Summary
Unraveling hur fysiologi och morfologi är kopplade möjliggör en djupare förståelse för mekanistiska fungerande blad. Vi presenterar både ett förfarande för att härleda parametrar stomatal reglering från stomatala konduktans mätningar och korrelationer med traditionella funktionella bladegenskaper.
Abstract
Leaf funktionella egenskaper är viktiga eftersom de återspeglar fysiologiska funktioner, såsom transpiration och kol assimilering. I synnerhet morfologiska blad drag har potential att sammanfatta växter strategier när det gäller vattenanvändningen effektivitet, tillväxtmönster och gödningsmedel. Blad ekonomi spektrum (LES) är en erkänd ram funktionell växtekologi och speglar en gradient av ökande specifik bladyta (SLA), blad kväve, fosfor och katjonhalt, och minskar blad torrsubstanshalt (LDMC) och kol kvävekvoten ( CN). LES beskriver olika strategier som sträcker sig från kortlivade blad med hög foto kapacitet per blad massa för att långlivade blad med låg massa baserade kol assimilering priser. Däremot kan egenskaper som inte ingår i LES ge ytterligare information om artens fysiologi, såsom de som rör stomatal kontroll. Protokoll presenteras för ett brett spektrum av blad funktionella egenskaper, inklusive drag av LES, men också egenskaper som är oberoende av LES. I synnerhet är en ny metod införs som relaterar växternas reglerings beteende stomatal konduktans till ångtryck underskott. De resulterande parametrar stomatal reglering kan sedan jämföras med LES och andra växt funktionella egenskaper. Resultaten visar att funktionella blad drag av LES var också giltiga prediktorer för parametrarna för stomata reglering. Till exempel, koncentration blad kol var positivt relaterad till underskottet ångtryck (VPD) vid brytpunkten och den maximala av konduktans-VPD kurva. Men drag som inte ingår i LES lagt informationen förklara parametrar stomatal kontroll: VPD vid brytpunkten av konduktans-VPD kurvan var lägre för arter med högre stomata täthet och högre stomata index. Sammantaget klyvöppningar och ven drag var mer kraftfulla prediktorer för att förklara stomatal reglering tHan egenskaper används i LES.
Introduction
Att främja funktionella förståelsen av växtblad, har många nya studier försökt att relatera morfologiska, anatomiska och kemisk blad drag till fysiologiska reaktioner, såsom blad stomata konduktans (g S) 1-4. Förutom att bladdrag, stomatal konduktans påverkas starkt av miljöförhållanden, såsom fotosyntetiskt aktiv fotonflödestäthet, lufttemperatur och VPD 5. Olika sätt har föreslagits för att modellera gs - VPD kurvor 6-8 som i huvudsak bygger på linjär regression av gs på VPD 6. I motsats, den modell som presenteras i denna studie regresses de logits av relativ stomatal konduktans (dvs förhållandet mellan g S till maximal stomata ledningsförmåga g SMAX) på VPD och står för icke-linjäritet genom att lägga till VPD som en kvadratisk tillbakabildande sikt.
Jämfört med andra modeller, kan den nya modellen för att härleda parametrar som beskriverVPD där g S nedregleras i vattenbrist. På liknande sätt är VPD erhållits, varvid g S är maximal. Som sådana fysiologiska parametrar kan förväntas vara tätt knuten till kol assimilation 9,10 bör förväntas en nära koppling mellan dessa modellparametrar och de viktigaste blad egenskaper till näringsämnen och resursfördelning som avspeglas i LES 3,11. Följaktligen bör det också finnas en tät relation mellan strategier stomata reglering med LES egenskaper. Ett sådant förhållande väntas i synnerhet för blad vana (vintergröna kontra lövträd) som blad vana både korrelerade med LES och vattenanvändningen effektivare 12,13. Vintergröna arter tenderar att växa långsammare, men är effektivare i miljöer näringsfattiga 14. Därför bör blad vana leda till olika stomata regleringsmönster, med en mer konservativ vattenanvändning strategi än lövträd.
Jämfaring ett stort antal lövträd arter i en gemensam trädgård situation, har följande hypoteser testas: 1) Modell parametrar från g S - VPD modeller är anslutna till blad egenskaper som har att bladet ekonomi spektrumet. 2) Vintergröna arter har lägre genomsnittlig g S och g Smax värden än lövträd.
Protocol
1. stomatal Konduktans
- Mätningar av stomatal ledningsförmåga
OBS: Författarna använde sig av en enkel typ av steady state porometer (Decagon SC1). Den porometer design har fördelen av liten storlek, intuitiv manuell drift och hög tillförlitlighet. När man mäter stomata konduktans i området, se till att minimera avståndet mellan uppmätta personer för en upprepad mätcykel att vara den mest effektiva. - Välj blad av olika arter och individer enligt ett reproducerbart mönster (samma höjd, samma exponerings samma ställning inom anläggningen, om möjligt endast från samma nod, och endast från en kategori, sol eller skugga blad, etc.).
- Enda åtgärd lämnar i friska, icke-skadade och fullt utvecklad tillstånd. Markera löven på individer (t.ex. med buntband eller färg band), för att säkerställa att de upprepade mätningar görs på samma blad.
OBS: Measurements av stomata ledningsförmåga bör göras endast på bladytan samtidigt undvika Mittnerven och starka bladnerver. - Starta mätningar i de tidiga morgontimmarna före soluppgången tar fem till tio upprepade mätningar tills stomatala ledningsförmåga värden visar en tydlig nedgång vid lunchtid.
OBS: En daglig kurs mätningar kommer att leverera bra data för att analysera sambanden mellan VPD och stomatal ledningsförmåga.
- Enda åtgärd lämnar i friska, icke-skadade och fullt utvecklad tillstånd. Markera löven på individer (t.ex. med buntband eller färg band), för att säkerställa att de upprepade mätningar görs på samma blad.
- VPD mätningar
- Med varje g S mätning, spela in temperatur och relativ fuktighet helst med bärbara loggers att direkt mäta förhållandena på positionen för samma blad. För beräkning av ångtrycket underskottet använda augusti-Roche Magnus formel 15.
e s = mätt vattenångtrycket [hPa]
- Modell g S - VPD svar
- Nu plot arter mässigt alla g S data mot VPD, som kombinerar alla dagliga kurser för enskilda blad i en analys per art. Att maximera värdet observerades från stomatala ledningsförmåga uppgifter genom att söka efter det maximala värdet. Att skala modell för arter mässigt jämförbarhet, dela de observerade värden genom det maximala värdet observerats för denna art (g S / g SMAX).
- För varje art, regrediera de logits av g S (g S / g SMAX) till VPD och kvadratiska löptid VPD med hjälp av en generaliserad linjär modell med en binomial felfördelningen (a, b och c representerar regressionsparametrar):
Figur 1. Exempel på plottade värderingar och den anpassade modell för g S -. VPD stomatal ledningsförmåga ritas som en funktion av ångtryck underskottet för arten Liquidambar formosana. Tomma prickar representerar de observerade värdena. (A) Maximal stomatal konduktans var VPD vid maximal stomata ledningsförmåga och menar stomatal konduktans utvinns ur den absoluta alltså icke-skalas stomata konduktans (g S) data. (B) Scaled stomata ledningsförmåga uppgifter (g S / g SMAX) avsattes för att extrahera de relativa parametrar (visas som fyllda punkter) 20. Re-print med tillstånd från 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Alla utrustade modeller för alla arter. Modell grafer för stomatala ledningsförmåga data till VPD regression för alla arter. Vintergröna arter representeras av svarta linjer, lövträd med röda linjer 20. Åter ut med tillstånd från 20.
OBS: Använda logits istället för regressing g S direkt till VPD, leder till den grad att modellerade maxvärden inte överstiger g SMAX och att g S närmar sig 0 vid höga VPD.
- Utdrag parameter klyvöppningarnas förordning för varje art
- Beräkna absoluta modellerade g Smax värden (MaxFit i figur 1B). För att göra detta, beräkna VPD vid maximal stomatal konduktans från att förstaderivatan av 1.4.2 till noll, vilket ger VPD gsMaxFit = -b / 2a. Sätt VPD gsMaxFit i formeln för 1.4.2 och höja till makten av e för att få MaxFit. Beräkna mean av alla ledningsförmåga mätningar per art (se figur 1A).
OBS: Använd statistikprogram R (http://www.r-project.org). - För att beräkna relativa värden, från den skalade modellen (g S / g Smax), extrahera stomata ledningsförmåga och VPD värden för följande två punkter: (1) stomatal ledningsförmåga och VPD vid maximalt av modellen (MaxFit) och (2) VPD vid den andra inflexionspunkten på kurvan (se figur 1B). Multiplicera dessa värden genom g SMAX att erhålla absoluta g S-värden för dessa punkter. Se figur 2 för en komplett överlagring av de enskilda modeller av alla 39 arter analyseras.
- Beräkna absoluta modellerade g Smax värden (MaxFit i figur 1B). För att göra detta, beräkna VPD vid maximal stomatal konduktans från att förstaderivatan av 1.4.2 till noll, vilket ger VPD gsMaxFit = -b / 2a. Sätt VPD gsMaxFit i formeln för 1.4.2 och höja till makten av e för att få MaxFit. Beräkna mean av alla ledningsförmåga mätningar per art (se figur 1A).
2. Mätningar av stomatal Egenskaper
- Ta prover företrädesvis från exakt samma blad som har använts för mätning av stomatal konduktans. Om detta inte är möjligt, tillämpa samma urvalsförfarande som tillämpades på välja bladenför stomatala mätningar ledningsförmåga, företrädesvis på samma individer.
- Applicera ett tunt lager av färglösa, snabbt torkar nagellack (test olika fabrikat, vissa är mer lämpade än andra) till ett nytt prov. Om proverna inte kan behandlas omedelbart, förvara dem i 70% alkohol. Efter nagellack har torkat ut, försiktigt skala av intryck av från bladet och fortsätt för mikroskopisk analys, som med en normal bladprov.
OBS: I fallet med blad med hög trichome densitet ett föregående steg att applicera natriumhydroxid eller en 1: 1 lösning av ättiksyra och syre peroxid kan leda till bättre resultat. - Optiska mikroskopanalys
- Anslut en kamera till ett optiskt mikroskop kan förstoringar mellan 40X till 400X. Efter det att kameran är ansluten till mikroskopet, överensstämmer med bilderna tagna till den optiska förstoring och upplösning av bilden, t.ex., med hjälp av en skala.
- Anställa öppen källkod image bearbetning program som ImageJ 16 analysera dessa bilder.
- Rita en form med formverktyg från bild analysverktyg på bilden i ett område med ingen smuts, tumme tryck, skadade områden, eller stora bladnerver. Räkna klyvöppningar på detta område och i sammanlagt minst 50.000 um 2 per prov.
- Mät stomata vakt cellängd och por längd. Beräkna antalet stomata per mm 2. Beräkna stomata index som förhållandet mellan stomata densitet för att epidermisk cellantalet per mm 2.
3. Bedömning av Leaf Vein Egenskaper
OBS: För bedömningen av blad ven egenskaper, ett modifierat ett protokoll från Sack & Scoffoni 17 användes.
- Provberedning
OBS: För att optimera synligheten av bladnerver, bladen först blekt och sedan färgas med safranin och malakitgrönt.- Att bleka leaves, lämna dem minst 72 timmar i 50% lösning av decolorizer (testa olika fabrikat, igen någon kan fungera bättre). Alternativt kan du använda 5% NaOH-lösning eller 10% -ig KOH-lösning eller 25% H2O 2-lösning.
- Värm upp lösningen till 30 ° C eller kombinera de olika lösningarna från steg 3.1.1 för bättre effekter. Skölj flera gånger i vatten efteråt. Anpassa blekningsprocessen för vissa arter, beroende på deras bladegenskaper.
OBS: Tjockare bladen kan behöva längre lösning bad och eller mer aggressiva lösningar. Tunnare och mer anbud blad kan blekas till en tillfredsställande grad på mindre än 72 timmar. - Att färga bladen placera dem i 100% etanol. Färg dem för 2 - 30 min i 1% safranin lösning. För att förbättra färg, lägga till en extra behandling med 1% malakitgrönt lösning bara för några sekunder. Anpassa protokollet till alla arter i fråga om timing och intensitet för att uppnå optimala resultat. Skölj för sigVeral gånger i vatten efteråt. Om bladen är att djupt färgas, kan en tid i etanol eller decolorizer hjälpa.
- Provanalys
- Skanna bladen med bakgrundsbelysning scanner med en upplösning på ca 1200 dpi. Matcha skannar vidtagits för upplösningen av bilden, till exempel med hjälp av en skala, för att säkerställa att pixel längd kan spåras tillbaka till absoluta takters längd av den skannade blad.
- Mät område, omkrets, längd och bredd av bladen. Beräkna flera index, till exempel, längd / bredd och omkrets 2 / område. Klipp 1 av 1 cm rektangel från mitten av bilden. Mät diametern på venerna i första och andra ordningen (inte inkluderar huvud mitten ven). Mät längden på alla venerna i första order i denna quadrat (ven densitet).
4. Bedömning av andra Leaf Egenskaper
OBS: Rövar typiska blad egenskaper såsom specifikbladyta (SLA), blad torrsubstanshalt (LDMC), bladyta, beståndsdel innehåll, blad vana, blad pinnation, blad compound typ, blad typ marginal etc. följande etablerade protokoll 18,19.
- Observationsbladdrag
- Utvärdera blad pinnation, blad compound typ, blad typ marginal och närvaron av extrafloral nectaries 18,19 genom observation i fält.
- Analytiska bladdrag
- Samla färska bladprover, företrädesvis på samma individer som används för andra mätningar för bestämning av specifik bladyta (SLA), bladyta och blad torrsubstanshalt (LDMC) 18,19. Efter 48 h i torkugnen vid 80 ° C, mäter elementens innehåll och förhållanden, företrädesvis på samma blad.
Representative Results
Många parametrar för stomatal ledningsförmåga och stomata reglering befanns vara relaterade till morfologiska, anatomiska och kemiska blad drag. I det följande, kommer fokus att ligga på länkarna för att VPD vid brytpunkten, vilket minskade med stomata densitet (p = 0,04) och stomata index (p = 0,03) och ökade med innehåll blad kol (p = 0,02, se figur 3). Resultaten visar att med minskande VPD vid inflexionspunkten fanns en minskning i stomatal densitet och stomata index. Däremot ingen parameter klyvöppningarnas konduktans visade en tydlig relation till blad vana. Den höga variationen inom de två grupperna av blad vana visar att olika regleringsmekanismer finns både inom gruppen av vintergröna och lövfällande blad vanor.
Figur 3. Resultat siffra för the länkar mellan mönster av stomatala lednings reglering och blad egenskaper Ångtryck underskott (VPD) vid brytpunkten av g S -. VPD kurva (VpdPoi) som en funktion av (A) klyvöppningar täthet, (B) klyvöppningar index, och (C) blad kolhalt 20. Re-print med tillstånd från 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Parametrarna för stomata reglering extraherats med hjälp av den metod som presenteras i detta dokument understryka vikten av stomatala egenskaper, såsom klyvöppningar densitet och klyvöppningar index. Dessa nya relationer visa potentialen att koppla parametrar från fysiologiska modeller för att morfologiska, anatomiska och kemiska löv drag 20. Jämfört med andra metoder, bär den nuvarande strategin fördelen att fånga en unik och otvetydig VPD värde vid vilket stomata konduktans nedregleras till hälften av det modellerade g maximala.
Av alla stegen i protokollet de mest kritiska är mätningarna av stomatal konduktans. På grund av den multifaktoriella regleringen av stomatala lednings omgivande väderförhållanden har ett starkt inflytande på g S. Stomatala konduktans mätningar vid hög relativ fuktighet och låg ljusintensitet kan vara opålitliga 21-23. Med avseende på morfologiska och anatomical drag, bör protokollet alltid anpassas till den djurart som ingår i studien. Särskilt i analysen venen tätheten, bör giltighetstiden för blekning och färgning av bladen varieras beroende på bladstruktur och seghet. Potentiella metodens begränsningar innefattar arter, för vilka mätningar av stomatal konduktans är omöjliga eller komplicerade och risk för fel på grund av extraordinära bladformer. Detta kan inkludera barrträd och gräs med mycket smala blad blad.
Våra resultat delvis bekräftar den första hypotesen om ett samband mellan stomata ledningsförmåga parametrar och blad drag av bladekonomi spektrum (LES), vilket motsvarar flera andra studier. Till exempel, Poorter och Bongers (2006) 24 rapporterade en nära koppling mellan g S och egenskaper representeras av LES, t ex med g S minskar med ökande blad livslängd. Följaktligen Schulze et al. (1994) 1 demonstrankade tydliga kopplingar mellan bladkvävehalt och g SMAX. Likaså Juhrbandt et al. (2004) 25 hittade signifikanta samband mellan g SMAX och bladyta och bladkvävehalt.
Vår andra hypotes tydliga skillnader när det gäller blad vana kunde inte bekräftas. Den höga variationen i de uppmätta parametrarna och egenskaper inom vintergröna och lövfällande blad vana tyder på att blad vana är inte en bra deskriptor av LES. Brodribb och Holbrook (2005) 26 diskuterade att blad vana och blad fysiologiska strategier inte får oundvikligen anslutas eftersom breda drag variation är vanligt i alla typer av blad vana.
Tillvägagångssättet kan utvidgas till egenskaper och fysiologiska egenskaper som andra än löv, till exempel egenskaper som har att xylem hydraulik växtorgan såsom särskilda xylem hydraulisk konduktivitet och mikroskopi trä drag 27. Likaså andratyper av blad drag som härrör från mikroskopi såsom palissad parenkym struktur och epicuticular vaxskikt struktur skulle kunna ingå 28.
Sammanfattningsvis bekräftade denna studie det nära sambandet mellan LES och stomatal reglering. Dessutom metod som presenteras här avslöjade aspekter av stomatala regleringsmönster som inte är relaterade till LES. Speciellt specifika bladdrag som klyvöppningar storlek, densitet och index samt ven längd förtjänar framtida uppmärksamhet i funktionella växtstudier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC 1 Porometer | Decagon | Any other porometer is suitable | |
| Cable ties to mark leaves | |||
| Plastic sample bags | |||
| Paper sample bags | |||
| Hygrometer | Trotec | Any other is suitable | |
| Nail polish | |||
| Axioskop 2 plus | Zeiss | Any other is suitable | |
| Ethanol | |||
| Bleach | |||
| 5% NaOH | |||
| 10% KOH | |||
| 25% H2O2 | |||
| Malachite green | |||
| Safranine |
References
- Schulze, E. -D., Kelliher, F., Körner, C., Lloyd, J., Leuning, R. Relationships among maximum stomatal conductance, ecosystem surface conductance, carbon assimilation rate, and plant nitrogen nutrition: a global ecology scaling exercise. Annual Review of Ecology and Systematics. 25 (1), 629-662 (1994).
- Chaturvedi, R. K., Raghubanshi, A. S., Singh, J. S. Growth of tree seedlings in a tropical dry forest in relation to soil moisture and leaf traits. Journal of Plant Ecology. 6 (2), 158-170 (2013).
- Santiago, L. S., Kim, S. C. Correlated evolution of leaf shape and physiology in the woody Sonchus. alliance (Asteraceae: Sonchinae) in Macaronesia. International Journal of Plant Sciences. 170 (1), 83-92 (2009).
- Aasamaa, K., Sober, A. Hydraulic conductance and stomatal sensitivity in six deciduous tree species. Biologia Plantarum. 44 (1), 65-73 (2001).
- Waring, R. H., Chen, J., Gao, H. Plant-water relations at multiple scales: integration from observations, modeling and remote sensing. Journal of Plant Ecology-UK. 4, 1-2 (2011).
- Oren, R., Sperry, J. Survey and synthesis of intra- and interspecific variation in stomatal sensitivity to vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 22 (12), 1515-1526 (1999).
- Leuning, R. A critical appraisal of a combined stomatal-photosynthesis model for C3 plants. Plant, Cell and Environment. 18 (4), 339-355 (1995).
- Patanè, C. Leaf area index, leaf transpiration and stomatal conductance as affected by soil water deficit and vpd in processing tomato in semi arid mediterranean climate. Journal of Agronomy and Crop Science. 197 (3), 165-176 (2011).
- Jarvis, A. J., Davies, W. J. The coupled response of stomatal conductance to photosynthesis and transpiration. Journal of Experimental Botany. 49 (Special Issue), 399-406 (1998).
- Roelfsema, M. R. G., Hedrich, R. In the light of stomatal opening: new insights into “the Watergate.”. New Phytologist. 167 (3), 665-691 (2005).
- Wong, S. C., Cowan, I. R., Farquhar, G. D. Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity. Nature. 282 (5737), 424-426 (1979).
- Sobrado, M. A. Hydraulic conductance and water potential differences inside leaves of tropical evergreen and deciduous species. Biologia Plantarum. 40 (4), 633-637 (1998).
- Zhang, Y. -J., Meinzer, F. C., Qi, J. -H., Goldstein, G., Cao, K. -F. Midday stomatal conductance is more related to stem rather than leaf water status in subtropical deciduous and evergreen broadleaf trees. Plant, Cell and Environment. 36 (1), 149-158 (2013).
- Aerts, R.
- Murray, F. W. On the computation of saturation vapor pressure. Journal of Applied Meteorology. 6 (1), 203-204 (1967).
- Basic Concepts. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij/docs/concepts.html (2015).
- Scoffoni, C., Sack, L.
- Cornelissen, J. H. C., Lavorel, S., et al. A handbook of protocols for standardised and easy measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 51 (4), 335-380 (2003).
- Perez-Harguindeguy, N., Díaz, S., et al. New handbook for standardised measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 61 (3), 167-234 (2013).
- Kröber, W., Bruelheide, H. Transpiration and stomatal control: A cross-species study of leaf traits in 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. Trees. 28 (3), 901-914 (2014).
- Larcher, W. Physiological plant ecology. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York, Hong Kong, London, Milan, Paris, Tokyo. 514 (2003).
- Bunce, J. Does transpiration control stomatal responses to water vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 20 (1), 131-135 (1997).
- Bunce, J. A. How do leaf hydraulics limit stomatal conductance at high water vapour pressure deficits. Plant, Cell and Environment. 29 (8), 1644-1650 (2006).
- Poorter, L., Bongers, F. Leaf traits are good predictors of plant performance across 53 rain forest species. Ecological Sciences of America. 87 (7), 1733-1743 (2006).
- Juhrbandt, J., Leuschner, C., Hölscher, D. The relationship between maximal stomatal conductance and leaf traits in eight Southeast Asian early successional tree species. Forest Ecology and Management. 202 (1-3), 245-256 (2004).
- Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. Leaf physiology does not predict leaf habit; examples from tropical dry forest. Trees. 19 (3), 290-295 (2005).
- Kröber, W., Zhang, S., Ehmig, M., Bruelheide, H. Xylem hydraulic structure and the Leaf Economics Spectrum - A cross-species study of 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. PLOS ONE. 9 (11), e109211 (2014).
- Kröber, W., Heklau, H., Bruelheide, H. Leaf morphology of 40 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species and relationships to functional ecophysiological traits. Plant Biology. 17 (2), 373-383 (2015).
