Introduction
Болезнь сердца клапан является основной причиной заболеваемости и смертности в западном мире; его распространенность увеличивается с возрастом, и это влияет на более чем 10% населения 75 лет и старше 1. Клапаны системной части сердца, аортального и митрального клапанов, в основном пострадали. Сердечно-сосудистые заболевания клапанов характеризуется потерей высокоорганизованной структуре клапанов, что приводит к изменению механических свойств 2. Структурная целостность Поэтому крайне важно для функции клапана.
Створки клапана состоят из клапанов интерстициальных клеток (ВМЦ), клапанов эндотелиальных клеток (VEC), и внеклеточного матрикса, который высоко организованной в слоистой рисунком 3,4. ВИК отвечают за синтез ЕСМ, деградации и организации. Факторы, исходящий из крови, ЭК или проживающих в ECM действуют на ВИНК оркестровки свою функцию. В дополнение,механические силы действуют на листовке во время сердечного цикла, в результате чего ламинарный или колебательного напряжения сдвига, сжатия или растягивающих напряжений, влияющих на поведение ВИНК 5.
Для того, чтобы понять, как структура клапана регулируется, то сначала следует понимать, как ВИНК реагировать на разнообразный набор стимулов опытных во время сердечного цикла. В пробирке исследования были очень информативными о характеристиках и способностях клапанов клеток. Реакция этих клеток в пробирке, однако, может не всегда точно имитировать ответ в естественных условиях 6; Например, реакция на раздражители VIC зависит от наличия ЭК и ECM состава 5. Кроме того, реакция клапанного клеток на стимулы, зависит от их конкретного места в листовке 7. В дополнение к биохимических раздражителей, поведение клапанных элементов определяется механическими силами, действующими Oп клапан 8. Каждая область клапана подвергается ее собственный набор гемодинамических нагрузок. Хотя нынешние экс естественных условиях модели показали, что механические силы являются важными факторами, определяющими структуру клапанов 5, связанные механизмы до сих пор неясно. В то время как модели в естественных условиях обеспечили понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе развития клапанной 9,10, способность проникновения в суть взрослых клапанной биологии до сих пор не удается.
Таким образом, экс виво модель потока была разработана в котором клапаны сердца могут быть культивированы в их естественном положении в центре в течение длительного периода времени 11. Это имеет то преимущество, что клапаны остаются в их естественной конфигурации и ИКС испытать ту же среду, что и в естественных условиях, что делает ответов на стимулы VICS как можно более естественным. Кроме того, культура клапанов в их естественном положении в центре облегчает подвергая другклапанов регион соответствующих гемодинамики напряжений. В этом экс виво модели, т.е. Миниатюрный культуры ткани Система (MTCS), клапаны могут быть подвергнуты различным биохимическим и гемодинамических стимулов, позволяющих исследование их роли в ремоделирования сердца клапана.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует рекомендациям LUMC животного исследования Комитетом по этике.
1. Подготовка инструментов, культура средний и MTCS
Примечание: Выполните все препараты в ламинарный. MTCS перфузии камера, пузырь ловушку и стенд описаны в Либер и др., 2010 11.
- Лечить щипцы и ножницы с микро 70% этанола. Подготовьте 5 мл шприц с 21G иглу стерильной Тирода буфера (130 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 6,0 мМ Hepes, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 20 мМ глюкозы, 1,5 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, рН = 7,2). Подготовка 5 мл шприц с иглой 21G с стерильного раствора KCl (100 мм).
- Подготовка 65 мл среды на основе DMEM: с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиками / противогрибковое (A / A; 100 единиц пенициллина, 100 мкг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерицина / мл), инсулин-Transferrin-Селен (ИТС; 10 мкг / мл инсулина, 5,5 мкг / мл трансферрина, 6,7 нг / мл селенит натрия) и фильтр стерилизуют.
- Стерилизовать перфузии камеры и пузырь ловушку путем распыления 70% этанола и сухой с бумажным полотенцем. Собирают MTCS (рис 1D), однако, вначале без перфузии камеры. Расположите пузырь ловушку на стенде. Используйте перистальтического роликового насоса с головок насоса легко нагрузки.
- Использование кремния трубки сделать связи между резервуаром (50 мл) и трубки насоса, насоса и пузырь ловушку, ловушку пузыря и водохранилища (рис 1D). Сделать трубки внутри инкубатора достаточно долго, чтобы позволить достичь средней газа равновесии с газовой в инкубаторе через проницаемую трубки газовой кремния (1 М) и трубки вне инкубатора как можно короче.
- Заполните 50 мл пробирку с 70% -ным этанолом, включить насос (скорость потока примерно 1 мл / мин, чтобы позволить циркуляцию), и пусть этанол CIRculate в течение 30 мин, чтобы стерилизовать все трубки. Удаления этанола путем опорожнения резервуара и откачки этанола из системы.
- Заполните 50 мл трубку стерильной дистиллированной водой, включить насос и дайте воде циркулировать в течение 30 мин, чтобы избавиться от оставшихся этанола. Удалить воду опорожнения резервуара и откачки воды из системы.
- Заполните 50 мл трубку с 45 мл среды, поставить стенд в инкубатор. Включите (скорость потока приблизительно 1 мл / мин) насос и циркулировать среда, чтобы заполнить все трубки, удалить все пузырьки воздуха и позволяют среда для адаптации к составу газа в инкубаторе в течение 1 ч. Поддерживать инкубатор при стандартных условиях культивирования тканей (5% СО 2 и 37 ° С). Убедитесь, что не было пузырей присутствуют в трубке.
2. Выделение мыши Сердце
- Вводите мышь с 500 единиц гепарина. Это позволит предотвратить свертывание крови и позволяет удаление бLOOD от сердца. Через 10 мин анестезию мыши в индукционной камере с 4% изофлуран использованием прецизионного испаритель. Анестезия достаточно, когда мышь не отвечает на носок щепотку.
- Передача мышь, чтобы рассечение борту и поддерживать анестезию с помощью лицевой маски, подключенного к коаксиальному цепи. Лечить мех мыши с 70% алкоголя. Использование ножницы вскрыть брюшную полость, чтобы разоблачить полую вену и диафрагму.
- Чтобы разоблачить сердце, сделать боковые разрезы, начиная от последнего к первому ребер и отражают грудной клетки над головой мыши. Остановите анестезии, как мыши не дышит больше. Соблюдайте биение сердца.
- Вставьте иглу 21G, прикрепленный к 5 мл шприца, содержащего буфер стерильного Тирода в нижней полой вене из брюшной в грудную полость (через мембрану). Убедитесь, что кровь может выйти из вены хвостовой полой от введения иглы. Заливать йБуфер е Тирода мягко и с постоянным давлением в полую вену, пока сердце не теряет частично свою красного цвета. Примечание: Сердце бьется остается позволяя удаление крови из сердца.
- Замените иглу с иглой 21G 5 мл шприц, содержащий стерильный раствор KCl. Осторожно заливать раствор KCl в полой вены, пока сердце не перестанет биться и извлеките иглу. Примечание: Решение KCl сохраняет сердце в непринужденной диастолическую фазу, которая позволит легче вставлять перфузии игл и перфузии коронарных системы.
- Слегка приподнимите сердце с помощью изогнутых щипцов и с помощью ножниц препарировать сердце свободно от окружающих тканей, но оставить артерии и вены проксимальных к сердцу целости и прилагается к сердцу. Перенести сердце 15 мл пробирку, содержащую ледяной PBS с добавлением антибиотиков / противогрибковое (A / A). Храните сердце в ледяной PBS до 3 часов.
3. Cannulatioп мыши сердец в перфузии палаты
- Выполните все процедуры в ламинарный. Передача изолированного сердца от 15 мл трубку в чашку Петри 10 см и добавить ФБР с добавкой A / A.
- Под микроскопом рассекает, используйте микро ножницы и пинцет, чтобы удалить все не-сердечной ткани, но сохранить восходящую аорту, по крайней мере бифуркации с брахиоцефальных артерий и легочных вен, 2 мм проксимальнее сердца. Отрежьте кончик верхушки сердца, чтобы создать доступ к левого желудочка просвет (обычно 2 мм). Поместите камеру перфузии в капюшоне потока под микроскопом рассекает.
- Приложить 5 мл шприц с среды к вставке иглы с помощью силиконовых трубок. Заполните перфузии камеру с 20 мл среды и положил сердце на сцене вращения между 2 притупляются иглы в перфузии камеры (рисунок 1). Высоту стадии вращения так сердце позиционируется в передней частииглы.
4. Лигирование для культивирования митрального клапана (рисунок 1)
- Перевязывать аорты с шелковой нити (7,0). Перевязывать ушка левого предсердия с швом. Вставьте иглу (номер факса. 1 на рисунке 1) через легочную вену в левом предсердии и перевязывать с шовного проксимального его вступления в левом предсердии. Убедитесь, что игла находится не слишком далеко в левое предсердие, так как это приведет к повреждению митрального клапана.
- Вставьте иглу (nr.2 на рисунке 1) с линейным движением в левый желудочек. Передача среды из камеры перфузии в 50 мл пробирку. Печать иглу в миокарде с биосовместимого клея.
- После высыхания клея, тщательно вводить среду в сердце, подключив средний заполненный шприц с иглой nr.1 и проверить, если есть какие-либо утечки. Убедитесь, что средний выход из иглы nr.2 и последний оставшийся в крови перфузии из сердца.
5. Лидование для культивирования аортального клапана (рисунок 1)
- Вставьте иглу (Nr.1 на рисунке 1) в аорте и перевязывать с швом. Убедитесь, что игла находится не слишком далеко в аорту, так как это приведет к повреждению аортального клапана. Вставьте иглу (nr.2 на рисунке 1) с линейным движением в левый желудочек. Передача среды из камеры перфузии в 50 мл пробирку. Печать иглу в миокарде с биосовместимого клея.
- После высыхания клея, тщательно вводить среду в сердце, подключив средний заполненный шприц с иглой nr.2 и проверить, если есть какие-либо утечки. Убедитесь, что средний выход из иглы nr.1 и последний оставшийся в крови перфузии из сердца.
6. Место перфузии палаты на стенде
- Заполните перфузии камеру с 20 мл переданных среду. Поместите прокладку и крышку на камеру и затяните с шайбой и винтами.
- Удалить собранные MTCS из ИнкубаторыTor. Прикрепите перфузии камеры на стенде. Подключите трубки (рис 1D). Поместите подставку в инкубаторе (5% CO 2 и 37 ° C). Подключите шланг к насосу. Включите насос со скоростью потока около 600 мкл / мин.
- Убедитесь, что в резервуаре и / или пузырьков ловушку уровень среды позволяет визуализации присутствии потока при падении из входящих капель среды. После культивирования, сердце удаляется из системы, фиксированной и обработаны для гистологического исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Аортального клапана (фиг.2) или митрального клапана 11 можно культивировать в течение по крайней мере 3 дней. Культивированием в открытом положении (которое представляет собой систолическое положение для аортального клапана и диастолического положении для митрального клапана), клапанные элементы остаются жизнеспособными. Нет гибель клеток не наблюдалось, как определено отсутствие TUNEL-положительных клеток (рис 2H, I) или расщепленной каспазы-3 экспрессии (не показан и Либер и др., 2010 11). Распределение коллагена (как визуализировали окрашиванием трехцветный Массона) похож на родном состоянии при культивировании в сыворотке 1% (рис 2D, Е). Клапаны реагировать на изменяющиеся условия культуры. Увеличение количества сыворотки до 10% приводит к более толстых листовок (рис 2С). Кроме того, ясно, коллаген бесплатно область наблюдается при желудочковой стороне листовки возле прикрепления к стенке аорты (стрелка на рисунке 2F
Рисунок 1. Миниатюрный система тканевой культуры. (А) в перфузионной камеры сердца лежит на стадии вращения и лигировали с затупленных игл, обозначенных nr.1 и nr.2. (Б) перфузии камеры установлен на стенде. (С) Схематическое изображение сердца при культивировании митрального клапана (слева) аортального клапана или (справа). (D) схематический чертеж установки экс естественных условиях проточной системы для аорты культуры клапана. Эта цифра была частично изменены с предыдущего исследования 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное вариант ое этой фигуры.
Рисунок 2. Гистологический анализ культивируемых клапанов от 2 месяцев старых мышей. (Переменного тока) heamatoxylin и эозином (Н & Е) трехцветный окрашивание и Г.И. (DF) Массона) TUNEL окрашивание не-культурной аортального клапана (А, D, G), аорты клапан культивировали в присутствии 1% сыворотки (B, E , Н) или 10% сыворотки (C, F, I), в течение 3 дней в MTCS. Клапан культивировали с 1% сывороткой появляется похож на неферментированные клапана, в то время как клапан культивируют с 10% сыворотки толще (С) и имеет измененную ECM шаблон (F). Нет апоптоз не наблюдается в клапанах (GI). Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в культивировании клапаны мыши сердечные включают создание времени между удалением сердца от мыши и лигирование в перфузионной камеры как можно короче, чтобы обеспечить жизнеспособность и лигирование иглы перпендикулярно к клапанам, чтобы обеспечить надлежащее направление потока , Кроме того, проверка поток после перевязки в перфузии камеры без среды обеспечивает правильное подключение и перевязка игл. Это имеет решающее значение для поддержания стерильной культуры и предотвращения пузырьков воздуха в трубы, которые потенциально могли бы застрять в сердце, препятствующие притоку.
Общий объем среды, используемой для перфузии сердца 45 мл (обратите внимание, что среда, которая перфузии через сердце не находится в контакте с 20 мл среды в камере перфузии). Для добавления например вирусы меньший объем может быть предпочтительным. Временно резервуар (и часть трубки) могут быть удалены из печатной лeaving 5-7 мл в системе, чтобы позволить инфекции клапана.
Отсутствие биение сердца можно считать ограничение. Тем не менее, это позволяет создавать экспериментальную состояние, в котором все стимулы, работающие на листовке может поддерживаться постоянным. Это дает уникальную возможность для изучения влияния одной модификации. При перемещении клапана требуется, поток пульсирующего могут быть созданы.
Для изучения биологии клапанную и роль молекулярных, клеточных и механических раздражителей на клапан, модификации могут быть легко внесены в системе культуры. Молекулярная модификация может быть достигнуто путем добавления факторов роста, химических соединений и вирусов, опосредующих доставку генов 11 к перфузионной средой. Один или несколько типов клеток могут быть введены в перфузионной средой для изучения влияния этих клеток на клапанной биологии или их вклад в клапане. Влияние окислительного стресса или гипоксии может бытьизучали путем изменения кислорода давления в культуральной среде. Гемодинамические напряжения на клапан можно варьировать, изменяя скорость потока, направление потока, потока пульсации и вязкость. Общая морфология могут быть рассмотрены (рис 2B, C) и Н Е, гистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания. Кроме того организация и состав ECM, фенотипа, пролиферации и жизнеспособности клеток и клапанов активации сигнальных путей обеспечить понимание последствий изменения этих условий. Генетически модифицированные мыши могут быть использованы для отслеживания эндотелиальные клетки, с помощью эндотелиальных репортер мышей (с использованием Tie-2-Cre и floxed репортер мышей), указывающий на наличие эндотелиальных к-мезенхимального трансформации или мышей с потерей или функции специфических сигнальных путей. В целом, система, представленная здесь является полезным инструментом для изучения сердечной клапанную биологию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
