Introduction
Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin-Signalisierung zu polarisieren. Typ-1-Helfer-Zellen (Th1) mit ihren Effektorfunktionen Produktion des IFN Cytokin sowie deren Erfordernis für IL-12-Signalisierung während des Differenzierungsprozesses 3,4 gekennzeichnet. Schließlich wurde entdeckt, dass differenzierte Th1-Zellen eine genetische Profil, das am meisten ausgeprägt auszeichnet b habeny der Ausdruck der T-Box-Familie Transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), die als die Hauptregulator des Th1 genetische Programm 5 ist. Darüber hinaus kann IL-12 sowie IFNy T-bet Ausdruck 6,7 fördern. In der Immunantwort sind Th1-Zellen wichtig für die Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Pathogene sowie starke Promotoren von Autoimmunentzündung. Demgegenüber Typ 2-Helfer-Zellen (Th2) erfordern IL-4 für ihre Entwicklung und ihre Effektorfunktion Cytokine, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13, sind für den Antrieb B-Zell-Antworten und sind pathogen Allergie 8, 9. Ähnlich wie Th1-Zellen wurden Th2-Zellen gefunden, um ihre eigenen Master Transkriptionsregulator zum Ausdruck, bezeichnet GATA-3 10,11. Interessanterweise ist das Vorhandensein von polarisierenden Cytokine und die Erzeugung eines spezifischen Th Linie antagonistisch auf die Entwicklung anderer 2,12, was darauf hindeutet, daß nur eine bestimmte Teilmenge Th kann während einer Immunwieder dominantAntwort.
Da die Identifizierung der Th1 und Th2-Linien hat weitere Arbeit noch einzigartig Gruppen von T-Helfer-Zellen, einschließlich follikulären helper (TFH), IL-9-produzierenden (Th9) und IL-22-produzierenden (Th22) (kürzlich gezeigt in 13 überprüft). Für die Zwecke der in vitro Differenzierungsexperimente wird dieses Protokoll nur an zwei weiteren Th Subsets konzentrieren, genannt regulatorischen T-Zellen (Treg) und IL-17-produzierenden CD4 + T-Zellen (Th17). CD25 + regulatorische T-Zellen können natürlich (nTreg) im Thymus auftreten; naiven Th-Zellen können auch induziert werden (iTreg) Regulierungs in der Peripherie (in 14,15 prüft) zu werden. Beide Arten von Treg exprimieren eine charakteristische Transkriptionsfaktor, bezeichnet als forkhead Feld P3 (Foxp3), die kritisch für ihre Effektorfunktion Unterdrückungsmechanismen, die lösliche entzündungshemmende Mediatorproduktion, IL-2 -Verbrauch und Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen 14,15 enthalten ist. Das Fehlen Foxp3-Expression führt zu einer schweren, Multiorgan-Autoimmunerkrankung bezeichnet Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-chromosomale Syndrom (IPEX), was die wichtige Rolle dieses Th Teilmenge der Lösung Entzündung und Regel periphere Toleranz gegen Selbst-Antigene 16. In vitro, naive CD4 + T-Helfer-Zellen hochreguliert Foxp3 und sich verpflichtet, die Treg-Programm nach der Stimulation mit IL-2 und TGF-β 14,15. Es kann mäßige bis erhebliche Plastizität in CD4 + T-Zelllinien, vor allem, wenn man bedenkt, nur Zytokin-Produktion (in 17,18 prüft). Jedoch für die Zwecke der in vitro Differenzierungsprotokollen, werden wir uns mit jeder Untermenge als einmalige Linie.
Vor kurzem wurde eine Teilmenge von Th17 Zellen, die den IL-17-Zytokin produziert als einmalige Linie mit proinflammatorischen Funktionen, die während Autoimmunentzündung 19-21 besonders pathogene identifizierten. Th17-Zellen exprimieren eine einzigartige Transkriptionsfaktor, genannt Retinoid bezogenen Orphan-Rezeptor gamma t (RORγt), die die Th17 genetische Programm 22 koordiniert. TGF & bgr; ist durch die Induktion RORγt wichtig für die Erzeugung von Th17 Linie. Allerdings ist die Wirkung von TGF & beta Signalisierungs Vermutlich nur veran Th17 Verpflichtung auf synergizing mit IL-6 (in 12 überprüft). Weitere Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen Signalen, die positiv regulieren Th17 Vereinbarung, einschließlich IL-1β, erhöhte Natrium und TLR 23-26. Andere Berichte haben vorgeschlagen, daß die pathogenen Th17 Zellen in vivo sind diejenigen, die tatsächlich zu umgehen TGFß Signalisierung und sich stattdessen auf eine Kombination von IL-1, IL-6 und IL-23 für ihre Differenzierung 27 verlassen. Somit kann Th17 Zellen aus einer Vielzahl von Signalwegen abgeleitet werden; für die Zwecke dieses Protokolls, die gemeinsam verwendete (TGFß und IL-6) Weg für Th17 Linienfestlegungvorgestellt.
Die im folgenden für alle Effektor Linien beschriebenen Differenzierungsprotokollen beruht auf fixierten Antikörper als Stimuli für die TCR und CD28 über den gesamten Verlauf des Experiments. Allerdings haben andere gezeigt, dass TCR-Aktivierung mit Antigen-präsentierenden Zellen 28 oder vernetzendem Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper mit Hamster-Antikörper für 2 Tage 29 sind auch sehr wirksames Mittel zur Induktion der Erzeugung von verschiedenen Th Teilmengen. Die hier vorgestellte Protokoll baut auf die zuvor berichtete Verfahren zur Isolierung von murinen CD4 + T-Zellen von sekundären lymphatischen Organe 30 und erzeugen Th17 Zellen 31. Ein wichtiger Unterschied ist, dass dieses Protokoll beruht auf der Verwendung eines Zellsortierers, naive CD4 + T-Zellen aus lymphoiden Geweben zu isolieren. Viele Firmen bieten inzwischen schnelle Trennung Kits, die für naive CD4 + T-Zellen anreichern können, die vielleicht die Voraussetzungen f umgehen sein könnenoder Sortier je nach Experiment. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll vorgestellt werden sind, was wir routinemäßig und zu finden, um die effektivste. Aber bedenken Sie, dass alternative Reagenzien und Methoden für viele der Schritte im folgenden dargestellt existieren und es ist bis zu den einzelnen Labor, um festzustellen, was am besten für ihre Zwecke zu arbeiten.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren werden durchgeführt unter Verwendung von Protokollen vom Büro des Environmental Health and Safety an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft genehmigt. C57BL / 6-Mäuse (von NCI gekauft) für dieses Protokoll wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht sind, und alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigten an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft.
1. Vorbereitung der Instrumente, Zubehör und Reagenzien
- Mantel mit 48 Vertiefungen oder 24-Well-Platten mit anti-CD3 und anti-CD28 (Tabelle 1) in sterilem PBS, abdecken und wickeln Sie sie in Parafilm, um Verdunstung und Kontamination zu vermeiden, und dann inkubiert O / N bei 4 o C Vortag T Zellisolierung. Alternativ Mantel Brunnen 1 h bei 37 ° C. Führen Th0, Th1, Th2 und iTreg Bedingungen durch die Beschichtung sowohl anti-CD3 und anti-CD28 bei 1 ug / ml in 0,5 bis 1 ml bistal Volumen (48-Well-Platte). Für Th17 wir typischerweise Mantel anti-CD3 bei 2 ug / ml und Anti-CD28, auf 1 ug / ml.
HINWEIS: Wir haben festgestellt, daß eine niedrigere Anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th1, Th2 und iTreg Generation während eine höhere anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th17 Generation. So sollte anti-CD3 und anti-CD28-Konzentrationen titriert und für einzelne Laboratorien (Tabelle 2) optimiert werden. - Sterilisieren Sie eine Reihe von Dissektionswerkzeuge (Schere und Pinzette) von Autoklaven oder Desinfektionslösung. Ein Rohr oder kleinen Becherglas mit 70% Ethanol wird für die schnelle Sterilisation von Instrumenten zwischen Dissektionen benötigt. Schließlich wird eine Sprayflasche, die 70% Ethanol zum Sterilisieren der Oberfläche der Maus vor Dissektion erforderlich.
- Bereiten Sie eine Dissektion Oberfläche, indem ein flaches Stück Styropor oder Pinnwand mit Aluminiumfolie. Zergliedern Stifte oder Nadeln verwendet werden, um das Tier zu fixieren.
- Bereiten die Gerichte oder Platten für die Sammlung von tiHEMEN. Wenn die Bündelung Geweben, separate 60mm Gerichte 3 ml mit steriler PBS + 1% FBS (PBS +) für Milz und Lymphknotengewebe ausreichend ist. Wenn halten Gewebe von einzelnen Mäusen zu trennen, bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1 ml PBS + in die gewünschte Anzahl von Brunnen.
- Bereiten vollständigen RPMI-Medium für die Zellkultur und Vorwärmen vor der Anwendung (Tabelle 1).
HINWEIS: Es wird routinemäßig RPMI aber auch andere Medien wie IMDM und DMEM ebenso effektiv oder überlegen je Labor und Experiment. - Cut 2x2 cm große Quadrate von Nylon Netz mit einem 120 & mgr; m Porengröße und Autoklaven zu sterilisieren (Tabelle 1).
- Optional: Wenn mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem wie autoMACS für CD4 + Zellanreicherung, vorge fließend warmem und Spülen Puffer in einem 37 ° C Wasserbad, um Schäden an der Maschine zu vermeiden.
- HINWEIS: Die Anreicherung wird empfohlen, die Sortierausbeute erhöhen und Sortierzeit.
- AlleHerstellungsschritte, mit Ausnahme für die Präparation sollte in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden.
2. Isolierung von Lymphknoten und Milz von Mäusen
- Euthanize die erforderliche Anzahl von Tieren mit einem institutionell anerkannte Technik. Verwenden weibliche C57BL / 6 Mäuse im Alter von 5-10 WKS aufgrund ihrer hohen Prozentsatz von naiven T-Zellen und den Körperfettanteil im Vergleich zu Männern oder älteren Mäusen.
Hinweis: Zellen von männlichen Mäusen werden in ähnlicher Weise in vitro durchzuführen, und die Protokollschritte bleiben dieselben. Weibliche Mäuse, 5-10 Wochen alt, werden in der Regel ergeben 3-6 x 10 6 naiven CD4 + T-Zellen pro Maus. Jedoch kann unter Verwendung verschiedener Mäusestämme Ausbeute und Leistung beeinflussen. Beispielsweise können Zellen aus C57BL / 6-Mäuse sind besser zur Erzeugung von Th1-Zellen, während Zellen von Mäusen Balb.c besser zur Erzeugung von Th2-Zellen. - Verbreiten Sie die Gliedmaßen des Tieres und hänge sie an Ort und Stelle, wie in Abbildung 1 dargestellt. Schneiden Sie die Haut langitudinally von den Anus bis zum Kinn, während man aufpassen, nicht zu tieferen Gewebepunktion.
- Verbreiten Sie öffnen Sie die Haut mit einer Pinzette und stecken Sie die Haut an Ort und Stelle, um einen einfachen Zugang zu den Lymphknoten zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Ernten Sie die zugänglichen Lymphknoten aus den in Abbildung 1 gezeigten Stellen. Wir packen die Lymphknoten mit einer Pinzette, während Trenngewebe mit einer anderen Pinzette wird für die einfache Entfernung ermöglichen. Legen Sie das Gewebe in der Auffangschale.
- Ernten der Milz aus der in Figur 1 gezeigten Position. In diesem Fall wird vorsichtig Schneid ins Peritoneum benötigt, um Zugang zu der Milz erhalten. Legen Sie das Gewebe in einer Sammlung Gericht.
- Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Gewebe geerntet werden. Ansonsten mit den nächsten Schritten fortfahren. An dieser Stelle führen Sie alle weiteren Schritte auf Eis, bis die Beschichtung der T-Zellen nach dem Sortieren.
3. Gewebeverarbeitung und CD4 + Enrichment
- Verarbeiten Sie die Lymphknoten und Milz in verschiedenen Gerichten, die Ausbeute als Lymphknotenzellpräparate nicht Erythrozytenlyse erfordern, die zu leichten Leukozyten Tod erhöhen. Daher sind die folgenden Schritte beschreiben ein Verfahren zur Verarbeitung von Milz und Lymphknoten-Populationen getrennt durch Kombination vor der Markierung für die Sortierung folgt.
- Entfernen Sie das Gewebe (Milz oder Lymphknoten gebündelt) von der Auffangschale und in einen neuen 60-mm-Schale mit 3 ml PBS +. Legen Sie ein Quadrat von sterilen Nylon Netz über das Gewebe mit sterilisierten Pinzette.
- Mit der Daumenseite eines Spritzenkolbens (3-10 ml) und sanft zerschlagen das Gewebe gegen die mesh. Nahezu das gesamte Gewebe sollte in Suspension gehen. Sie können auch den Gewebe zwischen zwei autoklaviertem mattierte Folien und geschliffen in Suspension.
- Pipettieren Sie die Aussetzung nach oben und unten ein paar Mal zum Aufbrechen der verbleibende lösliche Klumpen. Legen Sie ein neues quadratisches Stück Nylon-Mesh über die Öffnung ein15 ml konischen Röhrchen und Filtern der Suspension durch, um den verbleibenden Schmutz zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für zusätzliche Lymphknoten und Milz-Gewebe.
- Nachdem die Suspension in eine 15ml Tube gefiltert füllen den Rest des Schlauchs mit PBS + und schwenken. Zentrifugiere die Zellen bei 475 g für 5 min bei 4 ° C.
- Für die Milzzellen, saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und Zellpellet in 1 ml eiskaltem 1X ACK-Lösung pro Milz für 1 Minute, um Erythrozyten zu lysieren. Dann gibt man 10 ml PBS + auf der Oberseite des ACK, das Röhrchen und zentrifugieren 475 xg für 5 min bei 4 ° C
- Für Lymphknotenzellen, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml PBS +. Falls gewünscht können diese mit den Milzzellen nach ihrem ACK Lyse und Waschschritt kombiniert werden.
- Saugt den Überstand nach Zentrifugation der Splenozyten und resuspendieren in weiteren 10 ml PBS +. An dieser Stelle kann der Lymphknoten Suspension einauf der Oberseite der Milz Suspension dded wenn zur Sortierung Gewebe Bündelung erforderlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C
- Das Zellpellet kann jetzt CD4 Anreicherung hergestellt werden. Wenn dieser Schritt nicht ausgeführt wird, zu den Sortiervorbereitungsschritte ablaufen.
- Für CD4 Bereicherung mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem, resuspendieren Zellpellet mit CD4-Perlen. Typischerweise 15 & mgr; l Perlen in 85 ul PBS + verdünnt wird verwendet, um das Gewebe zwischen 1 Maus kennzeichnen. Rampe auf das Volumen der Perlen-Mischung nach Bedarf, das Pellet, und Inkubieren für 15-30 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS +, vorbei an der Suspension durch Nylon in eine neue 15-ml-Tube, um Schmutz und Zentrifuge wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C zu entfernen
- Das Pellet in 100 ul PBS + pro Maus und fahren Sie mit positiven Selektion auf der Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem. Wenn Sie eine manuelle Trennsystem, follow die Anweisungen des Herstellers für die Anreicherung. Alternativ Resuspendieren der Proben in FACS-Puffer: PBS mit 1 mM EDTA (pH = 8) und 1% BSA, sterilfiltriert.
- Entfernen Sie die positive Fraktion und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS +. Das angereicherte CD4 + Bruchteil ist nun bereit für die Sortierung gekennzeichnet werden.
4. Sortier Naive CD4 + T-Zellen
- Beschriften Sie die Zellpellets mit PBS + mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD62L, CD44, CD25 und CD4 gerichtet. Bei Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Antikörper werden Verdünnungen für jeden zur Verfügung gestellt. Zur Färbung wird ein Volumen von 100 ul der Antikörpercocktail pro Geweben von einer Maus.
- Das Pellet in Antikörper-Cocktail und Inkubation für 15 bis 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
- Die Zellen werden mit 10 ml PBS + und Zentrifuge 475 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Übergeben Sie die Mischung über eine andere Nylonfilter oder Zellsieb Kappe neubewegen alle übrig gebliebenen Trümmer. Pipettieren markierten Zellen in eine Röhre, die für den Zellsortierer kompatibel ist. Halten Sie Zellen auf Eis und von der Licht bis die Art geschützt.
- Bereiten Sammelröhrchen durch Pipettieren 1-2ml kompletten RPMI Medium oder FBS in den Boden der Röhrchen zum Sammeln kompatibel auf einem Zellsortierer.
- Sortieren Sie die naiven CD4 + T-Zellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - Population (Abbildung 2). Waschen der gesammelten Zellen mit vollständigem RPMI-Medium und Zentrifugieren wie oben beschrieben.
- Das Pellet in komplettem RPMI, zählen die naive Zellen, und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml.
5. Einrichten des In-vitro-Differenzierung
- Absaugen Vertiefungen der anti-CD3 und anti-CD28-beschichteten Platten und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml sterilem PBS (ohne FBS). Für Platten mit 48 Vertiefungen, die Platte 0,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml RPMI. Für Platten mit 24 Vertiefungen, die Kultur 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 1,0 ml RPMI.
- Wenn die Prüfung des Einflusses eines Faktors, wie ein Arzneimittel hinzuzufügen der Substanz in die entsprechenden Vertiefungen entweder vor, während oder nach dem Differenzierungsprozeß je nach Experiment. Weiter, ergänzen die Kulturmedien mit entsprechend Zytokinen und blockierende Antikörper. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 und 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml löslich 37.51, und 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11.
HINWEIS: Die oben dargestellten Bedingungen als optimal für die Maximierung der Produktion von Zytokinen, wie am Ende des Differenzierungs Experiment (Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) gemessen werden. Allerdings sollte jede Bedingung für einzelne Laboratorien (Tabelle 2 optimiert werden - Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-5 vor der Analyse der Genexpression und Cytokinproduktion d. Alternativ zu entfernen, die Zellen aus den TCR Reize nach 2 d, 1 x 10 6 Zellen / ml mit frischem Medium angepasst, und die Platte in neue Vertiefungen (nicht beschichtet), um die Proliferation und die endgültige Ausbeute verbessern. In diesem Fall, werden frische polarisierenden Cytokine und Antikörper nicht benötigt aber 10 U / ml IL-2 soll auf die neuen Medien für Th0, Th1, Th2 und iTreg Kulturen hinzugefügt.
6. Analyse der Differenzierung
- Für Cytokin-Analyse durch Durchflusszytometrie restimulieren jede Vertiefung mit 10 ng / ml PMA und 1.000 ng / ml Ionomycin oder 1 & mgr; g / ml anti-CD3 für 4-6 Stunden in Gegenwart eines Golgi-Inhibitor, wie Brefeldin A (Tabelle1). Führen intrazellulärem Zytokinfärbung je nach Experiment (Figur 3).
Hinweis: Beize nicht linienspezifischen Zytokine oder Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise IL-4 (nicht gezeigt) und IFN & gamma; (3) für Th17 Kulturen, für jede Bedingung als Negativkontrolle und als Indikator für die Differenzierung Effizienz. Ferner kann Flecken Foxp3 für Th17 Kulturen als Kehr Entwicklung Treg unter Zusatz von TGFß auftreten. - Zur Proteinquantifizierung, sammeln die Überstände aus jeder Vertiefung und Assay von zytokinspezifischen ELISA (Figur 3). Wenn es Bedenken, dass der Faktor getestet wurde Proliferation beeinflußt, verglichen mit Kontrollproben, können die Zellen gewaschen, gezählt, normalisiert und dann mit 1 & mgr; g / ml Anti-CD3 für 24 h vor dem Sammeln Stände für ELISA-Assays restimuliert. Wenn Untersuchung IL-4 von Th2 Bedingungen, Waschen und Restimulation notwendig ist, um IL-4 zu entfernen, die l sein kanneftover von der ersten Differenzierung Kultur.
- Für die Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR, Ernte-Zellen nach der Inkubation, Waschen, zu normalisieren und wieder anzuregen für 2-6 h mit 1 ug / ml des anti-CD3 vor der Ernte mRNA (Abbildung 3).
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Representative Results
Der Zeitpunkt für die Analyse der Differenzierung in Abhängigkeit von der Th Zustand variieren und getestet, wie die Stärke der T-Zell-Rezeptor-Aktivierung. Nach 2-3 Tagen der Differenzierung, können die Zellen durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Ausmaß der T-Zellproliferation zu bestimmen. Wells umfassenden Proliferation und Verklumpung der Zellen, die wahrscheinlich für die Analyse am Tag 4. Differenzierung Bedingungen sich auf die Zugabe von exogenem IL-2, wie Th1 und Th2 ist, wird wahrscheinlich erschöpft die Medien nach 4 Tagen in Kultur. Cytokin-Produktion zu maximieren, können solche Vertiefungen mit erschöpften Medien mit frischem RPMI mit IL-2 ergänzt oder gezählt und auf 1 × 10 6 Zellen pro Vertiefung in frischem RPMI, IL-2, um die Unterscheidung für einen Tag oder zwei erstrecken Wieder plattiert mit dieser Methode.
Figure 1. Abbildung der Stiftanordnung, um eine Maus für die Isolierung von Milz und Lymphknoten zu beheben. (A) die Glieder auseinander und befestigen Sie sie mit einer sterilen Nadel oder Dissektion Stift. Von dieser Position aus, schneiden Sie das Fell und Haut in Längsrichtung vom Schwanz bis zum Kinn. (B) Nach dem Schneiden, Spreizen Sie die Haut auseinander, um die Lymphknoten wie in der Abbildung dargestellt aus. Die Orte der Lymphknoten, die leicht aus dieser Position zugänglich sind, werden in der Abbildung aufgeführt. Die Milz ist gerade unter dem Brustkorb auf der rechten Seite des Tieres entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Representative Sortierung Strategie zur Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen durch Zellsortierung. Ausgehend von dem oberen linken, Lymphozyten werden zuerst durch Größe gated und dann Singulett Zellen aus Dublett Zellen unterschieden. Gating auf Singuletts zeigt eine Population von CD4 + CD25 + Zellen, die nTregs sind. Gate an der CD4 + CD25 - Population und Art naiv (CD62L + CD44 -) aus dem Effektor / Memory (CD62L - CD44 +) CD4 + -Zellen. Gestrichelten Linien das Tor Ursprung der nächsten Handlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Beispieldaten nach in vitro Differenzierung Th. (A) Intraczellulären Zytokin-Färbung Daten von Th1, Th2, iTreg (auf CD4 + gated) und Th17 Differenzierung. Typischerweise nichtlinienspezifischen Zytokine, wie IL-4 und IFN & ggr; für Th17 Kulturen sollte angefärbt, um die Qualität der Differenzierung zu bestimmen. (B) ELISA-Daten folgenden 4 d Th Differenzierung, Waschen und 24 h Restimulation von Zellen mit 1 & mgr; g / ml anti-CD3. (C) in Echtzeit PCR-Daten von linienspezifischen Transkriptionsfaktoren folgenden 4d Differenzierung und Restimulierung für 4 h mit 1 & mgr; g / ml anti-CD3. Alle Gen Mengen wurden normalisiert, um die Expression von β-Aktin und mRNA aus undifferenzierten naiven T-Zellen als Grundlage für die Genexpression zu dienen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Tabelle 1. Siehe Tabelle unten Werkstoffe.
| Reagens | Empfohlene Titration Bereich |
| Zytokine: | |
| Menschliche (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antibodies: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5,000 ng / ml |
| 37.51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2,500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
Tabelle 2. Empfohlene Titration Bereich für die Optimierung der Differenzierung Bedingungen.
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Discussion
Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zugänglichen Außen Lymphknoten zu erlauben. Sobald Lymphknoten und Milz werden bearbeitet, ist der Zellsortierung die bevorzugten Verfahren zur Gewinnung eines hochgereinigten naiven CD4 + T-Zellpopulation. Reinheit ist entscheidend für nTregs oder Effektor-und Speicher-Th-Zellen aus den naiven Zelldifferenzierungsprozesses zu beeinflussen zu vermeiden. Schwierigkeiten bei der Erzielung einer hohen Ausbeute von naiven T-Zellen werden typischerweise durch ineffiziente Gewebesammlung und Verarbeitung bzw. Zellverlust während der Trennschritte verursacht. Zur Erhöhung der Ausbeute Make sure, um die Zellen zu verarbeiten mit kaltem Puffer und Inkubation auf Eis. Außerdem, um einen Verlust an Zellen während der Anreicherung und / oder Sortierung zu verhindern, die Optimierung der Reagenzien und der Trennung Protokolle sollten zuvor. Schließlich wird, wie an verschiedenen Stellen in der Protokollschritte erwähnt, Differenzierungsbedingungen sollten für die einzelnen Laboratorien bevor Großversuche (Tabelle 2) optimiert werden.
Populationen - wie in Abbildung 2 gezeigt, kann naiven CD4 + T-Zellen leicht von der nTreg (CD4 + CD25 +) und Effektorzellen (CD4 + CD44 + CD62L) unterschieden werden. Sortieranlage ist einer der sichersten Wege, um Kontamination von Th-Teilmengen zu verhindern, die auch in der Milz und den Lymphknoten vorhanden sind. Treg Kontamination während der Differenzierung in der Unterdrückung der Aktivierung und Zytokin-Produktion führen. Die Kontamination von anderen Th-Untergruppen kann dazu führen,die Produktion von Cytokinen, die hemmend auf die Entwicklung der gewünschten Th Linien sind. Sortieranlage Gebühren können teuer sein und einige finden, dass es leichter ist, für CD4 + T-Zellen durch magnetische Trennung bereichern sich auf Sortierzeit, wie in diesem Protokoll beschrieben zu reduzieren. In Ermangelung eines Sortierers, einige Firmen bieten inzwischen Trennung Kits speziell für die Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen entwickelt. Jedoch sollte die Reinheit der Bevölkerung immer nach der Trennung, ähnlich zu sortier Proben festgestellt werden. Die Feststellung einer niedrigen Frequenz von naiven CD4 + T-Zellen (CD62L +) im Vergleich zu dem Speicher / Effektor-Zellen (CD44 -), kann ein Problem mit der Maus, zeigen wie eine Infektion oder einen Tumor. In diesem Fall sollten die Zellen nicht für diese Art von Test verwendet werden.
Es gibt durchaus ein paar Möglichkeiten, um die Wirksamkeit der Th Differenzierung zu bestimmen. Proteinanalyse wird traditionell von Zytokin-Färbung durchgeführttion, die eine Vorstellung von dem Prozentsatz von naiven Zellen, die eine bestimmte Abstammungslinie polarisiert wurden geben wird (Abbildung 3). Proteinquantifizierung durch ELISA ist auch ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung der Gesamtmenge von Zytokinen in das Medium freigesetzt. Der Nachteil mit ELISA Proteinanalyse ist aber, dass den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Versuchsgruppen schwierig sein kann, wenn ein bestimmter Faktor getestet hat einen Einfluss auf die Proliferation und das Überleben. In diesem Fall kann die Gesamtzahl von Zellen, die Zytokine zwischen den Gruppen am Ende des Experiments. Somit Normalisierung der Zellenzahl und Restimulation für eine kurze Zeitdauer (beispielsweise anti-CD3 für 24 h) erforderlich, um geeignete Ergebnisse zu erzielen. Ferner ist IL-4 als ein Polarisationsfaktor zur Erzeugung des Th2 Teilmenge verwendet, so dass diese Zellen müssen gewaschen werden, normiert und restimuliert vor der Durchführung eines ELISA für IL-4. Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR ist nicht nur foder die Analyse der Cytokin-Gentranskription, sondern auch für linienspezifischen Transkriptionsfaktoren (Abbildung 3). So können je nach dem Experiment gibt es verschiedene Möglichkeiten, um die Wirksamkeit der Th Differenzierungstest.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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