Introduction
不同的谱系或CD4 + T辅助细胞亚群的概念（TH）细胞已自20 世纪1的后半部被周围。在的共刺激信号的结果存在关联抗原的几轮的细胞增殖和最终分化成效应Th细胞识别。在此过程中产生的Th细胞的类型取决于活化2中存在的细胞因子环境。最初，幼稚Th细胞被认为极化到下面的T细胞受体（TCR）的活化，共刺激CD28结扎，和细胞因子信号2个不同的谱系。 1型辅助细胞（Th1细胞）的特征在于它们的效应产生的IFNγ细胞因子以及它们的分化过程3,4中要求的IL-12信号传导。最终人们发现分化的Th1细胞具有遗传图谱是最鲜明特征BŸ的T盒家族转录因子的表达，TBX21（T-BET），这被认为是Th1细胞的遗传程序5的主调节器。此外，IL-12以及IFNγ可促进T-bet的表达6,7。在免疫应答，Th1细胞在针对细胞内病原体以及自身免疫性炎症的强启动子的宿主防御很重要。与此相反，2型辅助细胞（Th2细胞）要求的IL-4对它们的发展及其效应器细胞因子，包括IL-4，IL-5，和IL-13，是用于驱动B细胞反应的重要和致病在过敏8， 9。类似的Th1细胞，发现Th2细胞表达自己的主转录调节，称为GATA-3 10,11。有趣的是，偏振细胞因子的存在和特定的Th谱系的产生是对立对他人2,12的发展，表明只有一个特定的Th子集可以在免疫重新成为主导sponse。
由于Th1和Th2细胞谱系的鉴定，进一步的工作表明，甚至更独特的子集的辅助性T细胞，包括滤泡辅助（TFH），IL-9产生（TH9），和IL-22产生（TH22）（最近13检讨）。对于在体外分化实验的目的，该协议将只集中于两个附加Th亚群，被称为调节性T细胞（Treg）和IL-17的CD4 + T细胞（Th17细胞）。 CD25 +调节性T细胞可以在胸腺中自然发生（nTreg）;幼稚Th细胞也可以被诱导（iTreg）成为规中的周边（在14,15中综述）。这两种类型的调节性T细胞表达的特性的转录因子，称为叉头框P3（Foxp3的）这对于包括可溶性抗炎介体的生产，IL-2的消耗，以及细胞接触依赖性机制14,15其效应抑制机制的关键。 Foxp的缺乏在严重的，多器官的自身免疫紊乱3表达的结果称为免疫失调，多内分泌腺病，肠病，X连锁综合征（IPEX），这表明这钍子集在解决炎症和调节外周耐受自我的关键作用抗原16。在体外，天真的CD4 + T辅助细胞上调Foxp3的和刺激后成为致力于调节性T细胞的程序与IL-2和TGF-β14,15。有可能是适度的，以相当大的可塑性中的CD4 + T细胞谱系，只考虑细胞因子的产生（在17,18综述）时尤其如此。然而，对于在体外分化的协议的目的，我们将要讨论的每个子集作为一个独特的谱系。
最近，Th17细胞产生的IL-17的细胞因子的一个子集被确定为一个独特谱系与促炎性功能是特别致病过程中的自身免疫性炎症19-21。 Th17细胞表达一种独特的转录因子，被称为维甲酸相关孤儿受体γ吨（RORγt）的协调Th17细胞的遗传程序22。 TGFβ是Th17细胞谱系的产生重要通过RORγt的诱导。然而，TGFβ信号传导的效应被认为是只诱导时与IL-6（在12中综述）协同作用的Th17承诺。进一步的研究表明，各种其它信号，可以正调控的Th17承诺，包括IL-1β，增加的钠和TLR信号23-26。其它报告建议，致病Th17细胞在体内是那些实际上绕过TGFβ信号传导，而是依赖于IL-1，IL-6，和IL-23的其分化27的组合。因此，Th17细胞可衍生自各种信号通路;此协议的目的，常用（TGFβ和IL-6）途径Th17细胞谱系的承诺将提交。
下面描述的所有效应器谱系分化协议依靠固定抗体上进行刺激的T细胞受体和CD28整个实验的全过程。然而，其他人已经表明，TCR活化与抗原呈递细胞28或交联的抗CD3和与仓鼠抗体抗CD28抗体2天29顷也诱导各种Th亚群的产生的非常有效的手段。这里介绍的协议建立在用于从次级淋巴器官30分离鼠CD4 + T细胞，并产生Th17细胞31以前报道的方法。一个主要的区别是，此协议依赖于使用细胞分选仪的从淋巴组织分离幼稚CD4 + T细胞。然而，许多公司现在提供快速分离试剂盒，可以富集幼稚CD4 + T细胞，其可以是能够绕过要求˚F或排序取决于实验。的方法和在这个协议中提出的试剂是我们经常使用并且发现是最有效的。但是，请记住，替代试剂和方法很多下面介绍的步骤存在，它是由单独的实验室，以确定哪些工作最适合自己的目的。
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Protocol
所有的实验程序都采用经环境健康和安全的医学和科学的罗莎琳德·富兰克林大学办公室协议执行。用于该协议C57BL / 6小鼠（来自NCI购买）被安置无特定病原体的条件下，所有的动物实验，使用在医学罗莎琳德富兰克林大学批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的协议执行，并且科学。
1.准备仪器，耗材和试剂的
- 在无菌PBS，覆盖膜，封口膜中的大衣48孔或24孔板抗CD3和抗CD28（ 表1），以防止蒸发和污染，然后孵化O / N在4（C T）前一天细胞分离。另外，外套1井在37℃。1H通过在0.5-1毫升涂敷既抗CD3和抗CD28在1微克/ ml至执行的Th0，Th1细胞，Th2细胞，和iTreg条件TAL体积（48孔板）。对于Th17细胞时，我们通常涂层抗CD3在2微克/毫升和抗CD28在1微克/毫升。
注意：我们已发现，较低的抗CD3浓度是最适合的Th1，Th2细胞，和iTreg生成而较高的抗CD3浓度是最佳的Th17细胞产生。因此，抗CD3和抗CD28的浓度应该滴定和单个实验室（ 表2）进行了优化。 - 通过高压灭菌或消毒液消毒一套清扫工具（剪刀和镊子）。管或含70％乙醇的小烧杯中，将需要用于解剖的工具快速杀菌作用。最后，将需要解剖前灭菌鼠标的表面含有70％乙醇的喷射瓶。
- 通过包装一块平坦的泡沫塑料或软木板铝箔准备剥离面。解剖销或针用于固定到位的动物。
- 准备菜肴或板为TI的集合ssues。如果集中组织，独立60毫米菜含3毫升无菌PBS + 1％FBS（PBS +）的脾和淋巴结组织就足够了。如果从单个小鼠保持组织中分离出来，制备PBS +的含24孔板1毫升在井的所需数目。
- 在使用前制备的完全RPMI培养基进行细胞培养和预温热（ 表1）。
注意：我们经常使用的RPMI但其他媒体，例如IMDM和DMEM可以是同等有效的或优于根据实验室和实验。 - 切的2x2厘米尼龙的正方形网眼带120微米孔径和高压釜灭菌（ 表1）。
- 可选：如果使用高速磁细胞分选系统，如autoMACS对CD4 +细胞的富集，预暖运转和漂洗缓冲液在37℃的水浴，以防止损坏机器。
- 注：富集建议提高分拣产量和减少排序时间。
- 所有准备步骤，除了夹层，应当在无菌组织培养罩进行。
从小鼠2.隔离淋巴结和脾脏的
- 安乐死使用体制批准的技术动物的所需数量。使用C57BL / 6雌性小鼠，年龄5-10周，由于幼稚T细胞和下半身脂肪相比，男性比例高或年纪较大的老鼠。
注：从雄性小鼠衍生的细胞将在体外进行同样的协议步骤保持相同。雌性小鼠，5-10周龄，典型地将产生3-6×10 6个幼稚每只小鼠的CD4 + T细胞。然而，使用不同的小鼠品系可能会影响成品率和性能。例如，从C57BL / 6小鼠细胞产生Th1细胞而从Balb.c小鼠细胞是用于产生Th2细胞更好更好。 - 传播动物的四肢和如图1引脚他们的地方。切开皮肤长itudinally从肛门到下巴，注意不要穿刺深层组织。
- 蔓延开钳皮肤和PIN码的地方，以方便进入淋巴结皮肤， 如图1。
- 从图1中所示的位置收获的可访问的淋巴结。抓取的淋巴结有一对镊子的同时与另一对钳子的分离组织将允许容易地移除。放置在收集盘组织。
- 收获从图1所示位置的脾脏。在这种情况下，仔细切割进入腹膜是需要获得脾脏。将集合中菜的组织。
- 重复此过程，如果更多的组织会有所收获。否则，继续下一步骤。在这一点上，执行所有剩余的步骤在冰上，直到T细胞的分选后的电镀。
3，组织处理和CD4 +富集
- 处理淋巴结和脾脏在不同的菜，以增加产率，为淋巴结细胞制剂不需要红细胞裂解，这可能导致轻微白细胞死亡。因此，下面的步骤描述了用于处理脾和淋巴结群体分别随后进行排序之前结合到标签的方法。
- 删除收集的菜和地点组织（脾或合并淋巴结）中含有3毫升的PBS +的全新60毫米的菜。放置无菌尼龙的平方用无菌镊子啮合在组织。
- 以一个注射器活塞的拇指侧（3-10毫升），并轻轻地粉碎对网格组织。几乎所有的组织应该进入暂停。另外，将组织2蒸压磨砂载玻片之间研磨成混悬液。
- 吸取悬挂上下几次分手其余的可溶性团块。将新方片尼龙网超过一开幕的15毫升锥形管中，并通过过滤悬浮液，以除去剩余的碎屑。
- 额外的淋巴结和脾脏组织重复步骤2-4。
- 一旦悬浮液被过滤到15ml的管中填充用PBS +上的管的其余部分并倒转几次。离心细胞在475 XG 5分钟，在4℃
- 对于脾细胞，吸出上清液离心后，重悬在1ml的每脾冰冷1X ACK溶液将细胞沉淀1分钟以裂解红细胞。然后加入10毫升的PBS +对所述ACK的顶端，倒置的管，和离心机475×g离心5分钟，在4℃。
- 为淋巴结细胞，吸在PBS + 2毫升上清液和重悬。如果需要的话，这些可以与他们的ACK裂解和洗涤步骤后的脾细胞进行组合。
- 吸出的脾细胞离心，重悬在另外10毫升的PBS +后，上清。在这一点上的淋巴结悬浮可以是一个dded对脾胃停牌前是否需要进行分类组织池。再次离心管中，在475 XG为5分钟，在4℃。
- 将细胞沉淀，现在可以对CD4富集制备。如果此步骤将不会被执行，则继续执行分拣准备步骤。
- 对于使用高速磁性细胞分选系统的CD4富集，重悬与CD4珠的细胞团。通常为15微升珠子稀释在85微升PBS +的用于从1小鼠标记组织。根据需要坡道珠混合物的体积，悬浮颗粒，孵育15-30分钟，在4℃
- 用10毫升PBS +洗细胞，通过尼龙悬挂到一个新的15ml试管中以4℃再次清除杂物，并离心475 XG 5分钟
- 重悬在100μl每只小鼠PBS +的沉淀并进行正选择高速磁性细胞分选系统。如果使用的是手动分离系统中，follow制造商的说明富集。可替代地，重悬在FACS缓冲液中的样品：PBS中1mM的EDTA（pH值= 8）和1％BSA，无菌过滤。
- 取出阳性分数，并再次洗涤，用PBS + 10毫升。富集的CD4 +分数现在已经准备好被标记进行排序。
4.排序朴素CD4 + T细胞
- 标记的细胞沉淀用PBS +针对CD62L，CD44，CD25，和CD4含有荧光抗体。如果使用表1中所列的抗体，提供稀释的每个。用于染色的抗体混合物的100μl的体积是从1小鼠用于每个组织。
- 悬浮在抗体的鸡尾酒颗粒，并在黑暗中孵育15-30分钟，在4 摄氏度 。
- 与PBS + 10毫升和离心机475 XG为5分钟，在4 摄氏度洗细胞
- 在另一尼龙过滤器或电池滤网盖通过混合重移动任何剩余的碎片。吸取标记的细胞成管是用于细胞分选仪相兼容。保持细胞在冰上，并从光直到排序的保护。
- 通过取适量涂于脸部完全RPMI培养基或胎牛血清的吹打插入细胞分选仪管集合兼容的底准备收集管。
- 排序幼稚CD4 + T细胞的CD4 + CD25 - CD62L + CD44 -群（ 图2）。用完全RPMI培养基洗涤收集的细胞，并离心，如上所述。
- 重悬在完全RPMI粒料，计数的幼稚细胞中，并调节浓度至1×10 6个细胞/ ml。
5.设置在体外分化
- 吸出抗CD3和抗CD28包被的板的孔中，并用无菌PBS（无FBS）的1ml中井洗每个。对于48孔板，板0.5×10 6个细胞/孔在0.5的RP毫升MI。对于24孔板，培养1×10 6个细胞/孔在1.0的RPMI的溶液中。
- 如果任一之前，测试的一个因素的影响，例如药物加该物质到适当的孔中，或根据实验分化过程后。接着，补充培养基与细胞因子和阻断抗体相应。 TH0：30 U / ml的人IL-2。 TH1：15毫微克/毫升的小鼠白介素12，30 U / ml的人IL-2，和5000毫微克/毫升11B11.Th2：10毫微克/毫升的小鼠白介素4，30 U / ml的人IL-2，2000纳克/毫升的可溶性37.51，和5000纳克/毫升XMG1.2。 iTreg：15毫微克/毫升hTGFβ，30 U / ml的人IL-2，5000纳克/毫升XMG1.2和5000纳克/毫升11B11。 TH17：20毫微克/毫升小鼠白介素6，3毫微克/毫升hTGFβ，5000纳克/毫升XMG1.2和5000纳克/毫升11B11。
请注意：上述的条件被认为是最适合作为在分化实验（ 代表结果部分）的末端测量最大化细胞因子的产生。但是，各条件应该为各个实验室（ 表2被优化 - 孵育板在37℃下用5％CO 2的4-5之前的基因表达和细胞因子产生的分析ð。可替代地，取出从TCR刺激细胞后2天，调整为1×10 6个细胞/ ml用新鲜培养基，并在板新井（非涂布）来增强细胞增殖和最终产率。在这种情况下，是不需要的新鲜偏振细胞因子和抗体，但IL-2的10单位/毫升应添加到新媒体的Th0，Th1细胞，Th2细胞，和iTreg培养物。
分化6.分析
- 对于通过流式细胞术细胞因子分析，用10ng / mL的PMA和1000以及重新刺激每纳克/ ml的离子霉素或1微克的高尔基抑制剂的存在下，例如布雷菲德菌素A / ml的抗CD3 4-6小时（ 表1）。执行内细胞因子染色取决于实验（ 图3）。
注：色漆非谱系特异性细胞因子或转录因子，如IL-4（未示出）和IFNγ（ 图3），用于Th17细胞培养物，对每一个条件作为阴性对照，并作为分化效率的指标。此外，染色的Foxp3对于Th17细胞培养物作为调节性T细胞的倒数发展可与加成TGFβ的发生。 - 用于蛋白质定量，通过细胞因子特异性ELISA（ 图3）收集来自各孔测定上清液。如果有令人担忧的是被测试的因子已经影响增殖相比对照样品，所述细胞可洗涤，计数，归一化，然后用1μg/ ml的抗CD3的24小时再刺激收集上清用于ELISA分析之前。如果测定的IL-4从Th2细胞的条件下，清洗和再刺激必须除去的IL-4，其可以是升eftover从最初分化培养。
- 对于通过实时PCR的基因表达分析，收获细胞的潜伏期后，洗净，正常化，并为2-6ħ重新刺激用抗CD3的1微克/毫升之前，收获的mRNA（ 图3）。
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Representative Results
分化可以根据条件的Th变化的分析的时间点被测试，以及T细胞受体激活的强度。后分化2-3天，细胞可以通过光学显微镜进行可视化，以确定的T细胞增殖的程度。井呈现细胞的广泛的增殖和结块很可能将是准备用于分析在4天分化的条件依赖于外源性的IL-2，如Th1和Th2，将后在培养4天后可能用尽介质。为了最大限度地提高细胞因子产生，如井枯竭介质可被补充新的RPMI含有IL-2或计数并重新铺板以每孔1×10 6个细胞在新鲜的RPMI含IL-2延长分化为另一天或两个采用这种方法。
造型玩具Ë1.插图引脚放置固定鼠标的脾和淋巴结的隔离。（A）传播的四肢分开，解决这些问题用消毒针或夹层针。从这个位置，从尾到下巴切割毛发和皮肤的纵向。（B）的切割后，轻轻地散布在皮肤分开，以暴露淋巴结中所示的图像。淋巴结，他们很容易从该位置可访问的位置中列出的图片。脾位于刚下右侧动物的肋骨。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.代表排序的天真CD4的隔离策略+ T细胞通过细胞分选，从左上角开始，淋巴细胞首先通过大小选通，然后单细胞从双峰细胞识别。门上的汗衫揭示CD4 + CD25 +细胞是nTregs的群体。门上的CD4 + CD25 -人口然后再排序天真（CD62L + CD44 - ）从效应/内存（CD62L - CD44 +）CD4 +细胞。虚线表示接下来的情节的门出身。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.示例数据在体外分化的Th以下。（A）INTRACellular因子染色数据（门上的CD4 +）从TH1，TH2，iTreg，和Th17分化。通常情况下，非谱系特异性细胞因子，如IL-4和IFNγ对Th17细胞培养物时，应染色来确定分化的质量。（B）中的ELISA数据以下4天的Th分化，洗涤和细胞的24小时再刺激与以下4天分化和再刺激与1μg/ ml的抗CD3 4小时谱系特异性转录因子的1μg/ ml的抗CD3（℃）实时PCR数据。所有的基因数量均归β肌动蛋白和mRNA的表达未分化幼稚T细胞作为基线的基因表达。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1.见材料如下表。
| 试剂 | 推荐滴定范围 |
| 细胞因子： | |
| 人类（H）的IL-2 | 5 U /毫升 - 50 U / ml的 |
| 小鼠白介素4 | 5毫微克/毫升 - 30纳克/毫升 |
| 小鼠白介素6 | 5毫微克/毫升 - 30纳克/毫升 |
| 小鼠白介素12 | 10纳克/毫升 - 30纳克/毫升 |
| hTGFb（Th17细胞） | 0.1毫微克/毫升 - 5毫微克/毫升 |
| hTGFb（iTreg） | 5毫微克/毫升 - 30纳克/毫升 |
| 抗体： | |
| 2C11（抗CD3） | 500毫微克/毫升 - 5000纳克/毫升 |
| 37.51（抗CD28） | 250毫微克/毫升 - 2500纳克/毫升 |
| 11B11（抗IL-4） | 5000 - 10,000纳克/毫升 |
| XMG1.2（抗IFNG） | 5000 - 10,000纳克/毫升 |
表2.推荐滴定范围的分化条 件的优化。
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Discussion
而脾包含幼稚Th细胞，这部分人群在淋巴结的比例要高得多。未能正确识别和清除淋巴结此协议将导致幼稚细胞的一个贫穷的产量。这可以在具有更多的脂肪组织老年小鼠或雄性小鼠尤其困难。 如图动物四肢和皮肤的1，适当的固定和钉扎将允许访问的外部淋巴结容易可视化。一旦淋巴结和脾脏中进行处理，细胞分选是得到高度纯化的幼稚CD4 + T细胞群体的首选方法。纯度是至关重要的，以防止Th细胞nTregs或效应和记忆从影响幼稚细胞的分化过程。在获得高收率幼稚T细胞的困难，通常在分离的步骤所造成的低效率的组织收集和处理或细胞的损失。为了增加产量化妆sURE用冷缓冲液和孵化在冰上处理细胞。此外，为了防止细胞的损失富集和/或分选过程中，优化预先推荐的试剂和分离协议。最后，如提到的，在协议的步骤的不同点，分化的条件应为个别的实验室进行大规模的实验（ 表2）之前进行了优化。
种群-如在图2中 ，幼稚的CD4 + T细胞可以容易地从nTreg（CD4 + CD25 +）和效应（CD4 + CD44 + CD62L）不同。排序是最可靠的方法，以防止执行器的污染Th亚群，这也存在于脾脏和淋巴结之一。在分化过程中的Treg污染可导致活化的抑制以及细胞因子的产生。的其他效应污染Th亚群可能会导致细胞因子的产生是抑制到所需的Th细胞系的发展。分拣设施费很昂贵，有些发现它更容易通过磁分离富集CD4 + T细胞减少如本协议描述的分拣时间。在没有分拣机，有些公司现在提供的分离套件专为幼稚CD4 + T细胞的分离设计。然而，该群体的纯度应始终分离，类似于排序后的样本进行检查。幼稚的CD4 + T细胞（CD62L +）的低频率相比于记忆/效应细胞的发现（CD44 - ）可以指示用鼠标，存在的问题，如感染或肿瘤。在这种情况下，细胞不应该被用于这种类型的实验。
有相当多的方式来确定的Th分化的效力。传统上由细胞因子染色进行蛋白质分析ING，这将给的幼稚细胞已被极化，以一个特定谱系的百分比的想法（ 图3）。蛋白质定量通过ELISA也是一个有用的工具，以确定被释放到介质中的细胞因子的总量。用ELISA蛋白质分析，虽然需要说明的是，实验组之间比较的结果可能是困难的，如果被测试的特定因素对增殖和存活的影响。在这种情况下，总的数量的细胞产生的细胞因子可以是不同的基团之间在实验结束。因此，归一化的细胞计数和再刺激的时间很短的周期（ 例如 ，抗-CD3 24小时）是必要的，以获得适当的结果。此外，IL-4被用作Th2细胞的子集的产生的偏振系数，所以这些细胞必须洗净，归一化，在此之前进行的ELISA对IL-4再刺激。通过实时PCR基因表达分析，不仅f是有用的或细胞因子基因转录的分析，同时也为谱系特异性转录因子（ 图3）。因此，根据不同的实验中，有不同的方法来测定的Th分化的效力。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
笔者想在雷诺实验室的医学和科学的罗莎琳德·富兰克林大学的所有成员，并在得克萨斯大学MD安德森癌症中心大学的陈岽实验室感谢这个协议的优化。这项工作得到了一笔赠款，JMR来自美国国立卫生研究院（K22AI104941）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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