적혈구 (C). 15 %의 기생충 (D) -이 두 조합을 2 schizogony 동안 감염된 마우스의 두 제비로 개별적으로 주입된다. 6받는 마우스의 총 필요한 경우 더 이하인 사용될 수 있지만, 결과의 통계적 유의성을 얻기 위해 권장된다. Lelliott 등. (14)에서 적응, 원래 바이오 메드 센트럴에 의해 출판.

그림 2
그림 흐름에 의해 기생충 2. 측정은 세포 계측법. 파편, 소음, 혈소판은 FSC / SSC 특성 (A)에 따라 분석에서 제거됩니다. 단일 세포를 면적비 (C) 중 하나에 트리거 펄스 폭 (B), 또는 FSC 피크에 기초하여 잔여 세포로부터 선택된다. 세포 유형이어서, APC의 CD45 양성으로 염색 eFluor에 기초하여 구별 될 수있다780 (백혈구), CD71를 PerCP eFluor 710 (적혈구 전구 세포), 또는 음의 염색 (적혈구 성숙) (D). 훽스트 (Hoechst)와 JC-1 양 (기생 적혈구), 훽스트 긍정적이고 JC-1 음성 (하웰 졸리 기관을 포함하는 적혈구), JC-1 양성 및 훽스트 마이너스 (알 수없는 세포), 또는 이중 부정 : 성숙한 적혈구를 선택한 후, 세포 중 하나입니다 (감염되지 않은 적혈구). 감염되지 않은 및 P. 훽스트 33342 (E, F), 또는 훽스트 34580 (G, H)로 염색 감염된 샘플을 chabaudi, 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
생체 내에서 두 개의 레이블 RBC 인구에 merozoite 침공 3. 평가 그림. 플롯, 성숙한 적혈구의 문이 있습니다도 2에서와 같이. 표지 된 RBC 두 집단들은 라벨 (A)에 기초하여 선택 될 수있다. 아토 (633) 표지 세포가 30분의 670 채널 (L1)에 형광, 비오틴 표지 된 세포는 스트렙 타비 딘에 결합 PE-Cy7 채널 (L3)에 형광 및 레이블이없는 세포는 이러한 얼룩 (L4)에 대한 부정이다. 기생 적혈구가 훽스트 (Hoechst)와 JC-1 긍정적 인 염색 (Q2) (BD)를 기반으로 식별 할 수있는 이러한 인구의 각각에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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우리는 생체 시료의 양 및 기생충 merozoite 침윤 측정하는 방법을 설명 하였다. 기생충 측정의 관점에서,이 방법은 이에 위양성 이벤트의 수를 감소 pRBCs 구별 할 수있는 HJ-적혈구 10-13에서 이전의 방법보다 이점을 제공한다. HJ-적혈구는 인간의 보통 드문 반면, 일부 연구는 설치류 기생충의 정확한 측정을 위해 중요한 이러한 세포와 pRBCs의 구분을 마우스 15, 16의 높은 수준을보고합니다. 그것이 바로 조건이 낮은 0.0005 %까지 감소시킬 수 있지만,이 방법을 기생충에 대한 검출 한계를 사용하면, 약 0.007 내지 14이다. 특히, 사용이 제한 흐름 cytometer 적절한 시간 내에 다수의 이벤트를 획득 할 수있는 능력의 청결도에 의해 결정된다. 이 기술의 사용과 관련된 일반적인 문제는 불충분하다 염색 재치시간 JC-1. JC-1 형광은 기생충의 미토콘드리아 막 전위에 의존하고, 최적의 기생충 오염을 얻기 위해 건강해야. 기생충 또는 고정의 장기간 보관 따라서 염색하기 전에 피해야한다.

약물 개입 된 적이있는 기생충을 분석 할 때이 또한 JC-1 염색의 정도에 영향을 미칠 수 있으므로주의도 기울여야한다. 이러한 경우는 JC-1 염료가 추가 기생충에 비해 단독 훽스트 형광에 기초하여 기생충을 분석하는 것이 도움이 될 수있다. 실제로, 이것은 기생충 수의 측정뿐만 아니라, 기생의 전반적인 건강 표시를 제공 할 수있다. 마지막으로, JC-1 염료 J 집합체를 형성함으로써 590 nm에서 피크를 529 nm에서 형광 피크로부터 시프트된다. 이들 응집체의 형성은 결과적으로 전지의 미토콘드리아 막 전위에 의존 염료 농도에 의존한다. 미토콘드리아 막 potenti의 손실알은 세포가 세포 사멸 있습니다 나타낼 수 529 nm의 대한 형광의 변화를 야기한다. JC-1 염색 우리의 경험 pRBCs에서 항상 40분의 530 nm의 채널과 42분의 585 nm의 채널 모두에서 거의 동일한 강도이었다 유사한 형광 패턴을 보였다. 그러나, 일부 연구에서, 이러한 약물 개입을 이용하는 것과 같이, 그것은 40분의 530 nm의 채널 및 미토콘드리아 막전위의 손실 중 어느 적응증 42분의 585 nm의 채널 간의 형광 비의 변화를 모니터하는 것이 바람직합니다. 그것은 JC-1 분해에 특히 민감하다와 동결 / 해동 사이클은 피해야한다하면서 갓 한 바와 같이 냉동 분취로부터 제조되어야한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 염색 후, JC-1 형광은 적어도 몇 시간 동안 형광에 거의 또는 전혀 감소, 상대적으로 안정적이다.

생체 침윤 분석에서, 두 개의 가장 중요한 요소는 RBC 라벨링 홍보 일관성을ocess 및 표시 혈액의 주입시. RBC 라벨링, 염료의 최소량면 라벨 (7)을 사용할 때 가능성으로 제기 된 RBC를 침범하는 기생충의 능력을 가진 임의의 간섭을 방지하기 위해 사용되어야한다. 여기에서 설명한 라벨링 조건 하에서 내습 그러나 세심한주의가 일관된 라벨 농도를 유지 고려되어야한다 (14)이 억제되지 않고, 염료 RBC 라벨 의해 침윤 억제로 인한 부정확성을 방지하기 위해, 전환되어야한다. 기생충 내습 동기화 사이클을 겪을 때, 표지화 된 세포가 기생충주기에서 적절한시기에 분사하는 것이 중요하다. 이는 침입 이벤트의 수, 따라서 분석의 정확성을 최대화하기 위해 수행되어야한다. 우리의 경험에서 침략의 피크는이 분석을위한 후진 등 사이클 공간이 유리하고, 어둠의 사이클을 중간 쯤에 발생합니다.

t라벨 침윤 분석 RBC는 생체 내에서 여러 가지로 침공 merozoite 효율을 결정하는 정확한 방법을 제공 우와. 따라서, 이러한 접근법은 처리 된, 즉 적혈구, 트립신 처리 및 제어 적혈구 사이의 비교를 허용한다. 대안 적으로, 유전자 변형 마우스의 적혈구는 비교 될 수 대조군 마우스, 또는 다른 생리 학적 파라미터 또는 상이한 연령의 적혈구와 비교 될 수있다. 유사한 분석은 시험 관내 9 침윤 측정 설명되었지만, 분석은 여기 잠재적 기생충 침입 메커니즘 17-19을 변경할 수 면역계의 영향을 포함한 생체 내에서만 본 효과를 설명하는 가능성을 제공한다. 표시된 집단 내의 pRBCs가 장기간에 걸쳐 모니터링된다 마지막으로, 만약이 분석은, 예컨대 면역 pRBCs의 간극, 및 기생충으로 성장 병리에 대한 통찰력을 제공 할 가능성이있다.

OveraLL, 생체 시료에서 기생충의 정확한 측정에 대한 상세한 프로토콜은 그 HJ-적혈구 이전에 분석보다 이점을 갖는 기술되어 pRBCs는 구별 될 수있다. 또한, 분석은 생체 내에서 다른 유형으로 RBC 내습 효율 정량 설명한다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 (APP605524, 490,037 및 1,047,082을 부여) 국립 보건 의학 연구위원회 (Medical Research Council)의 지원 자금을 인정 호주 연구 협의회 (DP12010061을 부여), 혁신의 부서에서 호주 국립 공동 연구 인프라 전략 및 교육 투자 기금, 산업 과학 연구. PML은 호주 대학원 상을받는 사람입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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유동 세포 계측법에 의해 쥐 <em>말라리아</em> 기생충의 <em>생체 내</em> 평가와 Merozoite <em>침공</em>
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Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

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