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Immunology and Infection

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

Protocol

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Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las políticas de la Universidad de Macquarie y conformados a la Salud y medicina Consejo Superior de Investigaciones Científicas (NHMRC) Código australiano de la práctica. El trabajo se realizó en las Ética acuerdo No ARA 2012/017 aprobado y obtuvo del Comité de Ética Animal de la Universidad de Macquarie. Todos los experimentos se realizaron en ratones SJL / J menos que se indique lo contrario.

1. Los ratones y Experimental Malaria infección

  1. Los ratones bajo temperatura controlada (21 ° C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
  2. Descongelar una alícuota de criopreservados P. DS adami chabaudi con un 5% en los glóbulos rojos parasitados (pRBCs) y inyectar 200 l en la cavidad intraperitoneal de C57BL / 6 donantes ratón.
  3. Monitorear donante parasitemia ratón cada 1 - 2 días por citometría de flujo como se describe en la Sección 3 - 4 de este protocolo. Una vez que los donantes alcanza 5-15% de parasitemia, recoger la sangre por punción cardiaca de la siguiente manera:
    1. Aspirar 100 l de solución de heparina (300 U / ml de heparina en solución Ringer ratón (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl 2, HEPES 20 mM, glucosa 10 mM, 30 U / ml heparina, pH 7,4, 0,22 mM de filtro esterilizado)) en una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G.
    2. Anestesiar el ratón por inhalación con 5% de isofluorano, confirmando la profundidad deseada de la anestesia por la ausencia de respuesta de retirada de pedal y los reflejos corneales.
    3. Coloque el ratón sobre su lado y la aguja de inserción perpendicularmente por debajo del codo, a través de las costillas, y en el corazón. Saque émbolo de la jeringa lentamente y girar la aguja hasta 0.5 - se obtiene 1 ml de sangre.
    4. Realizar la eutanasia por dislocación cervical bajo anestesia.
  4. Calcular los pRBCs por volumen de sangre del donante asumiendo un recuento de sangre de 9 x 10 6 RBC / l (es decir, si el donante estaba en 10% de parasitemia cuando sacrificado, la sangre contiene 9 x 10 5GRP / l). Diluir la sangre parasitada en solución salina Krebs (NaCl 126 mM, KCl 2,5 mM, 25 mM de NaHCO3, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl 2, 0,2% de glucosa, pH 7,2, 0,22 mM de filtro esterilizado) tamponada de manera que la concentración es de 1 x 10 4 pRBCs por 200 l 200 l e inyectar en la cavidad intraperitoneal de ratones requeridos para el etiquetado RBC y el experimento transfusión.
  5. Monitorear parasitemia cada 1 - 2 días por citometría de flujo como se describe en las secciones 3-4 de este protocolo.

2. El etiquetado de los glóbulos rojos y transfusión

  1. Recoger la sangre heparinizada a partir de ratones por punción cardiaca como se describe en el paso 1.3, y colocar en hielo. Mantener la sangre a 4 ° C en todo momento. Recoger aproximadamente 200 l de sangre por ratón a inyectar. Si es necesario, dividir la sangre en dos muestras y tratar una muestra lo deseas.
    NOTA: En este modo, la invasión de la samp tratadaLe puede ser comparado con un control, la muestra sin tratar (véase la Figura 1 para esquemática).
  2. Preparar una solución 2x ​​de cada etiqueta RBC fluorescente.
    1. Se diluye una solución madre de 2 mg / ml de Atto 633-N-hidroxisuccinimida (Atto 633-NHS) en MTR modo que la concentración es 20 mg / ml.
    2. Se diluye una solución madre de 25 mg / ml de biotina-N-hidroxisuccinimida (biotina-NHS) en MTR modo que la concentración es 250 mg / ml.
  3. Dividir las muestras de sangre en dos tubos y añadir un volumen igual de 2X solución Atto 633-NHS a un tubo, y un volumen igual de 2x la biotina-NHS al otro tubo. Mezclar inmediatamente. Incubar la sangre a 4 ° C durante 1 hora con mezclado lento constante, o alternativamente, la mezcla de la muestra cada 10 - 15 minutos a.
  4. Lavar la etiqueta de sangre 3 veces con MTRC (MTR + 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,22 mM de filtro esterilizado) como sigue:
    1. Añadir al menos 2 volúmenes de MTRC, centrífuga a 750 g durante 5 min, separar el sobrenadante, y resuspend el sedimento en al menos 2 volúmenes de MTRC. Repite 2 veces más.
    2. Después del lavado final, se centrifuga a 750 xg durante 5 min y combinar la sangre se sedimentaron en diferentes combinaciones (es decir, sin tratar Atto 633 / biotina tratado, sin tratamiento de biotina / tratada Atto 633). Añadir MTR para hacer hasta un volumen de 200 l por ratón a inyectar.
  5. Inyectar la sangre marcada por vía intravascular en ratones infectados de malaria de roedores o controles no infectados como sigue:
    1. Realizar transfusión en 2-15% de parasitemia en el pico de la esquizogonia parásito.
      NOTA: esto ocurre aproximadamente a medio camino a través de la oscuridad ciclo (es decir, entre 12 a 2 de la mañana un ciclo de luz normal, o 12-2 pm en un ciclo de luz de marcha atrás).
    2. Ratones calientes utilizando una lámpara de calor durante 5-10 minutos para aumentar el flujo sanguíneo, pero tomar precauciones de no sobrecalentar los ratones. Coloca los ratones en un dispositivo de contención y intravascular inyectar 200 l de sangre marcada (aproximadamente 1 - 2 x 10 9 RBCs) a través de la vena de la cola.
  6. Recoger muestras de sangre en diferentes momentos después de la inyección, como se describe en la Sección 3.
    NOTA: las tasas de invasión se pueden cuantificar menos de 10 min después de la inyección, dependiendo de parasitemia del ratón receptor.

3. Recolección de muestras de sangre y preparación para Citometría de Flujo

  1. Preparar 50 l de solución de tinción por muestra, y un poco más, en el día del experimento como sigue:
    1. Descongelar una alícuota de 6 mM JC-1 se almacena a -20 ° C en sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    2. Cálido 50 l de MTRC por muestra, y un poco más, a 37 ° C.
    3. Mientras vórtice continuamente la MTRC pre-calentado, añadir JC-1, de modo que la concentración final es 12 mM. Esto se hace para reducir la formación de JC-1 agregados; si los agregados se forman, hacer tubo no centrífuga ya que esto evitará manchas.
      NOTA: Una pequeña cantidad de agregación no afectará a los resultados.
    4. Añadir anti-CD45 APC eFluor 780 y anti-CD71 PerCP eFluor 710 de manera que la concentración final es 1 mg / ml. Si se realiza el experimento RBC marcado, añadir estreptavidina PE-Cy7 modo que la concentración final es 1 mg / ml.
  2. Realizar el sangrado de la cola por la amputación de la extremidad de la cola o laceración del vaso sanguíneo dentro de la cola. Coloque una gota de sangre de la cola a un pequeño sopesar barco o portaobjetos. Después de la extracción de sangre, asegúrese de que el sangrado se ha detenido. Pipetear 3 l de sangre de la cola en 50 l de solución de tinción pre-calentado a 37 ° C e incubar las muestras a 37 ° C durante 20 min.
  3. Descongelar una alícuota de 4 mM Hoechst 33342 se almacena a -20 ° C en agua destilada (si se utiliza un láser de 355 nm) o 2 mM Hoechst 34580 se almacena a -20 ° C en agua destilada (si se utiliza un láser de 405 nm). Preparar 500 l por muestra, y un poco más, de una solución 4 M o 2 M de Hoechst en MTRC, respectivamente.
  4. Añadir 500 l de 4 micras Hoechst33342 o 2 mM Hoechst 34580 a las muestras y se incuba a temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Centrifugar las células a 750 xg durante 3 min a 4 ° C, el sobrenadante de descarte, añadir 700 l MTRC y analizan por citometría de flujo.

4. Citometría de Flujo

  1. Analizar las muestras usando un láser 355/488/633 nm o 405/488/633 instrumento láser nm.
  2. Filtrar las muestras a través de un filtro de células de 35 mM inmediatamente antes del análisis. Enjuague células colador con agua destilada entre muestras y reutilización.
  3. Registre suficientes eventos para que la población más pequeña contiene al menos 500 eventos (generalmente 1000000 - 10000000 eventos totales por muestra).
  4. Excite Hoechst 33342 utilizando un láser de 355 nm y detectar eventos a través de un filtro de 460/50. Excite Hoechst 34580 utilizando un láser de 405 nm y detectar eventos a través de un filtro de 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 y estreptavidina PE-Cy7 usando un láser de 488 nm y detectar eventos a través de un 530/40, 692/40, y 750LP filtro respectivaly. Excite Atto 633 y anti-CD45 de APC eFluor 780 usando un láser de 633 nm y detectar eventos a través de un filtro de 670/30 o 750LP respectivamente.
  5. Realizar análisis y compensación mediante citometría de flujo apropiado de software de análisis de la siguiente manera:
    1. Seleccione células completas y excluir el ruido, los residuos y las plaquetas en base a FSC / SSC propiedades (Figura 2A). Seleccionar las células individuales sobre la base de cualquiera de ancho de pulso de disparo (Figura 2B) o utilizando el área del pico FSC a altura (Figura 2C).
    2. Seleccione glóbulos rojos maduros, y excluir a los progenitores y los leucocitos RBC, basados ​​en fluorescencia negativa en los PerCP eFluor 710 y APC eFluor 780 canales (Figura 2D).
    3. Si se realiza el experimento RBC marcado, seleccionar cada población de glóbulos rojos marcados basados ​​en PE-Cy7 y Atto 633 de fluorescencia y análisis de estos por separado (Figura 3A).
    4. Seleccione pRBCs basado en fluorescencia positiva tanto para JC-1 y Hoechst (

5. Cálculos y Estadísticas

  1. Calcular parasitemia dividiendo el número de pRBCs por el número total de glóbulos rojos (es decir, número de eventos en Q2 puerta dividido por el número de eventos en G4 puerta). Al llevar a cabo la parasitemia ensayo de invasión de las dos poblaciones marcadas se puede calcular dividiendo el número de pRBCs marcadas por el número de glóbulos rojos marcados en esa población (es decir, el número de eventos que se encuentran en ambas puertas L1 y Q2, dividido por el número de eventos en puerta L1).
    NOTA: Etiquetado parasitemia varía considerablemente dependiendo de factores como la parasitemia endógeno y número de merozoitos circulantes. Por esta razón, es útil para informar de la relación de parasitemia, la cual se calcula como la parasitemia de la población marcada tratados dividido por la parasitemia de la población control con la etiqueta en cada ratón individual. Para corregir los posibles efectos de tinte, el informe de los resultados de uns una relación media de la parasitemia a través de las dos combinaciones de colorantes.
  2. Determinar la significación estadística de los coeficientes utilizando la muestra de t-test con 1 como la media hipotética.

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Representative Results

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Medición de la parasitemia.

Para la medición de la parasitemia, células de la sangre primero deben ser seleccionados, y el ruido, la suciedad y las plaquetas excluidos, basado en las propiedades del FSC / SSC (Figura 2A). Dependiendo del citómetro utilizado, las células individuales entonces deben seleccionarse en base a cada ancho de pulso de disparo (Figura 2B), o la altura del pico FSC relación de área (Figura 2C). Resto de eventos deben consistir en leucocitos, manchadas positivo para APC eFluor 780, progenitores de glóbulos rojos (incluyendo reticulocitos), manchados positivo para PerCP eFluor 710, y los glóbulos rojos maduros, negativas para estos dos manchas (Figura 2D). Después de seleccionar la población RBC maduros, eventos deben separarse en cuatro poblaciones cuando JC-1 de fluorescencia se representa frente a Hoechst 33342 (Figura 2E, F) o Hoechst 34580 (Figura 2G, H) de fluorescencia. La población doble positiva representa glóbulos rojos parasitados, mientras que el rpoblaciones emaining son o glóbulos rojos no infectados (doble negativo), HJ-hematíes (Hoechst positivo, JC-1 negativo), o células desconocidas (JC-1 positivo, Hoechst negativo). Notablemente, JC-1 fluorescencia puede pasar de un máximo a 529 nm a un amplio pico de emisión a 590 nm, dependiendo del potencial de membrana mitocondrial de la célula. Independientemente de este cambio JC-1 será fluorescente fuerte en el 530/40 nm canal, haciendo de este canal más adecuado para el análisis. Sin embargo, en algunos casos puede ser útil a la fluorescencia, además, registro en la 585/42 nm canal, que puede proporcionar una indicación del potencial de membrana mitocondrial de las células. En las muestras no infectadas menos de 0,007% de los eventos debe ser doble positivo (Figura 2E, G). Este resultado dependerá de la limpieza de la citómetro de flujo y puede variar considerablemente, extensa limpieza antes de análisis puede mejorar los resultados. HJ-glóbulos rojos representan el 0,3-0,9% de los glóbulos rojos maduros, por lo que la adición del colorante JC-1 crítico para la accmedición de urato de baja parasitemia.

Evaluación de la invasión de merozoitos.

Después de la inyección de glóbulos rojos marcados en ratones infectados las tasas de invasión relativos en las dos poblaciones marcadas se pueden determinar. Las muestras de sangre se deben tomar y prepararon como se describe para la medición parasitemia con la adición de estreptavidina PE Cy7. El momento en que se toma la muestra depende de las condiciones experimentales y el resultado deseado del análisis. En general, un punto de tiempo anterior será mejor reflejan un fenotipo invasión, aunque puede ser beneficioso para recoger múltiples puntos de tiempo para aumentar la precisión. Para el análisis de citometría de flujo de datos, los glóbulos rojos maduros deben ser seleccionados como en la Figura 2. A partir de estas células, Atto 633 y los glóbulos rojos marcados con biotina pueden ser identificados basado en la fluorescencia en los canales 670/30 y 750LP, respectivamente (Figura 3A). A partir de aquí las tres poblaciones RBC (Atto 633, biotina, y sin etiqueta)deberían analizarse por separado. En cada una de estas poblaciones parasitemia puede determinarse basándose en la tinción con Hoechst y JC-1 (Figura 3B-D).

Figura 1
Figura 1. Esquema del ensayo de invasión de parásitos in vivo. Un ejemplo de cómo este ensayo se puede utilizar para determinar las tasas de invasión relativos en los glóbulos rojos tratados de acuerdo a la pregunta biológica del usuario se muestra. La sangre obtenida de ratones no infectados se divide en dos tubos. Un tubo se trata como se desee, mientras que la otra muestra se deja sin tratar (A). Los tubos se dividen de nuevo con uno marcado con NHS-biotina y el otro con NHS-Atto 633 (B). Las muestras se combinan entonces en dos combinaciones; Marcado con biotina glóbulos rojos tratados con Atto 633 glóbulos rojos marcados sin tratar y Atto 633 rotulada glóbulos rojos tratados con Bioestaño marcado glóbulos rojos sin tratar (C). Estas dos combinaciones se inyectan por separado en dos lotes de ratones infectados durante la esquizogonia a las 2 - 15% de parasitemia (D). Se recomienda un total de 6 ratones receptores para obtener la significación estadística en el resultado, aunque más o menos pueden usarse si es necesario. Adaptado de Lelliott et al. 14, publicado originalmente por BioMed Central.

Figura 2
Figura 2. Medición de la parasitemia por citometría de flujo. Escombros, el ruido y las plaquetas se extraen del análisis basado en las propiedades de CSS FSC / (A). Las células individuales se seleccionan entonces a partir de las células restantes sobre la base de cualquiera de ancho de pulso de disparo (B), o pico de FSC para relación de área (C). Los tipos de células pueden ser distinguidos basan en la tinción positiva con CD45 APC eFluor780 (leucocitos), CD71 PerCP eFluor 710 (progenitores de glóbulos rojos), o tinción negativa (maduro glóbulos rojos) (D). Después de seleccionar los glóbulos rojos maduros, las células son cualquiera: Hoechst y JC-1 (glóbulos rojos parasitados) positivos, Hoechst, JC-1 negativo positivo y Hoechst negativo (células desconocidos), o doble positivo y JC-1 negativo (glóbulos rojos que contienen cuerpos de Howell Jolly) (RBC no infectados). No infectadas y P. chabaudi muestras infectadas teñidas con Hoechst 33342 (E, F), o Hoechst 34580 (G, H), se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Evaluación de la invasión merozoite en dos poblaciones de glóbulos rojos marcados en vivo. Las parcelas son de glóbulos rojos maduros, Recintocomo en la Figura 2. Las dos poblaciones de RBC marcados pueden ser seleccionados en función de su etiqueta (A). Atto 633 células marcadas fluorescencia en el canal 670/30 (L1), las células marcados con biotina se unen a estreptavidina y fluorescencia en el canal de PE-Cy7 (L3), y las células no marcadas son negativas para estas manchas (L4). En cada una de estas poblaciones glóbulos rojos parasitados pueden ser identificados en base a Hoechst y JC-1 tinción positiva (Q2) (BD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Hemos descrito un método para la medición tanto de parasitemia y merozoite invasión de muestras in vivo. En términos de medición parasitemia, este método ofrece una ventaja sobre los métodos anteriores 10-13 en que HJ-glóbulos rojos pueden distinguirse de pRBCs, reduciendo así el número de eventos positivos falsos. Mientras HJ-glóbulos rojos son generalmente raros en los seres humanos, algunos estudios informan altos niveles en los ratones 15,16 hacer la distinción entre estas células y pRBCs importantes para la medición precisa de la parasitemia de roedores. Usando este método, el límite de detección para parasitemia es de aproximadamente 0,007% 14, aunque es posible reducir este precio tan bajo como 0,0005% bajo las condiciones adecuadas. En particular, este límite es dictada por la limpieza de la citómetro de flujo utilizado y la capacidad de obtener un gran número de eventos en una cantidad de tiempo razonable. El problema más común asociado con el uso de esta técnica es insuficiente ingenio tinciónh JC-1. La fluorescencia de JC-1 depende del potencial de membrana mitocondrial del parásito, y los parásitos debe ser saludable para obtener la tinción óptima. Por lo tanto, el almacenamiento prolongado de parásitos o fijación debe evitarse antes de la tinción.

También se debe tener cuidado al analizar los parásitos que han sido objeto de intervenciones de drogas, ya que esto también puede afectar el grado de tinción con JC-1. En estos casos, puede ser útil para analizar parasitemia basado en fluorescencia Hoechst solo, en comparación con parasitemia con la adición del colorante JC-1. De hecho, esto puede proporcionar una medida de recuento de parásitos, así como una indicación general de la salud parásito. Finalmente, el colorante JC-1 puede cambiar su fluorescencia a partir de un pico a 529 nm a un pico a 590 nm mediante la formación de J-agregados. La formación de estos agregados depende de la concentración de colorante, que a su vez depende del potencial de membrana mitocondrial de la célula. La pérdida de potenti membrana mitocondrialAl provoca un cambio en la fluorescencia a 529 nm, lo que puede indicar células son apoptóticas. En nuestros pRBCs experiencia teñidas con JC-1 siempre exhibido un patrón de fluorescencia similar que era aproximadamente la misma intensidad tanto en el 530/40 nm canal y el 585/42 nm canal. Sin embargo, en algunos estudios, como los que se interviene con fármacos, puede ser útil para monitorear los cambios en la relación entre la fluorescencia 530/40 nm canal y el 585/42 nm canal para cualquier indicación de la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. También es importante señalar que JC-1 es particularmente susceptible a la degradación y debe estar recién preparado a partir de una alícuota congelada como se describe, mientras que los ciclos de congelación / descongelación deben ser evitados. Después de la tinción, JC-1 de fluorescencia es relativamente estable con poca o ninguna reducción en la fluorescencia, por lo menos durante varias horas.

Para el ensayo de invasión in vivo, los dos factores más importantes son la coherencia en el etiquetado pr RBCoceso y el tiempo de inyección de sangre etiquetado. Para el etiquetado de RBC, la cantidad mínima de colorante se debe utilizar para impedir cualquier interferencia con la capacidad del parásito para invadir el RBC, que se ha planteado como una posibilidad cuando se utilizan etiquetas de superficie 7. Bajo las condiciones de etiquetado descritos aquí invasión no se inhibe 14, sin embargo cuidado debe prestarse atención a mantener las concentraciones de etiquetas consistentes, y colorantes se debe cambiar, a fin de evitar cualquier inexactitud debido a la inhibición de la invasión de la etiqueta RBC. Como parásitos se someten a un ciclo de invasión sincronizada, es importante que las células marcadas se inyectan en el momento adecuado en el ciclo de vida de parásitos. Esto se debe hacer con el fin de maximizar el número de eventos de invasión, y por lo tanto la exactitud del ensayo. En nuestra experiencia, el pico de la invasión se produce aproximadamente a medio camino a través del ciclo de oscuridad, por lo que una sala de ciclo de luz reversa ventajoso para este ensayo.

El tWO ensayo de invasión de etiqueta ofrece un método preciso para determinar la eficiencia de la invasión de merozoitos en diferentes tipos de RBC in vivo. Este enfoque, por tanto, permite una comparación entre RBC tratados, es decir, se tripsinizaron, y los hematíes de control. Alternativamente, los glóbulos rojos de ratones modificados genéticamente podrían ser comparados con los de los ratones de control, o los glóbulos rojos de diferentes parámetros fisiológicos o diferente edad podría compararse. Mientras que un ensayo similar se ha descrito para la medición de la invasión in vitro 9, el ensayo aquí proporciona el potencial para tener en cuenta efectos sólo presentes in vivo, incluyendo la influencia del sistema inmune, lo que potencialmente puede alterar los mecanismos de la invasión del parásito 17-19. Finalmente, este ensayo también tiene el potencial de proporcionar conocimientos sobre patologías tales como el aclaramiento inmunitario de pRBCs, y el crecimiento del parásito, si los pRBCs dentro de las poblaciones marcadas se controlan durante un período prolongado.

Sobrell, un protocolo detallado para la medición precisa de la parasitemia en muestras in vivo se ha descrito, que tiene una ventaja sobre los ensayos anteriores en que HJ-RBC se puede distinguir de pRBCs. Además, un ensayo se describe para la cuantificación de la eficiencia de la invasión en diferentes tipos de glóbulos rojos in vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos el apoyo financiero de la Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación (subvención APP605524, 490.037 y 1.047.082), el Consejo Australiano de Investigación (subvención DP12010061), la Estrategia de Infraestructuras de Investigación Cooperativa Nacional de Australia y el fondo de inversión de Educación del Departamento de Innovación, Industria , Ciencia e Investigación. PML es un receptor de un premio de postgrado australiano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>En</em> la Evaluación <em>in vivo de</em> roedores <em>Plasmodium</em> parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo
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Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

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