Introduction
مفهوم الأنساب متميزة أو مجموعات فرعية من CD4 + T المساعد وكانت (ث) خلايا موجودة منذ الجزء الأخير من القرن التاسع 20 1. الاعتراف مستضد وما شابه ذلك بحضور النتائج إشارات costimulatory في عدة جولات من انتشار الخلوي والتمايز في نهاية المطاف إلى المستجيب ث الخلايا. نوع ث الخلايا المولدة خلال هذه العملية يتوقف على البيئة خلوى الحالية خلال تفعيل 2. في البداية، كان يعتقد خلايا ث ساذجة لاستقطاب في 2 الأنساب المتميزة التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التنشيط، costimulatory CD28 ربط، وخلوى الإشارات. وتتميز نوع 1 الخلايا المساعدة (TH1) من خلال إنتاج المستجيب لها من خلوى IFNγ فضلا عن احتياجاتهما لIL-12 الإشارات خلال 3،4 عملية التمايز. في نهاية المطاف تم اكتشاف أن خلايا TH1 متباينة لديها الصورة الجينية التي تتميز معظم متميز بذ التعبير عن مربع T عامل النسخ الأسرة، Tbx21 (T-رهان)، والتي تعتبر المنظم الرئيسي للبرنامج جيني TH1 5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن IL-12 وكذلك IFNγ تعزيز T-رهان التعبير 6،7. في الاستجابة المناعية، وخلايا TH1 مهمة للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وكذلك المروجين قوي للالتهاب المناعة الذاتية. في المقابل، خلايا من النوع 2 المساعد (TH2) تتطلب IL-4 لتنميتها والسيتوكينات المستجيب، بما في ذلك IL-4 و IL-5، وIL-13، هي مهمة للقيادة استجابات الخلايا B وهي المسببة للأمراض في الحساسية 8، 9. وعلى غرار TH1 الخلايا، تم العثور على خلايا TH2 للتعبير عن نفسه منظم النسخي سيدهم، ووصف GATA-3 10،11. ومن المثير للاهتمام، فإن وجود السيتوكينات استقطاب وتوليد نسب ث المحددة هي معادية لتطوير الآخرين 2،12، مما يوحي بأن مجموعة فرعية فقط ث معينة قد تصبح المهيمنة خلال إعادة المناعياستجابته.
منذ التعرف على Th1 و TH2 الأنساب، وقد أثبت المزيد من العمل حتى أكثر فريدة من نوعها مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة، بما في ذلك مسامي المساعد (TFH)، IL-9-إنتاج (Th9)، وIL-22-إنتاج (Th22) (مؤخرا استعراضها في 13). لأغراض التجارب في المختبر التمايز، وهذا البروتوكول تركز فقط على اثنين من مجموعات فرعية ث إضافية، ووصف خلايا T التنظيمية (Treg) وIL-17-إنتاج خلايا CD4 + T (Th17). CD25 + خلايا T التنظيمية يمكن أن يحدث بشكل طبيعي (nTreg) في الغدة الصعترية. ويمكن أيضا أن يتسبب خلايا ث ساذجة (iTreg) لتصبح التنظيمية في محيط (استعراضها في 14،15). كلا النوعين من Tregs تعبر عن عامل النسخ مميزة، يطلق مربع forkhead P3 (Foxp3)، وهو أمر حاسم لآليات قمع المستجيب لها والتي تشمل إنتاج قابل للذوبان المضادة للالتهابات الوسيط، IL-2 الاستهلاك، وآليات الخلية التي تعتمد على الاتصال 14،15. عدم وجود Foxp3 النتائج في التعبير الشديد، الأعضاء المتعددة اضطراب المناعة الذاتية وصفته ديسريغولاتيون المناعي، polyendocrinopathy، الأمعاء، ومتلازمة X-مرتبط (IPEX)، مما يدل على الدور الحاسم لهذا فرعية ث في حل التهاب وتنظيم التسامح الطرفية في تقرير المصير مستضدات 16. في المختبر، الخلايا المساعدة CD4 + T ساذجة يصل تنظيم Foxp3 وأصبح ملتزما برنامج Treg على التحفيز مع IL-2 و TGF-β 14،15. قد يكون هناك معتدلة إلى اللدونة كبيرة في CD4 + T الأنساب الخلية، وخاصة عند النظر في إنتاج السيتوكينات الوحيد (استعراضها في 17،18). ومع ذلك، لأغراض في المختبر بروتوكولات التمايز، وسوف نناقش كل مجموعة فرعية كما نسب فريدة من نوعها.
مؤخرا، تم تحديد مجموعة فرعية من خلايا Th17 التي تنتج خلوى IL-17 كما نسب فريدة من نوعها مع وظائف الموالية للالتهابات التي هي المسببة للأمراض وخاصة أثناء التهاب المناعة الذاتية 19-21. خلايا Th17 تعبر عن عامل النسخ فريدة من نوعها، ووصف المتعلقة ريتينويد اليتيم مستقبلات غاما ر (RORγt) التي تنسق برنامج جيني Th17 22. TGFβ المهم لتوليد Th17 النسب من خلال تحريض RORγt. ومع ذلك، يعتقد أن تأثير TGFβ إشارات للحث على الالتزام فقط Th17 على التآزر مع IL-6 (استعراضها في 12). وقد أظهرت دراسات أخرى أن مجموعة متنوعة من الإشارات الأخرى التي يمكن أن تنظم بشكل إيجابي التزام Th17، بما في ذلك IL-1β، وزيادة الصوديوم، وTLR اشارة 23-26. وأشارت تقارير أخرى إلى أن خلايا Th17 المسببة للأمراض في الجسم الحي هي تلك التي تجاوز الواقع TGFβ الإشارات وبدلا من ذلك تعتمد على مزيج من IL-1، IL-6، وIL-23 للتمايز على 27. وبالتالي، قد تكون مشتقة خلايا Th17 من مجموعة متنوعة من مسارات الإشارات. لأغراض هذا البروتوكول، وشائعة الاستخدام (TGFβ وIL-6) مسارا لTh17 التزام النسبوستعرض.
البروتوكولات التمايز هو موضح أدناه لجميع الأنساب المستجيب تعتمد على الأجسام المضادة ثابت كما المحفزات لTCR وCD28 في جميع أنحاء كامل التجربة. ومع ذلك، فقد أظهرت آخرون أن تفعيل TCR مع الخلايا العارضة للمستضد 28 أو مكافحة CD3 وأضداد CD28 مع الهامستر الأجسام المضادة ربط عبر لمدة 2 أيام 29 هي أيضا وسيلة فعالة للغاية من تحريض جيل من مختلف مجموعات فرعية ث. بروتوكول المعروضة هنا يبني على أساليب ذكرت سابقا لعزل خلايا CD4 + T الفئران من الأجهزة اللمفاوية الثانوية 30 و توليد خلايا Th17 31. احد الفرق الرئيسي هو أن هذا البروتوكول يعتمد على استخدام فارز خلية لعزل خلايا CD4 + T ساذجة من الأنسجة اللمفاوية. ومع ذلك، العديد من الشركات تقدم الآن مجموعات فصل السريعة التي يمكن أن تثري للخلايا CD4 + T السذاجة، والتي قد تكون قادرة على تجاوز شرط وأو الفرز اعتمادا على التجربة. الطرق والكواشف الواردة في هذا البروتوكول هي التي نستخدمها بشكل روتيني وتجد أن تكون الأكثر فعالية. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن الكواشف ومنهجيات بديلة موجودة لكثير من الخطوات الواردة أدناه، والأمر متروك إلى المختبر الفردية لتحديد ما سوف تعمل بشكل أفضل لتحقيق أغراضهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية باستخدام بروتوكولات المعتمدة من قبل مكتب الصحة البيئية والسلامة في جامعة روزاليند فرانكلين الطب والعلوم. وتم إيواء C57BL / 6 الفئران (تم شراؤها من NCI) المستخدمة لهذا البروتوكول في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وأجريت جميع التجارب على الحيوانات باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) في جامعة روزاليند فرانكلين الطب و العلم.
1. إعداد الأدوات والمستلزمات والكواشف
- معطف 48-جيدا أو 24-جيدا لوحات مع مكافحة CD3 ومكافحة CD28 (الجدول 1) في برنامج تلفزيوني العقيمة، والغطاء والتفاف في بارافيلم لمنع التبخر وتلوث، ومن ثم احتضان O / N عند 4 درجة مئوية قبل يوم واحد T العزلة الخلية. بدلا من ذلك، الآبار معطف 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أداء الظروف Th0، TH1، TH2، وiTreg بواسطة طلاء على حد سواء لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 في 1μg / مل في 0.5-1 مل لحجم التل (لوحة 48 أيضا). لTh17، ونحن عادة معطف مكافحة CD3 في 2 ميكروغرام / مل ومكافحة CD28 في 1 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: لقد وجدنا أن أقل تركيز مكافحة CD3 هو الأمثل لتوليد TH1، TH2، وiTreg في حين أن أعلى تركيز لمكافحة CD3 هو الأمثل لتوليد Th17. وهكذا، ومكافحة CD3 وتركيزات مكافحة CD28 يجب معاير والأمثل للمختبرات الفردية (الجدول 2). - تعقيم مجموعة من الأدوات تشريح (مقص وملقط) من خلال حل الأوتوكلاف أو مطهر. ستكون هناك حاجة إلى أنبوب أو كوب صغير يحتوي على 70٪ من الإيثانول لتعقيم سريع من الأدوات بين تشريح. وأخيرا، سوف تكون هناك حاجة إلى زجاجة رذاذ يحتوي على 70٪ من الإيثانول لتعقيم سطح الماوس قبل تشريح.
- إعداد سطح تشريح بلف قطعة مسطحة من الستايروفوم أو corkboard في رقائق الألومنيوم. وتستخدم تشريح دبابيس أو الإبر لإصلاح الحيوان في المكان.
- إعداد أطباق أو لوحات لجمع منظمة الشفافية الدوليةssues. إذا الأنسجة تجميع، 60MM أطباق منفصلة تحتوي على 3ML من معقمة PBS + 1٪ FBS (PBS +) لأنسجة الطحال والعقد اللمفاوية غير كافية. إذا حفظ الأنسجة من الفئران الفردية منفصلة، وإعداد 1ML 24 لوحة جيدا تحتوي على من برنامج تلفزيوني + في العدد المرغوب فيه من الآبار.
- إعداد كاملة وسائل الاعلام RPMI للثقافة الخلية وقبل الدافئ قبل الاستخدام (الجدول 1).
ملاحظة: نحن عادة استخدام RPMI ولكن وسائل الإعلام الأخرى مثل IMDM وDMEM قد تكون فعالة بنفس القدر أو متفوقة اعتمادا على المختبر والتجربة. - قطع 2X2 سم الساحات من النايلون شبكة مع 120 ميكرون حجم المسام والأوتوكلاف لتعقيم (الجدول 1).
- اختياري: في حالة استخدام الخلية مغناطيسية عالية السرعة نظام الفرز مثل autoMACS لتخصيب خلايا CD4 +، وتشغيل ما قبل دافئ والشطف مخازن في 37 س C حمام الماء لمنع تلف الجهاز.
- ملاحظة: يوصى التخصيب لزيادة الغلة الفرز وتقليل فرز الوقت.
- جميعخطوات التحضير، باستثناء تشريح، يجب أن يؤديها في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة.
2. عزل الغدد الليمفاوية والطحال من الفئران
- الموت ببطء العدد المطلوب من الحيوانات باستخدام تقنية افق مؤسسيا. استخدام C57BL / 6 إناث الفئران، سن 5-10 أسبوعا، بسبب نسبتهم عالية من خلايا T ساذجة وانخفاض الدهون في الجسم بالمقارنة مع الذكور أو الفئران الأكبر سنا.
ملاحظة: سوف الخلايا المشتقة من الفئران الذكور أداء مماثل في المختبر، وتبقى الخطوات البروتوكول نفسه. سوف إناث الفئران، 5-10 أسبوعا من العمر، وعادة ما تسفر 3-6 × 10 6 خلايا CD4 + ساذجة T في الماوس. ومع ذلك، باستخدام سلالات مختلفة من الفئران قد تؤثر على المحصول والأداء. على سبيل المثال، الخلايا من C57BL / 6 الفئران هي أفضل لتوليد خلايا TH1 في حين أن الخلايا من الفئران Balb.c أفضل لتوليد خلايا TH2. - نشر أطرافه من الحيوان ويعلقون لهم في المكان كما هو مبين في الشكل 1. قطع الجلد طويلitudinally من فتحة الشرج إلى الذقن مع الحرص على عدم ثقب الأنسجة العميقة.
- انتشار فتح الجلد مع ملقط ودبوس الجلد في مكان للسماح سهولة الوصول إلى الغدد الليمفاوية كما هو مبين في الشكل (1).
- حصاد الغدد الليمفاوية يمكن الوصول إليها من المواقع هو مبين في الشكل 1. الاستيلاء على العقدة الليمفاوية مع زوج من ملقط حين فصل الأنسجة مع زوج آخر من ملقط سيسمح لسهولة إزالة. وضع الأنسجة في طبق جمع.
- حصاد الطحال من الموقع هو مبين في الشكل (1). وفي هذه الحالة، لا بد من قطع دقيق في الصفاق للوصول إلى الطحال. وضع الأنسجة في طبق جمع.
- كرر الإجراء إذا كان سيتم حصادها المزيد من الأنسجة. المضي قدما إلا إلى الخطوات التالية. عند هذه النقطة، نفذ كل الخطوات المتبقية على الجليد حتى الطلاء للخلايا T بعد الفرز.
3. تجهيز الأنسجة وCD4 + التخصيب
- معالجة الغدد الليمفاوية والطحال في أطباق مختلفة لزيادة الغلة كما الاستعدادات خلية العقدة الليمفاوية لا تتطلب كرات الدم الحمراء تحلل، والتي قد تؤدي إلى الوفاة طفيفة الكريات البيض. ولذلك، تصف الخطوات التالية طريقة لمعالجة الطحال والعقد اللمفاوية السكان تليها بشكل منفصل من خلال الجمع بين قبل وضع العلامات للفرز.
- إزالة الأنسجة (الطحال أو الغدد الليمفاوية المجمعة) من الطبق جمع ومكان في جديد 60 ملم صحن يحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني +. ضع مربع من النايلون العقيمة شبكة على الأنسجة باستخدام ملقط معقم.
- اتخاذ جانب الإبهام من المكبس حقنة (3-10 مل)، وسحق بلطف الأنسجة ضد شبكة. جميع الأنسجة تقريبا يجب ان تذهب الى تعليق. بدلا من ذلك، ضع الأنسجة بين شريحتين بلوري تعقيمها ومطحون إلى تعليق.
- ماصة تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق كتل قابلة للذوبان المتبقية. ضع قطعة مربع جديد من شبكة من النايلون خلال افتتاح15 مل أنبوب مخروطي الشكل وتصفية تعليق من خلال لازالة الانقاض المتبقية.
- كرر الخطوات من 2-4 العقدة الليمفاوية إضافية والأنسجة الطحال.
- مرة واحدة وقد تم تصفيتها تعليق في أنبوب 15ML ملء ما تبقى من الأنبوب مع برنامج تلفزيوني + وعكس عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- للخلايا الطحال، ونضح طاف الطرد المركزي التالية و resuspend بيليه خلية في 1 مل من الجليد الباردة 1X ACK حل في الطحال لمدة 1 دقيقة لليز كريات الدم الحمراء. ثم إضافة 10 مل من PBS + على رأس ACK، عكس الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- لخلايا العقدة الليمفاوية، نضح في وطاف resuspend في من 2ml PBS +. إذا رغبت هذه يمكن دمجها مع الخلايا الطحال بعد تحلل ACK وخطوة الغسيل.
- نضح طاف بعد الطرد المركزي من splenocytes وresuspend في 10 مل أخرى من برنامج تلفزيوني +. عند هذه النقطة تعليق العقدة الليمفاوية يمكن أن يكونdded على رأس تعليق الطحال إذا كان مطلوبا تجميع الأنسجة للفرز. أجهزة الطرد المركزي أنبوب مرة أخرى في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- ويمكن الآن بيليه الخلية تكون مستعدة لتخصيب CD4. إذا لن يتم تنفيذ هذه الخطوة، انتقل إلى خطوات إعداد الفرز.
- لتخصيب CD4 باستخدام الخلايا فرز نظام مغناطيسي فائق السرعة، resuspend الكرية الخليوي مع حبات CD4. وعادة ما تستخدم 15 ميكرولتر من الخرز مخففة في 85 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + لتسمية الأنسجة من 1 الماوس. تكثيف حجم خليط حبة حسب الحاجة، resuspend الكرية، واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني +، تمرير تعليق من خلال النايلون في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الأنقاض، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + في الماوس، والشروع في اختيار إيجابية على الخلية مغناطيسية عالية السرعة نظام الفرز. في حالة استخدام نظام الفصل اليدوي، وollow إرشادات الشركة المصنعة لتخصيب اليورانيوم. بدلا من ذلك، resuspend والعينات في المخزن FACS: PBS مع 1MM EDTA (الرقم الهيدروجيني = 8) و 1٪ BSA، عقيم، تمت تصفيتها.
- إزالة جزء إيجابي ويغسل مرة أخرى مع 10ML من برنامج تلفزيوني +. وأثرى CD4 + جزء هو الآن على استعداد ليكون المسمى لفرز.
4. خلايا الفرز السذاجة CD4 + T
- تسمية الخلية بيليه مع PBS + تحتوي على الأجسام المضادة الفلورسنت موجهة ضد CD62L، CD44، CD25، وCD4. إذا باستخدام الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1، وتقدم التخفيفات لكل منها. لتلطيخ، يتم استخدام حجم 100 ميكرولتر من الكوكتيل الأجسام المضادة في الأنسجة من ماوس واحدة.
- Resuspend وبيليه في الضد كوكتيل واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مع 10ML من برنامج تلفزيوني + وأجهزة الطرد المركزي 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- تمرير الخليط على مرشح النايلون أو مصفاة خلية غطاء آخر لإعادةنقل أي بقايا الحطام. ماصة الخلايا المسمى في أنبوب متوافق لفارز الخلية. تبقي الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى هذا القبيل.
- إعداد أنابيب جمع من قبل pipetting 1-2ml من وسائل الإعلام كاملة RPMI FBS أو في الجزء السفلي من أنابيب متوافقة لجمع على فارز الخلية.
- ترتيب الخلايا الساذجة CD4 + T باعتباره CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - السكان (الشكل 2). غسل الخلايا التي تم جمعها مع وسائل الإعلام كاملة RPMI وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
- Resuspend وبيليه في RPMI كاملة، عد خلايا ساذجة، وضبط تركيز إلى 1 × 10 6 خلية / مل.
5. إعداد والتمايز في المختبر
- نضح آبار مكافحة CD3 ومكافحة CD28 لوحات المغلفة وغسل كل بئر مع 1ml من برنامج تلفزيوني العقيمة (لا FBS). لوحات 48-جيدا، لوحة 0.5 × 10 6 خلية / جيدا في 0.5 مل من RPMI. ل24 لوحات جيدا، والثقافة، 1 × 10 6 خلية / جيدا في 1.0 مل من RPMI.
- إذا اختبار تأثير عامل مثل المخدرات إضافة مادة إلى آبار المناسبة سواء قبل أو أثناء أو بعد عملية التمايز اعتمادا على التجربة. وبعد ذلك، تكملة سائل الإعلام والثقافة مع السيتوكينات والأجسام المضادة ومنع وفقا لذلك. Th0: 30 U / مل HIL-2. TH1: 15 نانوغرام / مل rmIL-12، 30 U / مل HIL-2، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11.Th2: 10 نانوغرام / مل rmIL-4، 30 U / مل HIL-2، 2،000 نانوغرام / مل للذوبان 37.51، و 5،000 نانوغرام / مل XMG1.2. iTreg: 15 نانوغرام / مل hTGFβ، 30 U / مل HIL-2، 5،000 نانوغرام XMG1.2 / مل، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11. Th17: 20 نانوغرام / مل rmIL-6، 3 نانوغرام / مل hTGFβ، 5،000 نانوغرام XMG1.2 / مل، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11.
وعثر على الشروط الواردة أعلاه لتكون الأمثل لتعظيم إنتاج السيتوكينات التي تقاس في نهاية التجربة التمايز (القسم ممثل النتائج): ملاحظة. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل لكل حالة للمختبرات الفردية (الجدول 2 - احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 4-5 د قبل تحليل التعبير الجيني وإنتاج السيتوكينات. بدلا من ذلك، إزالة الخلايا من المحفزات TCR بعد 2 د، بعد تعديلها ل1 × 10 6 خلية / مل مع وسائل الإعلام الجديدة، وصفيحة في آبار جديدة (غير المغلفة) لتعزيز انتشار والعائد النهائي. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة السيتوكينات استقطاب الطازجة والأجسام المضادة ولكن يجب إضافة 10 U / مل من IL-2 إلى وسائل الإعلام الجديدة لTh0، TH1، TH2، والثقافات iTreg.
6. تحليل التمايز
- لتحليل خلوى بواسطة التدفق الخلوي، restimulate كل بئر مع 10ng / مل سلطة النقد الفلسطينية و 1،000 نانوغرام / مل ionomycin أو 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD3 لمدة 4-6 ساعة في وجود المانع جولجي مثل brefeldin ألف (الجدول1). أداء الخلايا تلطيخ خلوى اعتمادا على التجربة (الشكل 3).
ملاحظة: وصمة عار غير نسب محددة السيتوكينات أو عوامل النسخ، مثل IL-4 (لا يظهر) وIFNγ (الشكل 3) للثقافات Th17، لكل حالة والضوابط السلبية وكمؤشر على كفاءة التمايز. وعلاوة على ذلك، قد تحدث Foxp3 وصمة عار للثقافات Th17 إلى تطوير متبادلة من Tregs مع إضافة TGFβ. - لالبروتين الكمي، وجمع supernatants من كل فحص جيدا وخلوى محددة ELISA (الشكل 3). إذا كان هناك قلق من أن عامل يجري اختبارها أثرت انتشار مقارنة عينات السيطرة، وخلايا يمكن غسلها، عدها، وقد تمت تسويته، ثم restimulated مع 1 ميكروغرام / مل من مكافحة CD3 لمدة 24 ساعة قبل جمع supernatants لفحوصات ELISA. إذا يعاير IL-4 من TH2 الشروط والغسيل وrestimulating ضروري لإزالة IL-4 التي قد تكون لeftover من ثقافة التمايز الأولية.
- لتحليل التعبير الجيني من قبل في الوقت الحقيقي PCR، وخلايا الحصاد بعد فترة الحضانة، وغسل، تطبيع، وإعادة تنشيط ل2-6 ساعة مع 1 ميكروغرام / مل من مكافحة CD3 قبل الحصاد مرنا (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النقطة الوقت لتحليل التمايز يمكن أن تختلف تبعا لحالة ث يجري اختبارها فضلا عن قوة T تنشيط مستقبلات الخلية. بعد 2-3 أيام من التمايز، والخلايا يمكن تصور بواسطة المجهر الضوئي لتحديد مدى انتشار الخلايا T. سوف الآبار واظهار انتشار واسع والتثاقل من خلايا من المرجح أن تكون جاهزة للتحليل في يوم 4. ظروف التمايز الاعتماد على إضافة خارجي IL-2، مثل Th1 و TH2، ومن المرجح أن استنفاد وسائل الاعلام بعد 4 أيام في الثقافة. لتعظيم إنتاج السيتوكينات، تلك الآبار مع وسائل الإعلام استنفدت يمكن تجديدها مع RPMI الطازجة التي تحتوي على IL-2 أو عدها وإعادة مطلي في 1 × 10 6 خلايا لكل بئر في RPMI الطازجة التي تحتوي على IL-2 لتمديد التمايز ليوم آخر أو اثنين باستخدام هذا الأسلوب.
شملت رقمالبريد 1. توضيحات من دبوس التنسيب لإصلاح ماوس لعزل الطحال والغدد الليمفاوية. (A) نشر أطرافه، وبصرف النظر اصلاحها مع إبرة معقمة أو تشريح دبوس. من هذا الموقف، وقطع الفرو والجلد طوليا من الذيل إلى الذقن. (B) بعد القطع، بلطف نشر الجلد بعيدا لفضح الغدد الليمفاوية كما هو مبين في الصورة. يتم سرد مواقع الغدد الليمفاوية التي يمكن الوصول إليها من هذا الموقف بسهولة في الصورة. يقع الطحال فقط تحت القفص الصدري على الجانب الأيمن من الحيوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم استراتيجية فرز 2. الممثل لعزل CD4 + السذاجة خلايا T من قبل خلية الفرز. وانطلاقا من الجانب الأيسر العلوي، وبوابات الخلايا الليمفاوية أولا حسب الحجم وثم يتم تميز خلايا القميص من خلايا صدرة. النابضة على فانلات تكشف يبلغ عدد سكانها CD4 + CD25 + الخلايا التي هي nTregs. البوابة على CD4 + CD25 - السكان وثم السذاجة نوع (CD62L + CD44 -) من المستجيب / الذاكرة (CD62L - CD44 +) CD4 + الخلايا. الخطوط المنقطة تشير إلى أصل بوابة المؤامرة القادمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نموذج البيانات التالية في المختبر ث التمايز. (A) إنتراك البيانات ellular تلطيخ خلوى (بوابات على CD4 +) من TH1، TH2، iTreg، والتفرقة Th17. عادة، السيتوكينات محددة غير النسب، مثل IL-4 و IFNγ للثقافات Th17، يجب أن تكون ملطخة لتحديد نوعية التمايز. البيانات (B) ELISA عقب 4 د ث التمايز، والغسيل، و24 ساعة restimulation من الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD3. (C) في الوقت الحقيقي PCR البيانات من عوامل النسخ نسب محددة بعد 4 د التمايز وrestimulation لمدة 4 ساعات مع 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD3. وكانت جميع كميات الجين تطبيع للتعبير عن β-الأكتين ومرنا من خلايا T ساذجة غير متمايزة بمثابة الأساس للالتعبير الجيني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. انظر مواد الجدول أدناه.
| كاشف | وأوصت المدى المعايرة |
| السيتوكينات: | |
| البشري (ح) IL-2 | 5 U / مل - 50 U / مل |
| rmIL-4 | 5 نانوغرام / مل - 30 نانوغرام / مل |
| rmIL-6 | 5 نانوغرام / مل - 30 نانوغرام / مل |
| rmIL-12 | 10 نانوغرام / مل - 30 نانوغرام / مل |
| hTGFb (Th17) | 0.1 نانوغرام / مل - 5 نانوغرام / مل |
| hTGFb (iTreg) | 5 نانوغرام / مل - 30 نانوغرام / مل |
| الأجسام المضادة: | |
| 2C11 (مكافحة CD3) | 500 نانوغرام / مل - 5،000 نانوغرام / مل |
| 37.51 (مكافحة CD28) | 250 نانوغرام / مل - 2،500 نانوغرام / مل |
| 11B11 (مكافحة IL-4) | 5،000 - 10،000 نانوغرام / مل |
| XMG1.2 (مكافحة IFNg) | 5،000 - 10،000 نانوغرام / مل |
الجدول 2. يوصى به المدى المعايرة لتعظيم الاستفادة من التمايز الشروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن الطحال يحتوي على خلايا ث الساذجة، فإن نسبة هذه الفئة من السكان في الغدد الليمفاوية هو أعلى من ذلك بكثير. والفشل في تحديد بشكل صحيح وإزالة العقد اللمفاوية في هذا البروتوكول يؤدي إلى العائد الضعيف للخلايا ساذجة. وهذا يمكن أن يكون من الصعب وخصوصا في الفئران الأكبر سنا أو الفئران الذكور التي لديها أكثر الأنسجة الدهنية. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وتحديد السليم وتعلق في الأطراف الحيوان والجلد سوف تسمح لتصور أسهل من الغدد الليمفاوية الخارجية يمكن الوصول إليها. مرة واحدة تتم معالجة الغدد الليمفاوية والطحال، الفرز خلية هو الأسلوب المفضل للحصول على السذاجة السكان خلية CD4 + T عالي النقاء. نقاء أمر بالغ الأهمية لمنع nTregs أو المستجيب والذاكرة ث الخلايا من التأثير على عملية تمايز الخلايا الساذجة. عادة ما تحدث صعوبات في الحصول على عائد مرتفع من خلايا T ساذجة من قبل جمع الأنسجة غير فعال ومعالجة أو فقدان الخلايا خلال خطوات الانفصال. لزيادة العائد جعل الصورةلدى عودتهم إلى معالجة الخلايا باستخدام مخازن الباردة وحضانات على الجليد. وعلاوة على ذلك، لمنع فقدان الخلايا خلال التخصيب و / أو الفرز، وتحسين الكواشف والبروتوكولات الفصل مسبقا يوصى. وأخيرا، وكما ذكر في نقاط مختلفة في الخطوات البروتوكول، ينبغي أن يكون الأمثل الظروف التمايز للمختبرات الفردية قبل إجراء التجارب على نطاق واسع (الجدول 2).
كما هو مبين في الشكل 2، وخلايا CD4 + T ساذجة يمكن بسهولة تمييزها عن nTreg (CD4 + CD25 +) والمستجيب (CD4 + CD44 + CD62L -) السكان. الفرز هو واحد من أكثر الطرق يمكن الاعتماد عليها لمنع التلوث من المستجيب ث مجموعات فرعية، والتي توجد أيضا في الطحال والغدد الليمفاوية. تلوث Treg خلال التمايز قد يؤدي إلى قمع تنشيط وكذلك إنتاج السيتوكينات. تلوث المستجيب الآخرين ث مجموعات فرعية قد يؤدي إلىإنتاج السيتوكينات التي هي المثبطة لتطوير الأنساب ث المطلوب. يمكن فرز رسوم منشأة تكون مكلفة ويجد البعض أنه من الأسهل لإثراء للخلايا CD4 + T من الفصل المغناطيسي لخفض فرز الوقت كما هو موضح في هذا البروتوكول. في حالة عدم وجود فارز، وبعض الشركات تقدم الآن مجموعات فصل مصممة خصيصا لعزل خلايا CD4 + T ساذجة. ومع ذلك، ينبغي دائما أن يتم التحقق نقاء من السكان بعد الانفصال، على غرار عينات فرزها. إن النتيجة المتمثلة في تردد منخفض من خلايا CD4 + T ساذجة (CD62L +) بالمقارنة مع خلايا الذاكرة / المستجيب (CD44 -) قد تشير إلى وجود مشكلة مع الماوس، مثل العدوى أو ورم. في هذه الحالة لا ينبغي أن تستخدم الخلايا لهذا النوع من التجربة.
هناك عدد غير قليل من الطرق لتحديد مدى فعالية ث التمايز. يتم تنفيذ تحليل البروتين تقليديا خلوى وصمة عارجي، والتي سوف تعطي فكرة عن النسبة المئوية للخلايا ساذجة التي تم الاستقطاب إلى نسب محددة (الشكل 3). الكمي البروتين بواسطة ELISA هو أيضا أداة مفيدة لتحديد المبلغ الإجمالي للالسيتوكينات التي تطلق في وسائل الإعلام. التحذير مع ELISA تحليل البروتين على الرغم من أن مقارنة النتائج بين المجموعات التجريبية قد يكون من الصعب إذا كان عامل معين يجري اختبارها له تأثير على انتشار والبقاء على قيد الحياة. في هذه الحالة، فإن العدد الإجمالي للخلايا المنتجة للالسيتوكينات قد تكون مختلفة بين الجماعات في نهاية التجربة. وبالتالي، تطبيع عدد خلايا وrestimulating لفترة قصيرة من الزمن (على سبيل المثال، ومكافحة CD3 لمدة 24 ساعة) ضروري للحصول على نتائج مناسبة. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام IL-4 كعامل استقطاب لتوليد فرعية TH2، لذلك يجب أن تغسل هذه الخلايا، وقد تمت تسويته، وrestimulated قبل إجراء عملية ELISA لIL-4. تحليل التعبير الجيني من قبل في الوقت الحقيقي PCR هو مفيد ليس فقط وأو تحليل النسخ خلوى الجينات، ولكن أيضا لعوامل النسخ نسب محددة (الشكل 3). وهكذا، اعتمادا على التجربة، وهناك طرق مختلفة لفحص فعالية ث التمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء المختبر رينولدز في روزاليند فرانكلين جامعة الطب والعلوم، والمختبر تشن دونغ في جامعة تكساس مركز أندرسون للسرطان لتعظيم الاستفادة من هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من خلال منحة لJMR من المعاهد الوطنية للصحة (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
