Introduction
Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell'antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l'eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull'ambiente citochina presente durante l'attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l'espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta.
Poiché l'identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l'infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico.
Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l'infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l'induzione di RORγt. Tuttavia, l'effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato.
I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l'intero corso dell'esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l'attivazione TCR con l'antigene cellule presentanti l'28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull'utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l'ordinamento seconda dell'esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall'ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l'Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Rosalind Franklin University of Medicine and Science.
1. Preparazione di strumenti, accessori e reagenti
- Coat 48 pozzetti o 24 pozzetti piastre con anti-CD3 e anti-CD28 (Tabella 1) in PBS sterile, coperchio e avvolgere in parafilm per evitare l'evaporazione e la contaminazione, e poi incubare O / N a 4 ° C il giorno prima T isolamento delle cellule. In alternativa, i pozzetti cappotto 1 ora a 37 ° C. Eseguire condizioni Th0, Th1, Th2, e iTreg rivestendo sia anti-CD3 e anti-CD28 a 1 ug / ml in 0,5-1 ml diVolume tal (piastra 48 pozzetti). Per Th17, di solito cappotto anti-CD3 a 2 mg / ml e anti-CD28 a 1 mg / ml.
NOTA: Abbiamo scoperto che una concentrazione di anti-CD3 inferiore è ottimale per la generazione Th1, Th2, e iTreg mentre una maggiore concentrazione anti-CD3 è ottimale per la generazione Th17. Così, anti-CD3 e anti-CD28 concentrazioni dovrebbero essere titolati e ottimizzati per i singoli laboratori (Tabella 2). - Sterilizzare un insieme di strumenti di dissezione (forbici e pinze) per la soluzione in autoclave o disinfettante. Saranno necessari un tubo o un piccolo bicchiere contenente etanolo al 70% per una rapida sterilizzazione di strumenti tra dissezioni. Infine, sarà necessaria una bottiglia spray contenente 70% di etanolo per sterilizzare la superficie del mouse prima dissezione.
- Preparare una superficie di dissezione avvolgendo un pezzo di polistirolo o sughero in fogli di alluminio. Perni dissezione o aghi vengono utilizzati per fissare l'animale in luogo.
- Preparare piatti o piastre per la raccolta di tiUESTIONI. Se i tessuti pooling, separati 60 millimetri piatti contenenti 3 ml di PBS sterile + 1% FBS (PBS +) per milza e linfonodi tessuti è sufficiente. Se mantenendo tessuti da singoli topi separati, preparare un 1ml 24-pozzetti contenenti di PBS + il numero desiderato di pozzetti.
- Preparare i media RPMI completo per colture cellulari e pre-caldo prima dell'uso (Tabella 1).
NOTA: Noi abitualmente utilizziamo RPMI ma altri media come IMDM e DMEM può essere altrettanto efficace o superiore a seconda del laboratorio e l'esperimento. - Cut 2x2 cm quadrati di nylon ingranano con una dimensione dei pori e autoclave a 120 micron per sterilizzare (Tabella 1).
- Opzionale: se si utilizza il cellulare magnetico ad alta velocità del sistema di smistamento come autoMACS per l'arricchimento di cellule CD4 +, corsa pre-caldo e risciacquo buffer in un bagno d'acqua C 37 o per evitare danni alla macchina.
- NOTA: arricchimento si consiglia di aumentare il rendimento di smistamento e ridurre i tempi di ordinamento.
- Tuttopassaggi di preparazione, fatta eccezione per la dissezione, devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale sterili.
2. Isolamento dei linfonodi e della milza di topi
- Euthanize il numero di animali utilizzando una tecnica istituzionalmente approvato. Utilizzare C57BL / 6 topi di sesso femminile, di età 5-10 settimane, a causa della loro alta percentuale di cellule T naive e grasso corporeo inferiore rispetto ai maschi o ai topi anziani.
NOTA: Le cellule derivate da topi maschi si esibiranno in modo simile in vitro e le fasi del protocollo rimangono gli stessi. Topi femmina, 5-10 settimane vecchie, in genere produrrà 3-6 x 10 6 naïve cellule CD4 + T per mouse. Tuttavia, utilizzando diversi ceppi di topi possono influenzare il rendimento e le prestazioni. Per esempio, cellule di topi C57BL / 6 sono migliori per la generazione di cellule Th1 mentre le cellule da topi Balb.c sono migliori per generare cellule Th2. - Distribuire gli arti dell'animale e perno in posizione, come mostrato in Figura 1. Tagliare la pelle lungoitudinally dall'ano al mento facendo attenzione a non forare tessuti più profondi.
- Diffusione aprire la pelle con una pinza e pin la pelle in atto per permettere un facile accesso ai linfonodi come mostrato in Figura 1.
- Raccogliere linfonodi accessibili dalle posizioni indicate nella figura 1. Afferrando linfonodo con un paio di pinze, mentre la separazione dei tessuti con un altro paio di pinze permette una facile rimozione. Posizionare il tessuto nel piatto di raccolta.
- Raccolto milza dalla posizione mostrata in figura 1. In questo caso, il taglio attenzione nel peritoneo è necessario per ottenere l'accesso alla milza. Posizionare il tessuto in un piatto di raccolta.
- Ripetere la procedura se saranno raccolte più tessuti. Altrimenti procedere con i passi successivi. A questo punto, eseguire tutte passaggi rimanenti in ghiaccio fino fasciame delle cellule T dopo la cernita.
3. Tissue Processing e CD4 + arricchimento
- Trattare i linfonodi e la milza in piatti diversi per aumentare la resa di preparazioni di cellule linfonodali non richiedono eritrociti lisi, che possono provocare la morte dei leucociti minore. Pertanto, le seguenti operazioni descrivono un metodo per il trattamento della milza e dei linfonodi popolazioni seguiti separatamente unendo prima di etichettatura per l'ordinamento.
- Rimuovere il tessuto (milza o linfonodi aggregati) dal piatto di raccolta e posto in un nuovo piatto 60 millimetri contenente 3 ml di PBS +. Inserire un quadrato di nylon sterile maglia sopra il tessuto con pinze sterilizzate.
- Prendete il lato del pollice di un stantuffo della siringa (3-10 ml) e distruggere il tessuto delicatamente contro la rete. Quasi tutto il tessuto dovrebbe andare in sospensione. In alternativa, posizionare il tessuto tra due vetrini smerigliati autoclavato e rettificato in sospensione.
- Pipettare la sospensione su e giù per un paio di volte per rompere i grumi solubili rimanenti. Inserire un nuovo pezzo quadrato di maglia di nylon sopra l'apertura di unTubo da 15 ml e filtrare la sospensione attraverso per rimuovere i detriti rimanenti.
- Ripetere i passaggi 2-4 per linfonodi supplementare e tessuto splenico.
- Una volta che la sospensione è stata filtrata in un tubo 15ml riempire il resto del tubo con PBS + e invertire alcune volte. Centrifugare le cellule a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Per le cellule spleniche, aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di soluzione ghiacciata 1X ACK per milza per 1 min per lisare gli eritrociti. Aggiungere quindi 10 ml di PBS + sulla parte superiore del ACK, invertire il tubo, e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Per le cellule linfonodali, aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS +. Se lo si desidera questi possono essere combinati con le cellule della milza dopo la loro lisi ACK e lavaggio.
- Aspirare il surnatante dopo centrifugazione dei splenociti e risospendere in altri 10 ml di PBS +. A questo punto la sospensione linfonodo può esseredded sulla parte superiore della sospensione milza se è richiesto il pool di tessuto per l'ordinamento. Centrifugare il tubo di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Il pellet cellulare può essere preparato per CD4 arricchimento. Se non viene eseguita questa operazione, passare alle fasi di preparazione di smistamento.
- Per CD4 arricchimento utilizzando il sistema cell sorting magnetico ad alta velocità, risospendere il pellet cellulare CD4 con perline. Tipicamente 15 ml di perline diluito in 85 ml di PBS + è usato per etichettare i tessuti dal 1 mouse. Rampa il volume della miscela sferette, se necessario, risospendere il pellet, e incubare per 15-30 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 10 ml di PBS +, passare la sospensione attraverso nylon in un nuovo tubo 15 ml per rimuovere i detriti e centrifugare di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere il precipitato in 100 ml di PBS + per topo e procedere alla selezione positiva sul sistema di smistamento cellulare magnetica ad alta velocità. Se si utilizza un sistema di separazione manuale, fsusseguirsi le istruzioni del produttore per l'arricchimento. In alternativa, risospendere i campioni di tampone FACS: PBS con 1mM EDTA (pH = 8) e 1% BSA, sterile filtrata.
- Rimuovere la frazione positiva e lavare di nuovo con 10 ml di PBS +. La frazione arricchita CD4 + è ora pronto per essere etichettato per l'ordinamento.
4. cellule Ordinamento Naïve CD4 + T
- Etichettare il pellet di cellule con PBS + anticorpi fluorescenti contenenti diretti contro CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizzando gli anticorpi elencati nella Tabella 1, sono forniti diluizioni per ciascuno. Per la colorazione, un volume di 100 ml di cocktail anticorpo viene utilizzato per tessuti da un mouse.
- Risospendere il pellet in cocktail di anticorpi e incubare per 15-30 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 10 ml di PBS + e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Passare il composto sopra un altro filtro di nylon o filtro cella cap rispostare i detriti avanzi. Pipettare le cellule marcate in un tubo che è compatibile per il cell sorter. Mantenere le cellule in ghiaccio e protetti dalla luce fino al genere.
- Preparare tubi di raccolta pipettando 1-2 ml di mezzi completi RPMI o FBS nel fondo dei tubi compatibili per la raccolta su un cell sorter.
- Ordina l'ingenuo cellule CD4 + T come CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - popolazione (Figura 2). Lavare le cellule raccolte con mezzi completi RPMI e centrifugare come descritto sopra.
- Risospendere il pellet in completo RPMI, contare le cellule naive, e regolare la concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml.
5. Impostare la differenziazione in vitro
- Aspirare i pozzetti delle piastre rivestite anti-CD3 e anti-CD28 e lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS sterile (senza FBS). Per piastre 48 pozzetti, piastra 0,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 0,5 ml di RPMI. Per piastre da 24 pozzetti, cultura 1 x 10 6 cellule / pozzetto in 1,0 ml di RPMI.
- Se testare l'influenza di un elemento quale un farmaco aggiungere la sostanza ai pozzetti appropriati sia prima, durante o dopo il processo di differenziazione seconda dell'esperimento. Avanti, integrare il terreno di coltura con citochine e anticorpi bloccanti conseguenza. Th0: 30 U / ml di hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml di hIL-2, e 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml di hIL-2, 2,000 ng / ml solubile 37.51, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml HIL-2, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11.
NOTA: Le condizioni sopra esposte sono risultati essere ottimale per massimizzare la produzione di citochine misurata alla fine dell'esperimento differenziazione (sezione Risultati rappresentativi). Tuttavia, ogni condizione deve essere ottimizzato per i singoli laboratori (Tabella 2 - Incubare la piastra a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 4-5 d prima analisi dell'espressione genica e della produzione di citochine. In alternativa, rimuovere le cellule dagli stimoli TCR dopo 2 d, rettificato per 1 x 10 6 cellule / ml con mezzi freschi, e la piastra in nuovi pozzi (non rivestito) per migliorare la proliferazione e la resa finale. In questo caso, le citochine polarizzanti fresche e gli anticorpi non sono necessari, ma di 10 U / ml di IL-2 dovrebbero essere aggiunti nuovi media per Th0, Th1, Th2, e culture iTreg.
6. Analisi della Differenziazione
- Per l'analisi di citochine mediante citometria a flusso, restimolare ogni pozzetto con 10ng / ml PMA e 1.000 ng / ml ionomicina o Tabella / ml anti-CD3 per 4-6 ore in presenza di un inibitore golgi come brefeldina A (1 mg1). Eseguire intracellulare colorazione citochine seconda dell'esperimento (Figura 3).
NOTA: Stain citochine o fattori di trascrizione, quali IL-4 (non mostrato) e IFNγ non specifico lineage (Figura 3) per colture Th17, per ciascuna condizione come controlli negativi e come indicatore dell'efficienza differenziazione. Inoltre, macchia Foxp3 per culture Th17 come lo sviluppo reciproco delle Tregs può verificarsi con l'aggiunta di TGFβ. - Per la quantificazione delle proteine, raccogliere il surnatante da ogni dosaggio bene e specifici citochine ELISA (Figura 3). Se si teme che il fattore in fase di test ha influenzato la proliferazione rispetto a campioni di controllo, le cellule possono essere lavati, contati, normalizzata, e quindi restimolati con 1 mg / ml di anti-CD3 per 24 ore prima di raccogliere surnatanti per test ELISA. Se saggiare IL-4 da Th2 è necessaria condizioni, lavaggio e restimolare rimuovere IL-4 che può essere leftover dalla cultura iniziale differenziazione.
- Per l'analisi dell'espressione genica mediante real time PCR, le cellule raccolto dopo il periodo di incubazione, lavare, normalizzano, e ri-stimolano per 2-6 h con 1 mg / ml di anti-CD3 prima della raccolta mRNA (Figura 3).
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Representative Results
Il punto di tempo per l'analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l'entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l'analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l'aggiunta di esogeno IL-2, come Th1 e Th2, probabilmente esaurire i media dopo 4 giorni di coltura. Per massimizzare la produzione di citochine, tali pozzi con i media esausti possono essere rifornite con RPMI fresco contenente IL-2 o contate e ri-placcato a 1 x 10 6 cellule per pozzetto in RPMI fresco contenente IL-2 per estendere la differenziazione per un altro giorno o due con questo metodo.
Figure 1. Illustrazione di posizionamento perno per fissare un mouse per l'isolamento di milza e linfonodi. (A) Stendere le membra a pezzi e fissarli con un ago sterile o pin dissezione. Da questa posizione, tagliare il pelo e la pelle longitudinalmente dalla coda al mento. (B) Dopo il taglio, delicatamente diffondere la pelle a parte per esporre i linfonodi, come mostrato in figura. Le posizioni dei linfonodi che sono facilmente accessibili da questa posizione sono elencati in figura. La milza si trova appena sotto la gabbia toracica sul lato destro dell'animale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura strategia di smistamento 2. Rappresentante per l'isolamento di CD4 + naïve Cellule T da cellule di smistamento. Partendo dalla parte superiore sinistra, i linfociti vengono prima gated per dimensione e quindi le cellule di singoletto sono discriminati dalle cellule doppietto. Gating su canottiere rivela una popolazione di CD4 + CD25 + cellule che sono nTregs. Gate sulla CD4 + CD25 - popolazione e quindi ordinare ingenuo (CD62L + CD44 -) dalla effettrici / memoria (CD62L - CD44 +) cellule CD4 +. Le linee tratteggiate indicano l'origine cancello del prossimo trama. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Dati di esempio seguente in vitro Th differenziazione. (A) Intracdati ellular citochine colorazione (gated su CD4 +) da Th1, Th2, iTreg e differenziazioni Th17. Tipicamente, citochine specifiche non lignaggio, quali IL-4 e IFNγ per culture Th17, devono essere colorati per determinare la qualità della differenziazione. Dati (B) ELISA seguente 4 d Th differenziazione, lavaggio, e 24 h restimolazione di cellule con 1 mg / ml. (C) time-CD3 anti- reale PCR dati dei fattori di trascrizione specifici lineage seguenti 4 d differenziazione e restimolazione per 4 ore con 1 mg / ml di anti-CD3. Tutte le quantità di geni sono stati normalizzati per l'espressione di β-actina e mRNA da cellule T naive indifferenziate servono come base per l'espressione genica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Vedere Materiali tabella qui sotto.
| Reagente | Consigliato Titolazione Gamma |
| Le citochine: | |
| Umano (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Anticorpi: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5.000 ng / ml |
| 37.51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2.500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
Tabella 2. Consigliato titolazione Gamma per la ottimizzazione della differenziazione condizioni.
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Discussion
Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfonodi esterni accessibili. Una volta linfonodi e milze vengono elaborati, separazione delle cellule è il metodo preferito per ottenere una popolazione altamente purificata naive CD4 + T cellule. La purezza è essenziale per prevenire o nTregs effettrici e memoria gi cellule di influenzare il processo di differenziazione delle cellule ingenuo. Difficoltà di ottenere un alto rendimento di cellule T naive sono generalmente provocate dalla raccolta dei tessuti inefficiente e l'elaborazione o la perdita di cellule durante le fasi di separazione. Per aumentare la resa make sure per elaborare le celle utilizzando tamponi freddi e incubazione su ghiaccio. Inoltre, per evitare la perdita di cellule durante arricchimento e / o smistamento, ottimizzando i reagenti e protocolli di separazione in anticipo è raccomandato. Infine, come accennato in vari punti nei passaggi di protocollo, condizioni differenziazione dovrebbe essere ottimizzato per singoli laboratori prima di eseguire esperimenti su larga scala (Tabella 2).
Come mostrato in Figura 2, le cellule T CD4 + naive possono essere facilmente distinti dal nTreg (CD4 + CD25 +) ed effettrici (CD4 + CD44 + CD62L -) popolazioni. L'ordinamento è uno dei modi più affidabili per prevenire la contaminazione di effettori Th sottoinsiemi, che esistono anche nelle milza e linfonodi. Treg contaminazione durante la differenziazione può comportare la soppressione dell'attivazione così come la produzione di citochine. La contaminazione di altri effettori Th sottoinsiemi possono causarela produzione di citochine che inibiscono lo sviluppo di linee Th desiderati. Ordinamento spese di impianto possono essere costosi e alcuni scoprire che è più facile di arricchire per le cellule CD4 + T per la separazione magnetica di ridurre il tempo di ordinamento come descritto in questo protocollo. In assenza di un sorter, alcune aziende offrono ora i kit di separazione progettato specificamente per l'isolamento delle cellule CD4 + T naive. Tuttavia, la purezza della popolazione deve sempre essere controllata dopo la separazione, simili ai campioni filtrate. Il ritrovamento di una bassa frequenza di ingenui cellule CD4 + T (CD62L +) rispetto alle celle di memoria / effettrici (CD44 -) può indicare un problema con il mouse, come ad esempio una infezione o tumore. In questo caso le cellule non devono essere utilizzati per questo tipo di esperimento.
Ci sono alcuni modi per determinare l'efficacia della Th differenziazione. L'analisi delle proteine è tradizionalmente eseguita da macchia citochinezione, che darà un'idea della percentuale di cellule naive che sono stati polarizzato ad una linea specifica (Figura 3). Protein quantificazione da ELISA è anche uno strumento utile per determinare la quantità totale di citochine essere rilasciato nei media. L'avvertimento con ELISA analisi delle proteine, tuttavia, è che confrontando i risultati tra i gruppi sperimentali possono essere difficile se un fattore di particolare in fase di test ha un'influenza sulla proliferazione e la sopravvivenza. In questo caso, il numero totale di cellule producenti citochine possono essere diversi tra i gruppi alla fine dell'esperimento. Così, normalizzando il numero di celle e restimolare per un breve periodo di tempo (ad esempio, anti-CD3 per 24 h) è necessario per ottenere risultati appropriati. Inoltre, IL-4 è usato come fattore di polarizzazione per la generazione del sottoinsieme Th2, così queste cellule deve essere lavato, normalizzata, e restimolata prima di eseguire un test ELISA per IL-4. Analisi di espressione genica mediante real time PCR è utile non solo fo l'analisi di gene citochine trascrizione, ma anche per i fattori di trascrizione specifici lineage (Figura 3). Così, a seconda dell'esperimento, ci sono vari modi per saggiare l'efficacia della differenziazione Th.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l'Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l'ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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