Introduction
O conceito de linhagens distintas ou subconjuntos de CD4 + T helper (Th) tem sido em torno desde a última parte do século 20 1. O reconhecimento de antigénio correspondente na presença de sinais co-estimuladores resultados em diversas fases da proliferação celular e da eventual diferenciação em células Th efectoras. O tipo de célula Th gerada durante este processo é dependente do ambiente citoquina presente durante a activação 2. Inicialmente, as células Th simples foram pensados para polarizar em duas linhagens distintas seguintes receptor de células T (TCR) de activação, ligação co-estimulador CD28, e sinalização de citocina. Tipo 1 células auxiliares (Th1) são caracterizadas pela sua produção efectora da citoquina IFN-y, bem como a sua exigência de sinalização de IL-12 durante o processo de diferenciação 3,4. Finalmente, foi descoberto que as células Th1 diferenciadas têm um perfil genético que é distintamente mais caracterizada by a expressão do factor de transcrição da família T box, Tbx21 (T-bet), o qual é considerado o principal regulador do programa genético Th1 5. Além disso, a IL-12, bem como de IFN-y pode promover a expressão de T-bet 6,7. Na resposta imune, as células Th1 são importantes para a defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares, bem como promotores fortes de inflamação auto-imune. Em contraste, as células auxiliares do tipo 2 (Th2) IL-4 requerem para o seu desenvolvimento e suas citocinas efectoras, incluindo IL-4, IL-5 e IL-13, são importantes para dirigir as respostas das células B e são patogénicas em alergia 8, 9. Semelhante a células Th1, Th2 foram encontrados para expressar seu próprio regulador mestre da transcrição, denominada GATA-3 10,11. Interessantemente, a presença de citocinas polarizadoras e a geração de uma linhagem Th são antagonistas específicos para o desenvolvimento de outros 2,12, sugerindo que apenas um subconjunto Th particular pode tornar-se dominante durante uma re imunerespos-.
Desde a identificação das linhagens Th1 e Th2, a continuação dos trabalhos demonstrou ainda mais exclusivos subconjuntos de células T auxiliares, incluindo folicular auxiliar (TFH), IL-9, produzindo-(Th9), e IL-22 produtoras (Th22) (recentemente revisto em 13). Para efeitos de experiências in vitro de diferenciação, este protocolo vai se concentrar apenas em dois subconjuntos Th adicionais, chamadas de células T reguladoras (Tregs) e IL-17 produzindo células-T CD4 + (Th17). CD25 + células T reguladoras pode ocorrer naturalmente (nTreg) no timo; células Th simples pode também ser induzida (iTreg) para se tornar reguladora na periferia (revisto em 14,15). Ambos os tipos de Tregs expressar um factor de transcrição característica, denominado forkhead caixa P3 (Foxp3), o qual é crítico para as suas mecanismos efectores que incluem supressão de produção solúvel anti-inflamatória mediador, IL-2 consumo, e os mecanismos de células dependentes de contacto 14,15. A falta de Foxp3 resultados de expressão em um multi-órgãos distúrbio grave, auto-imune denominado alteração no sistema imunológico, poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome do X-linked (IPEX), demonstrando o papel fundamental deste subconjunto Th na resolução de inflamação e regulação tolerância periférica à auto antígenos 16. In vitro, as células T helper CD4 + naive-regulam Foxp3 e tornar-se comprometida com o programa Treg após estimulação com IL-2 e TGF-β 14,15. Não pode ser moderada a plasticidade considerável em linhagens de células CD4 + T, especialmente quando se considera apenas a produção de citocinas (revisto em 17,18). No entanto, para efeitos de protocolos de diferenciação in vitro, vamos discutir cada subconjunto como uma linhagem única.
Recentemente, um subconjunto de células Th17, que produz a citocina IL-17 foi identificada como uma linhagem original com funções pró-inflamatórias que são particularmente patogénico durante a inflamação autoimune 19-21. Células Th17 expressar um fator de transcrição original, denominado dependente do retinóide gamma receptor órfão t (RORγt), que coordena o programa genético Th17 22. TGFp é importante para a geração de Th17 linhagem através da indução de RORγt. No entanto, se acredita que o efeito de sinalização de TGF-p para induzir apenas Th17 compromisso sobre sinergia com IL-6 (revisto em 12). Outros estudos têm mostrado que uma variedade de outros sinais que podem regular positivamente Th17 compromisso, incluindo IL-1β, o aumento de sódio, e de sinalização de TLR 23-26. Outros relatos sugeriram que as células Th17 patogénicos in vivo são os que realmente desviam a sinalização TGF-p e em vez disso dependem de uma combinação de IL-1, IL-6, e IL-23 para a diferenciação 27. Assim, as células Th17 pode ser derivado de uma variedade de vias de sinalização; para efeitos do presente protocolo, o comumente usado (TGF e IL-6) via para Th17 compromisso linhagemirá ser apresentada.
Os protocolos de diferenciação descritos abaixo para todas as linhagens efectoras depende de anticorpo fixa como estímulos para o TCR e CD28 ao longo de todo o decurso da experiência. No entanto, outros autores demonstraram que a activação de TCR com células apresentadoras de antigénio ou 28 anti-CD3 e anti-CD28 com anticorpo de hamster de ligação cruzada durante 2 dias 29 também são meios altamente eficazes de induzir a produção de vários subconjuntos Th. O protocolo aqui apresentado baseia-se em métodos reportados anteriormente para isolar as células CD4 + T murino de órgãos linfóides secundários 30 e geração de células Th17 31. Uma diferença importante é que este protocolo baseia-se na utilização de um separador de células para isolar as células T CD4 + naive a partir de tecidos linfóides. No entanto, muitas empresas já oferecem kits de separação rápidas que podem enriquecer as células T CD4 + naïve, que pode ser capaz de contornar a exigência de fou classificação, dependendo da experiência. Os métodos e reagentes apresentados neste protocolo são o que nós rotineiramente usar e encontrar para ser o mais eficaz. No entanto, tenha em mente que existem reagentes alternativos e metodologias para muitos dos passos apresentados a seguir e cabe ao laboratório indivíduo para determinar o que funcionará melhor para seus propósitos.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais são realizados usando protocolos aprovados pelo escritório de Saúde e Segurança Ambiental da Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência. Murganhos C57BL / 6 (adquirido a partir de NCI) utilizado para este protocolo foram alojados sob condições isentas de patogénios específicos, e todas as experiências com animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) no Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Science.
1. Preparação de Instrumentos, suprimentos e Reagentes
- O revestimento de 48 poços ou de 24 poços, placas com anti-CD3 e anti-CD28 (Tabela 1) em PBS estéril, a tampa eo envoltório em parafilme para evitar a evaporação e contaminação, e então incubar O / N a 4 ° C no dia anterior t o isolamento das células. Alternativamente, poços casaco 1 h a 37 o C. Realizar condições Th0, Th1, Th2, e iTreg por revestimento, tanto com anti-CD3 e anti-CD28 em 1 ug / ml em 0,5-1 ml devolume de tal (de 48 poços). Para Th17, que tipicamente revestimento anti-CD3 a 2 ug / ml e anti-CD28 a 1 ug / ml.
NOTA: Verificou-se que uma baixa concentração de anti-CD3 é óptima para a produção de Th1, Th2, e iTreg enquanto uma concentração mais elevada de anti-CD3 é óptima para a produção de Th17. Assim, anti-CD3 e anti-CD28 concentrações devem ser tituladas e optimizado para laboratórios individuais (Tabela 2). - Esterilizar um conjunto de ferramentas de dissecação (tesouras e fórceps) por solução de autoclave ou desinfetante. Um tubo ou pequeno copo contendo 70% de etanol serão necessários para a esterilização rápida de ferramentas entre dissecções. Finalmente, uma garrafa de pulverização contendo 70% de etanol será necessário para esterilizar a superfície do rato antes da dissecação.
- Prepare uma superfície de dissecção envolvendo uma peça plana de isopor ou cortiça em papel alumínio. Alfinetes ou agulhas de dissecação são usados para fixar o animal no lugar.
- Prepare pratos ou placas para a recolha de tissues. Se tecidos de pooling, 60 milímetros pratos separados contendo 3 ml de PBS estéril + 1% FBS (PBS +) para os tecidos do baço e nódulos linfáticos é suficiente. Se mantendo tecidos de ratinhos individuais separados, preparar uma 1ml placa de 24 poços contendo de PBS + no número desejado de poços.
- Prepare meio RPMI completo para cultura de células e pré-quente antes do uso (Tabela 1).
NOTA: Nós usam rotineiramente RPMI mas outras mídias, como IMDM e DMEM podem ser igualmente eficazes ou superiores, dependendo do laboratório e da experiência. - Cut 2x2 cm quadrados de malha de nylon com um tamanho de poro e autoclave para esterilizar 120 mm (Tabela 1).
- Opcional: se estiver usando a célula magnética de alta velocidade sistema de triagem, como autoMACS para o enriquecimento de células CD4 +, a corrida pré-quente e lavagem buffers em um 37 o banho de água C para evitar danos à máquina.
- NOTA: O enriquecimento é recomendado para aumentar o rendimento de triagem e diminuir o tempo de classificação.
- Tudoetapas de preparação, excepto para dissecção, deve ser realizada num capuz de cultura de tecido estéril.
2. Isolamento de linfonodos e baço de ratinhos
- Eutanásia o número necessário de animais utilizando uma técnica institucional-aprovado. Use camundongos C57BL / 6 do sexo feminino, com idade de 5-10 semanas, devido à sua alta porcentagem de células T naive e gordura corporal mais baixo em comparação com os homens ou para ratos mais velhos.
NOTA: As células derivadas de ratinhos macho irá executar de forma semelhante in vitro, e as etapas do protocolo permanecer o mesmo. Camundongos fêmeas, 5-10 semanas de idade, normalmente vai render 3-6 x 10 6 células T CD4 + naive por mouse. No entanto, usando diferentes cepas de camundongos pode afetar o rendimento e performance. Por exemplo, as células de ratinhos C57BL / 6 são melhores para a geração de células Th1, enquanto as células de ratinhos Balb.c são melhores para a geração de células Th2. - Espalhar dos membros do animal e fixá-los no lugar, como mostrado na Figura 1. Cortar a pele longoitudinally do ânus para o queixo, tendo o cuidado para não perfurar tecidos mais profundos.
- Espalhe abrir a pele com pinças e prender a pele, em lugar de permitir um acesso fácil para os gânglios linfáticos, como mostrado na Figura 1.
- Colher os gânglios linfáticos acessíveis a partir dos locais mostrados na Figura 1. Agarrando o nó de linfa com um par de pinças, enquanto que separa o tecido com um outro par de pinças irá permitir a remoção fácil. Colocar o tecido no prato de recolha.
- Colheita do baço a partir do local mostrado na Figura 1. Neste caso, o corte cuidadoso no peritoneu é necessário para ter acesso ao baço. Colocar o tecido em um prato de recolha.
- Repita o procedimento se mais tecidos serão colhidos. Caso contrário, prossiga para as próximas etapas. Neste ponto, realizar todas as etapas restantes no gelo até o revestimento das células T, após separação.
3. Tissue Processamento e CD4 + Enriquecimento
- Processar os nódulos linfáticos e no baço em pratos diferentes para aumentar o rendimento como preparações de células de linfonodos não necessitam de lise de eritrócitos, o que pode resultar em morte de leucócitos menor. Portanto, as etapas a seguir descrevem um método para processar as populações de baço e nódulos linfáticos seguidos separadamente pela combinação prévia com a rotulagem de classificação.
- Remover o tecido (baço ou nódulos linfáticos reunidas) do prato de recolha e em lugar de um novo prato de 60 milímetros, contendo 3 ml de PBS +. Colocar um quadrado de nylon estéril malha sobre o tecido usando uma pinça esterilizada.
- Pegue o lado do polegar de um êmbolo da seringa (3-10 ml) e gentilmente esmagar o tecido contra a malha. Quase todo o tecido deve entrar em suspensão. Alternativamente, coloque o tecido entre duas lâminas de geadas autoclavada e moído em suspensão.
- Pipeta a suspensão para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os aglomerados solúveis restantes. Coloque um novo pedaço quadrado de malha de nylon sobre a abertura de umTubo de 15 ml e filtrar a suspensão através de remover os escombros restantes.
- Repita os passos 2-4 para linfonodo adicional e do tecido do baço.
- Assim que a suspensão foi filtrada para um tubo de 15 ml encher o restante do tubo com PBS + e inverter algumas vezes. Centrifuga-se as células a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C.
- Para as células de baço, aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de solução gelada 1X ACK por baço durante 1 min para lisar os eritrócitos. Em seguida, adicionar 10 ml de PBS + no topo do ACK, inverter o tubo, e centrifuga-se 475 xg durante 5 minutos a 4 o C.
- Para as células de nódulos linfáticos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de PBS +. Se desejado estes podem ser combinados com as células de baço após a sua lise ACK e o passo de lavagem.
- Aspirar o sobrenadante após centrifugação dos esplenócitos e ressuspender em mais 10 ml de PBS +. Neste ponto a suspensão nodo linfático pode ser umdded no topo da suspensão de tecido do baço que o agrupamento é necessária para a classificação. Centrifuga-se o tubo de novo a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C.
- O sedimento celular pode agora ser preparado para o enriquecimento de células CD4. Se essa etapa não será executada, prossiga para as etapas de preparação de classificação.
- Para o enriquecimento de CD4 utilizando o sistema de separação de células magnético de alta-velocidade, ressuspender o sedimento celular com pérolas de CD4. Normalmente 15 ul de contas diluídos em 85 mL de PBS + é usado para rotular os tecidos a partir de 1 mouse. Rampa até o volume de mistura de pérolas, conforme necessário, colocar o agregado, e incubar por 15-30 min a 4 o C.
- Lavam-se as células com 10 ml de PBS +, passar a suspensão através de nylon para um novo tubo de 15 ml para remover os detritos, e centrifuga-se novamente a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C.
- Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS + por ratinho e prossiga para a selecção positiva sobre o sistema de triagem celular magnético de alta-velocidade. Se estiver usando um sistema de separação manual, fRealize as instruções do fabricante para o enriquecimento. Alternativamente, ressuspender as amostras em tampão de SCAF: PBS com EDTA 1 mM (pH = 8) e BSA a 1%, esterilizado por filtração.
- Remover a fracção positiva e lavar novamente com 10 ml de PBS +. A fração enriquecida CD4 + está agora pronto para ser rotulados para a classificação.
4. células Seleção Naïve T CD4 +
- Rotular o aglomerado de células com PBS + anticorpos fluorescentes que contenham contra CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizar os anticorpos listados na Tabela 1, para cada diluições são fornecidos. Para a coloração, num volume de 100 ul do cocktail de anticorpo é utilizado por tecidos de um rato.
- Ressuspender o sedimento em cocktail de anticorpos e incubar durante 15-30 minutos a 4 ° C no escuro.
- Lavam-se as células com 10 ml de PBS + 475 xg e centrifugar durante 5 minutos a 4 o C.
- Passe a mistura sobre uma outra tampa do filtro de nylon ou filtro de células para redeslocar quaisquer detritos sobra. Pipetar as células marcadas dentro de um tubo que é compatível para o classificador de células. Mantenha as células no gelo e ao abrigo da luz até que o tipo.
- Prepare tubos de coleta por pipetagem 1-2 mL de meio completo RPMI ou FBS para o fundo de tubos compatíveis para a coleta em um classificador de células.
- Ordenar as células CD4 + T naive como CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - população (Figura 2). Lavam-se as células recolhidas com meio RPMI completo e centrifugação como descrito acima.
- Ressuspender o sedimento em RPMI completo, contagem das células ingênuo, e ajustar a concentração de 1 x 10 6 células / ml.
5. Configuração da Diferenciação in vitro
- Aspirar os poços das placas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 e lavar cada cavidade com 1 mL de PBS estéril (sem FBS). Para placas de 48 poços, 0,5 x placa 10 6 células / poço em 0,5 ml de RPMI. Para placas de 24 poços, de cultura de 1 x 10 6 células / poço em 1,0 ml de RPMI.
- Se a testar a influência de um factor, tal como uma droga adicionar a substância aos poços apropriados, quer antes, durante ou após o processo de diferenciação de acordo com a experiência. Em seguida, completar o meio de cultura com citocinas e anticorpos bloqueadores de acordo. Th0: 30 U / ml de hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, de 30 U / ml de hIL-2, e 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / mL 37,51 solúvel, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11.
NOTA: As condições apresentadas acima foram encontrados para ser óptima para maximizar a produção de citoquinas tal como medido no final da experiência diferenciação (secção de resultados representativos). No entanto, cada estado deve ser otimizado para laboratórios específicos (Tabela 2 - Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4-5 dias antes da análise da expressão do gene e a produção de citoquinas. Alternativamente, as células de remover os estímulos de TCR após 2 d, ajustada a 1 x 10 6 células / ml com meio fresco, e em novos poços de placa (não revestido) para aumentar a proliferação e rendimento final. Neste caso, citocinas polarizadoras frescos e anticorpos não são necessários, mas a 10 U / ml de IL-2 deve ser adicionado a novos meios para Th0, Th1, Th2, e culturas iTreg.
6. Análise de Diferenciação
- Para a análise por citometria de fluxo de citoquina, reestimular cada poço com 10 ng / ml de PMA e 1000 ng / ml de ionomicina ou 1 ug Tabela / ml de anti-CD3 durante 4-6 horas na presença de um inibidor de Golgi, tais como brefeldina A (1). Realização da coloração de citocinas intracelulares dependendo da experiência (Figura 3).
NOTA: Mancha citocinas ou factores de transcrição, tais como IL-4 (não mostrado) e de IFN-y não específicos da linhagem (figura 3) para culturas Th17, para cada condição como controlos negativos e como um indicador da eficiência da diferenciação. Além disso, Foxp3 mancha para culturas Th17 como o desenvolvimento recíproco de Tregs pode ocorrer com a adição de TGF-p. - Para a quantificação de proteínas, recolher os sobrenadantes de cada poço de ensaio e por citocina específica-ELISA (Figura 3). Se houver preocupação de que o factor a ser testado tem influenciado proliferação em comparação com amostras de controlo, as células podem ser lavadas, contadas, normalizados, e em seguida, novamente estimuladas com 1 ug / ml de anti-CD3 durante 24 horas antes de se recolher os sobrenadantes para os ensaios de ELISA. Se o ensaio de IL-4 de Th2 é necessário condições, lavagem e restimulating para remover a IL-4 que pode ser leftover diferenciação a partir da cultura inicial.
- Para a análise da expressão de genes por PCR em tempo real, as células de colheita após o período de incubação, lavagem, normalizar, e re-estimular durante 2-6 h com 1 ug / ml de anti-CD3 de ARNm antes da colheita (Figura 3).
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Representative Results
O ponto de tempo para a análise de diferenciação pode variar dependendo da condição a ser testado Th, bem como a força de activação do receptor de células T. Depois de 2-3 dias de diferenciação, as células podem ser visualizados por microscopia óptica para determinar a extensão da proliferação de células T. Wells expositoras extensa proliferação e aglomeração de células provavelmente estará pronto para análise no dia 4. condições de diferenciação contando com a adição de IL-2, tais como Th1 e Th2, provavelmente irá esgotar os meios de comunicação após 4 dias em cultura. Para maximizar a produção de citocinas, tais poços com meios esgotados podem ser reabastecidas com meio RPMI fresco contendo IL-2 ou contadas e re-semeadas a 1 x 10 6 culas por po em meio RPMI fresco contendo IL-2 para prolongar a diferenciação para um dia ou dois utilizando este método.
Figure 1. Ilustração de colocação de pinos para fixar um mouse para o isolamento do baço e linfonodos. (A) Espalhe as pernas afastadas e corrigi-los com uma agulha estéril ou pin dissecção. A partir desta posição, cortar o pêlo e pele longitudinalmente a partir da cauda para o queixo. (B) Depois de cortar, espalhar suavemente a pele com excepção para expor os gânglios linfáticos, como mostrado na imagem. As localizações dos gânglios linfáticos que são facilmente acessíveis a partir desta posição estão listados na imagem. O baço está localizado logo abaixo da caixa torácica no lado direito do animal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura estratégia de triagem 2. Representante para o isolamento de CD4 + naïve Células T por células de classificação. A partir do canto superior esquerdo, os linfócitos são primeiramente fechado por tamanho e, em seguida, as células singlet são discriminados a partir de células gibão. Gating em singuletos revela uma população de células T CD4 + CD25 + que são nTregs. Portão no CD4 + CD25 - população e, em seguida, tipo naïve (CD62L + CD44 -) a partir do efetor / memória (CD62L - CD44 +) células CD4 +. As linhas pontilhadas indicam a origem portão da próxima parcela. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os dados da amostra seguinte in vitro Th diferenciação. (A) Intracdados de coloração citocina ellular (fechado em CD4 +) de Th1, Th2, iTreg, e diferenciações Th17. Tipicamente, as citoquinas não específicos de linhagem, tais como IL-4 e IFN-y às culturas Th17, deve ser corada para determinar a qualidade da diferenciação. De dados (B) seguinte ELISA 4 d Th diferenciação, lavagem, e 24 h de re-estimulação com células dados de PCR anti-CD3. (C) em tempo real de 1 ug / ml de factores de transcrição específicos de linhagem seguintes 4 d diferenciação e re-estimulação, durante 4 h com 1 ug / mL de anti-CD3. Todas as quantidades de genes foram normalizados para a expressão de β-actina e mRNA a partir de células T naive indiferenciadas servir como linha de base para a expressão do gene. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Veja Materiais tabela abaixo.
| Reagente | Titulação faixa recomendada |
| As citocinas: | |
| Humana (h), IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / mL - 30 ng / mL |
| rmIL-6 | 5 ng / mL - 30 ng / mL |
| rmIL-12 | 10 ng / mL - 30 ng / mL |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / mL |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / mL - 30 ng / mL |
| Antibodies: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / mL - 5000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / mL - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5.000 - 10.000 ng / mL |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5.000 - 10.000 ng / mL |
Tabela 2. Recomendado Titulação Gama para a otimização das condições de diferenciação.
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Discussion
Enquanto o baço contém células Th simples, a proporção da população nos nódulos linfáticos é muito maior. Falha em identificar corretamente e remover os linfonodos neste protocolo irá resultar em um fraco rendimento de células naïve. Isto pode ser especialmente difícil nos ratos mais velhos ou ratinhos macho que têm mais tecido gordo. Como mostrado na Figura 1, a fixação adequada e de membros de pinagem animais e pele irá permitir a fácil visualização dos nódulos linfáticos exterior acessíveis. Uma vez que os gânglios linfáticos e baços são processados, classificação de células é o método preferido de obtenção de uma população altamente purificada ingénuo células T CD4 +. Pureza é fundamental para evitar nTregs ou efetoras e de memória células Th de influenciar o processo de diferenciação celular ingênuo. Dificuldades na obtenção de um alto rendimento de células T naive são normalmente causadas por coleta de tecido ineficiente e processamento ou perda de células durante as etapas de separação. Para aumentar a produção de make sure para processar as células utilizando tampões frias e as incubações sobre gelo. Além disso, para evitar a perda de células durante o enriquecimento e / ou classificação, optimizando os reagentes e protocolos de separação é previamente recomendadas. Finalmente, como mencionado em vários pontos as etapas do protocolo, as condições de diferenciação deve ser otimizado para laboratórios específicos antes de realizar experiências em grande escala (Tabela 2).
Como mostrado na Figura 2, as células T CD4 + naive pode ser facilmente distinguida da nTreg (CD4 + CD25 +) e efectoras (CD4 + CD44 + CD62L -) populações. A classificação é uma das maneiras mais confiáveis para evitar a contaminação dos efetoras Th subconjuntos, que também existem no baço e linfonodos. Treg contaminação durante a diferenciação pode resultar na supressão da activação, assim como a produção de citoquinas. Contaminação de outros efetoras Th subconjuntos podem resultar ema produção de citoquinas que são inibidoras do desenvolvimento de linhagens Th desejados. Classificando taxas de instalações pode ser caro e alguns acham que é mais fácil para enriquecimento em células CD4 + T por separação magnética para reduzir o tempo de classificação, conforme descrito neste protocolo. Na ausência de um classificador, algumas companhias oferecem agora kits de separação especificamente concebidos para o isolamento de células T CD4 + naive. No entanto, a pureza da população deveria ser sempre verificada após separação, semelhante às amostras ordenadas. O achado de uma baixa proporção de células CD4 + T naive (CD62L +) em comparação com as células de memória / efetoras (CD44 -) pode indicar um problema com o mouse, como uma infecção ou tumor. Neste caso, as células não devem ser utilizados para este tipo de experiência.
Existem algumas maneiras para determinar a eficácia da diferenciação Th. A análise das proteínas é tradicionalmente realizada através de citocinas manchação, que vai dar uma ideia da percentagem de células ingénuas que foram polarizados com uma linhagem específica (Figura 3). Quantificação de proteínas por ELISA também é uma ferramenta útil para determinar a quantidade total de citocinas ser liberado para a mídia. A limitação em análises ELISA da proteína, porém, é que a comparação de resultados entre os grupos experimentais pode ser difícil se um factor particular a ser testado tem uma influência sobre a proliferação e sobrevivência. Neste caso, os números totais de células produtoras de citocinas pode ser diferente entre os grupos no final da experiência. Assim, a normalização da contagem de células e restimulating por um curto período de tempo (por exemplo, anti-CD3 durante 24 h), é necessário obter resultados adequados. Além disso, a IL-4 é usado como um factor de polarização para a geração do subconjunto Th2, então as células devem ser lavados, normalizado, e re-estimuladas antes de se realizar um teste ELISA para a IL-4. Análise de expressão gênica por PCR em tempo real é útil não só fou a análise da transcrição de genes de citoquinas, mas também por factores de transcrição específico da linhagem (figura 3). Assim, dependendo da experiência, existem várias maneiras para ensaiar a eficácia de diferenciação Th.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório de Reynolds em Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência, e o laboratório Chen Dong da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, para a otimização do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por uma doação para JMR do National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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