Introduction
Hjertet ventil sykdom er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden; prevalensen øker med alderen, og det påvirker mer enn 10% av befolkningen 75 år og eldre en. Ventilene av den systemiske del av hjertet, aorta og mitral ventiler, er mest påvirket. Hjerteklaffen sykdom er karakterisert ved tapet av svært organisert struktur av ventilene, noe som resulterer i forandring av de mekaniske egenskaper 2. Den strukturelle integritet er derfor avgjørende for funksjonen av ventilen.
Flygeblader av ventilen består av klaffe interstitielle celler (VIC), klaffe endotelceller (VEC) og ekstracellulære matrise, som er svært organisert i en lagdelt mønster 3,4. De Vics er ansvarlig for ECM syntese, nedbrytning og organisasjon. Faktorer som kommer fra blodet, egenkapitalbevis eller bosatt i ECM handle på Vics iscenesetter sin funksjon. I tillegg,mekaniske krefter virker på pakningsvedlegget under hjertesyklusen som resulterer i laminær eller oscillerende skjærspenning, kompresjons eller strekkspenninger som påvirker atferden til Vics 5.
For å forstå hvordan strukturen av ventilen er regulert, må det først bli forstått hvordan Vics svare på det varierte sett av stimuli opplevde under hjertesyklusen. In vitro studier har vært veldig lærerikt om egenskaper og evner av valvulære celler. Responsen av disse cellene in vitro, men kan ikke alltid nøyaktig etterligne in vivo respons 6; for eksempel, er responsen av VIC på stimuli avhengig av tilstedeværelse av ECS og ECM sammensetning 5. Videre er responsen fra klaffe celler til stimuli, avhenger av deres spesifikke plasser i heftet 7. I tillegg til biokjemiske stimuli, er oppførselen til klaffe cellene bestemmes ved hjelp av mekaniske krefter som virker on ventilen 8. Hver region av ventilen blir utsatt for sin egen spesielle sett av hemodynamiske påkjenninger. Selv om dagens ex vivo modeller har vist at mekaniske krefter er viktige faktorer som bestemmer klaffe struktur 5, tilhørende mekanismene er fortsatt uklart. Mens in vivo-modeller har gitt innsikt i de molekylære mekanismene bak klaffe utvikling 9,10, innsikt i voksen klaffe biologi er fortsatt unnvikende.
Derfor ble en ex vivo strømningsmodell utviklet hvor hjerteklaffer kan dyrkes i sin naturlige stilling i hjertet i en lengre tidsperiode 11. Dette har den fordel at ventilene forblir i deres naturlige konfigurasjon og VICS oppleve det samme miljø som in vivo, noe som gjør VICS respons på stimuli så naturlig som mulig. I tillegg, kulturen av ventilene i sin naturlige stilling i hjertet letter å underkaste hvertklaffe region til relevante hemodynamiske påkjenninger. I denne ex vivo-modell, dvs. Miniature Tissue Culture System (MTCS), ventilene kan bli utsatt for forskjellige biokjemiske og hemodynamiske stimuli som tillater undersøkelse av deres rolle i hjerteventil remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger LUMC retningslinjene for dyret forskningsetisk komité.
1. Utarbeidelse av Instruments, dyrkingsmedium, og MTCS
Merk: Utfør alle forberedelser i laminær hette. Den MTCS perfusjon kammer, boble felle og stativ er beskrevet i Lieber et al., 2010 11.
- Desinfisere tang og mikro saks med 70% etanol. Forberede en 5 ml sprøyte med 21G nål med steril Tyrodes Buffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM glukose, 1,5 mM CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7,2). Forberede en 5 ml sprøyte med 21G nål med sterilt KCl løsning (100 mm).
- Forbered 65 ml medium pr hjerte: DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum, antibiotika / antimykotisk (A / A, 100 enheter av penicillin, 100 ug streptomycin, og 0,25 ug av amfotericin B / ml), insulin-Transferrin-Selen (ITS, 10 ug / ml insulin, 5,5 ug / ml Transferrin, 6,7 ng / ml natriumselenitt) og filtersteriliser.
- Steril perfusjon kammeret og boblefelle ved sprøyting med 70% etanol og tørkes med et papirhåndkle. Monter MTCS (figur 1D), men i utgangspunktet uten perfusjon kammeret. Plasser boble felle på standen. Bruk en peristaltisk berg pumpe med lett belastning pumpehoder.
- Ved hjelp av silikonrøret lage forbindelser mellom reservoaret (50 ml rør) og pumpen, pumpen og boblefelle, boblefelle og reservoaret (se figur 1D). Gjør slangen inne i inkubatoren lenge nok til å tillate medium å oppnå gass likevekt med gassen i kuvøsen gjennom gassgjennomtrengelige silikonrøret (1 m), og røret utenfor inkubatoren så kort som mulig.
- Fyll 50 ml tube med 70% etanol, slå på pumpen (flow hastighet rundt 1 ml / min for å tillate riktig sirkulasjon) og la etanol CIRformet, i 30 minutter for å sterilisere alle rør. Fjern etanolen ved å tømme tanken og pumpe ut ethanol fra systemet.
- Fyll 50 ml tube med sterilt destillert vann, slå på pumpen og la vannet sirkulere i 30 minutter for å bli kvitt gjenværende etanol. Fjerne vannet ved å tømme tanken og pumpe ut vann fra systemet.
- Fyll 50 ml tube med 45 ml medium, sette stativet i kuvøse. Slå på pumpen (strømningshastighet omkring 1 ml / min) og sirkulere mediet for å fylle alle rør, fjerne alle luftbobler og tillate mediet å tilpasse seg til gass-sammensetningen i inkubatoren i minst 1 time. Oppretthold inkubatoren ved standard vev-kultur forhold (5% CO 2 og 37 ° C). Sørg for at ingen luftbobler i slangen.
2. Isolering av Mouse Hjerte
- Injisere mus med 500 enheter av Heparin. Dette vil hindre at blod levrer seg, og tillater fjerning av blood fra hjertet. Etter 10 min, bedøve mus i en induksjons kammer med 4% isofluran ved anvendelse av en presisjonsfordamper. Anestesi er tilstrekkelig når musen ikke svarer til tå klype.
- Overfør musen til en disseksjon styre og opprettholde anestesi ved hjelp av en ansiktsmaske som er koblet til en koaksial krets. Desinfiser pelsen av musen med 70% alkohol. Bruke saks åpne bukhulen å avdekke vena cava og membran.
- Å avsløre hjertet, gjør laterale snitt med start fra siste til første ribbe og reflektere brystkassen i løpet av musen hode. Stopp anestesi som mus ikke puster lenger. Observere hjertet slo.
- Sett 21G nål festet til en 5 ml sprøyte som inneholder steril Tyrodes buffer inn i den nedre vena cava fra abdominal inn i brysthulen (gjennom membranen). Sørg for at blodet kan avslutte fra vena cava hale fra nålen innsetting. Perfuse the Tyrodes Buffer forsiktig og med konstant trykk inn i vena cava inntil hjertet mister delvis sin røde farge. Merk: Hjertet forblir slå tillater fjerning av blod fra hjertet.
- Erstatt nålen med 21G nål festet til en 5 ml sprøyte som inneholder sterilt KCl løsning. Forsiktig perfuse KCl løsning i vena cava før hjertet stopper slo og fjern nålen. Merk: KCl løsning bevarer hjertet i den avslappede diastoliske fasen, som vil tillate enklere innsetting av perfusjon nåler og perfusjon av koronar system.
- Løft hjertet bruker buede tang og bruke saks dissekere hjertet fri fra omkringliggende vev, men la arterier og vener proksimale til hjertet intakt og festet til hjertet. Overfør hjertet til et 15 ml rør inneholdende iskald PBS supplert med antibiotisk / antimykotisk (A / A). Oppbevare hjertet i iskald PBS i opptil 3 timer.
3. Cannulation av musen Hearts i Perfusjons Chamber
- Utfør alle prosedyrer i laminær hette. Overfør isolert hjerte fra 15 ml tube til en 10 cm petriskål og legge PBS supplert med A / A.
- Under et disseksjonsmikroskop, bruker mikro saks og pinsett for å fjerne alle ikke-kardiale vev, men bevare den oppstigende aorta for å i det minste bifurkasjonen med brachiocephalic arterien og lungevenene, 2 mm proksimalt til hjertet. Skjær av tuppen på toppen av hjertet til å skape tilgang til venstre ventrikkel lumen (typisk 2 mm). Plasser perfusjon kammer i strømningshette under disseksjonsmikroskop.
- Fest en 5 ml sprøyte med middels til innsatsen nål ved hjelp av silikonslanger. Fyll perfusjon kammer med 20 ml medium og sette hjertet på rotasjonen trinnet mellom de 2 blunted nåler i perfusjon kammeret (figur 1). Justere høyden av rotasjonstrinnet, slik at hjertet er plassert forannåler.
4. hemorroider for dyrking mitralklaffen (se figur 1)
- Ligere aorta med sutur (silke 7,0). Ligate venstre atrial vedheng med sutur. Sett nålen (nr. 1 i figur 1) gjennom lungevenen inn i venstre atrium og ligate med sutur proksimalt for sin inntreden i venstre atrium. Pass på at nålen er ikke for langt inn i venstre atrium, da dette ville skade mitralklaffen.
- Sett nålen (nr.2 i figur 1) med lineær bevegelse inn i venstre hjertekammer. Overføre mediet fra perfusjon kammeret til et 50 ml rør. Tett nålen til hjertemuskelen med biokompatible lim.
- Etter at limet har tørket, nøye injisere medium i hjertet ved å koble et medium fylt sprøyte til nål nr.1 og sjekke om det er noen lekkasje. Sikre at mellom utganger fra nål nr.2 og den siste gjenværende blod perfundert ut av hjertet.
5. Limeres for dyrking av den aortaklaffareal (se Figur 1)
- Sett nålen (nr.1 i figur 1) i aorta og ligate med sutur. Pass på at nålen er ikke for langt inn i aorta, da dette ville skade aortaklaffen. Sett nålen (nr.2 i figur 1) med lineær bevegelse inn i venstre hjertekammer. Overføre mediet fra perfusjon kammeret til et 50 ml rør. Tett nålen til hjertemuskelen med biokompatible lim.
- Etter at limet har tørket, nøye injisere medium inn i hjertet ved å koble et medium fylt sprøyte til nål nr.2 og sjekke om det er noen lekkasje. Sikre at mellom utganger fra nål nr.1 og den siste gjenværende blod perfundert ut av hjertet.
6. Sett Perfusjons Chamber på Stand
- Fyll opp perfusjon kammer med 20 ml overført medium. Plasser pakningen og lokket på kammeret og stram med vaskemaskin og skruer.
- Fjern de sammensatte MTCS fra incubator. Fest perfusjon kammer på standen. Koble slangen (se figur 1D). Plasser stativet i inkubatoren (5% CO 2 og 37 ° C). Koble slangen til pumpen. Slå på pumpen med strømningshastighet rundt 600 mL / min.
- Sørge for at i reservoaret og / eller boblefelle nivået av mediet gjør at visualiseringer av nærværet av strømningen ved å falle fra de innkommende medium dråper. Etter dyrking, ble hjertet fjernet fra systemet, fiksert og prosessert for histologisk undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aortaklaff (figur 2) eller mitral ventil 11 kan være dyrket i minst 3 dager. Ved dyrking i åpen stilling (som representerer det systoliske posisjon for aortaventilen og det diastoliske posisjon for mitral ventil), ventil cellene forblir levedyktig. Ingen celledød observeres som bestemt ved fravær av TUNEL-positive celler (figur 2H, I) eller spaltet caspase-3-ekspresjon (som ikke er vist og Lieber et al., 2010 11). Kollagen fordeling (som visualisert ved Masson s Trichrome farging) er lik den opprinnelige tilstand når de dyrkes i 1% serum (figur 2D, E). Ventilene reagerer på skiftende dyrkningsforhold. Ved å øke mengden av serum til 10% resulterer i tykkere brosjyrer (figur 2C). Videre er en klar kollagen-fritt område observert på ventrikulære siden av heftet nær tilknytning til aortaveggen (pilen i figur 2F
Figur 1. Miniatyr Tissue Culture system. (A) I perfusjon kammeret hjertet blir liggende på rotasjonstrinnet og ligert med avstumpet nålene som er angitt med nr.1 og nr.2. (B) Perfusjon kammer er montert på stativet. (C) Skjematisk tegning av hjertet når dyrking mitralklaffen (venstre) eller aortaklaff (til høyre). (D) Skjematisk tegning av oppsettet av ex vivo flow system for aortaklaffen kultur. Dette tallet er delvis endret fra forrige undersøkelse 11. Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.
Figur 2. Histologisk analyse av dyrkede ventiler fra 2 måneder gamle mus. (AC) heamatoxylin og eosin (H & E) (DF) Masson s Trichrome farging og GI) TUNEL-farging av en ikke-dyrkede Aortaklaff (A, D, G), en Aortaklaff dyrket i nærvær av 1% serum (B, E , H) eller 10% serum (C, F, I) i 3 dager i MTCS. Ventilen dyrket med 1% serum ligner den ikke-dyrkede ventilen, mens ventilen dyrket med 10% serum er tykkere (C) og har et endret mønster ECM (F). Ingen apoptose er observert i ventilene (GI). Scale bar er 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i dyrking av hjertemuse ventilene inkluderer å tiden mellom eksisjon av hjertet fra musen og ligering i perfusjon kammeret så kort som mulig for å sikre levedyktigheten og ligering av nålene perpendikulært på ventiler for å sikre riktig retning av strømnings . I tillegg sjekker strømmen etter ligation i perfusjon kammeret uten medium sikrer riktig innsetting og ligering av nåler. Det er viktig å opprettholde et sterilt kultur og hindre luftbobler i slangen, som potensielt kan bli fanget i hjertet som hindrer strømningen.
Det totale volum av medium anvendt for perfusjon av et hjerte er 45 ml (legg merke til at det mediet som blir perfusert gjennom hjertet ikke er i kontakt med 20 ml medium i kammeret perfusjon). For tilsetningen av for eksempel virus et mindre volum kan være foretrukket. Temporært reservoaret (og en del av røret) kan fjernes fra kretsen leaving 5-7 ml i systemet til å tillate infeksjon av ventilen.
Fraværet av hjerteslag kan anses som en begrensning. Men, det kan skape en eksperimentell tilstand der alle stimuli som arbeider på heftet kan holdes konstant. Dette gir en unik mulighet for å studere effekten av en enkel modifikasjon. Når bevegelige ventiler er nødvendig, kan en pulserende strømning bli opprettet.
Å studere klaffe biologi og rollen av molekylære, cellulære og mekaniske stimuli på ventilen, kan lett gjøres endringer i kultursystem. Molekyl modifikasjon kan oppnås ved tilsetning av vekstfaktorer, kjemiske forbindelser og virus som medierer genavlevering 11 til perfusjonsmediet. En eller flere celler kan administreres til perfusjonsmediet for å undersøke innvirkningen av disse celler på klaffe biologi eller deres bidrag til ventilen. Påvirkningen av oksidativt stress eller hypoksi kan bliundersøkt ved å endre oksygentrykket i kulturmediet. De hemodynamiske påkjenninger på ventilen kan varieres ved å endre strømningshastighet, strømningsretning, strømnings pulsatility og viskositeten. Den generelle morfologi kan undersøkes (figur 2B, C) ved H & E, histokjemisk og immunofluorescerende farging. I tillegg organiseringen og sammensetningen av ECM, fenotypen, proliferasjon og levedyktighet av klaffe celler og aktivering av signalveier gir innsikt i effekten av varierende disse betingelsene. Genetisk modifiserte mus kan brukes til å spore endotelceller, ved hjelp av endotelceller reporter-mus (ved hjelp av Tie2-Cre og floxed reporter-mus) som indikerer tilstedeværelse av endotelial-til-mesenchymale transformasjon eller mus med tap eller vinning av funksjon av spesifikke signalveier. Samlet systemet presenteres her er et nyttig verktøy for å studere hjerteklaffe biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
