Introduction
Herzklappenerkrankungen ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt; die Prävalenz steigt mit dem Alter, und es wirkt sich auf mehr als 10% der Bevölkerung 75 Jahre und älter 1. Die Ventile des systemischen Teil des Herzens, die Aorten- und Mitralklappen Besonders betroffen sind. Herzklappenkrankheit wird durch den Verlust des hochorganisierte Struktur der Ventile, die in der Veränderung der mechanischen Eigenschaften 2 Ergebnisse aus. Die strukturelle Integrität ist daher entscheidend für die Funktion des Ventils.
Die Blättchen des Ventils sind der Klappen interstitiellen Zellen (VIC), Herzklappen Endothelzellen (VEC) und extrazelluläre Matrix, die besonders in einem geschichteten Muster 3,4 organisiert besteht. Die VICs sind für den ECM-Synthese, Abbau und Organisation verantwortlich. Faktoren aus dem Blut, ECs ausgeht oder mit Wohnsitz in der ECM wirken auf die VICs Orchestrierung seiner Funktion. Außerdem,mechanische Kräfte auf das Flugblatt wirken während des Herzzyklus, was zu laminaren oder oszillierende Scherbelastung, Druck- oder Zugspannungen Beeinflussung des Verhaltens von VICs 5.
Um zu verstehen, wie die Struktur des Ventils reguliert wird, muss es zunächst zu verstehen, wie VICs der vielfältigen Anzahl von Einflüssen während des Herzzyklus reagieren könnte. In vitro-Studien haben sehr informativ über die Eigenschaften und Fähigkeiten der Klappenzellen. Die Antwort dieser Zellen in vitro können jedoch nicht immer genau imitieren das in vivo Verhalten 6; beispielsweise ist die Reaktion auf Reize VIC abhängig von der Anwesenheit von ECs und ECM-Zusammensetzung 5. Ferner das Ansprechen der Klappen Zellen auf Stimuli, hängt von ihrer bestimmten Stelle in dem Merkblatt 7. Neben biochemische Reize wird das Verhalten der Zellen, die durch Klappenbetätigung O mechanische Kräfte bestimmtn das Ventil 8. Jeder Bereich des Ventils ist mit ihrem eigenen spezifischen Satz hämodynamische Beanspruchungen ausgesetzt. Obwohl aktuelle Ex-vivo-Modelle haben gezeigt, daß mechanische Kräfte sind wichtige Determinanten Klappenstruktur 5 sind die zugehörigen Mechanismen noch nicht geklärt. Während in vivo-Modellen haben Einblick in die molekularen Mechanismen Klappenentwicklung 9,10 zugrunde liegenden vorgesehen ist Einblicke in Erwachsenen Klappen Biologie noch völlig unklar.
Daher wurde ein ex vivo Strömungsmodell entwickelt, in denen die Herzklappen in ihrer natürlichen Position im Herzen für einen längeren Zeitraum 11 kultiviert werden. Dies hat den Vorteil, dass die Ventile bleiben in ihrer natürlichen Konfiguration und VICS erfahren derselben Umgebung wie in vivo, wodurch die VICs Reaktionen auf Reize so natürlich wie möglich ist. Zusätzlich kann die Kultur der Ventile in ihrer natürlichen Position im Herzen ermöglicht Werfen jedesKlappenregion an die zuständigen hämodynamische Beanspruchungen. In dieser ex vivo-Modell, das heißt der Miniatur Gewebekultursystem (MTCS) der Ventile kann auf verschiedene biochemische und hämodynamischen Reize ermöglicht die Untersuchung von deren Rolle im Herzklappen Umbau unterzogen werden.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den LUMC Richtlinien des Tierforschungsethikkommission.
1. Herstellung des Instruments, Kulturmedium und MTCS
Hinweis: Führen Sie alle Vorbereitungen in der Sterilbank. Das MTCS Perfusionskammer, Blasenfalle und Ständer sind in Lieber et al., 2010, 11 beschrieben.
- Desinfizieren Sie die Zange und Mikro-Schere mit 70% Ethanol. Eine 5 ml-Spritze mit 21G-Nadel mit sterilem Tyrode-Puffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM Glucose, 1,5 mM CaCl 2 · 2H 2 O, pH = 7,2). Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit Nadel 21G mit sterilem KCl-Lösung (100 mM).
- Vorbereitung 65 ml Medium pro Herz: DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotikum / Antimykotikum ergänzt (A / A; 100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin und 0,25 & mgr; g Amphotericin B / ml), Insulin-Transferrin-Selen (ITS; 10 ug / ml Insulin, 5,5 ug / ml Transferrin, 6,7 ng / ml Natriumselenit) und Filter zu sterilisieren.
- Sterilisieren Sie die Perfusionskammer und Blasenfalle durch Besprühen mit 70% Ethanol und trocken mit einem Papiertuch. Montieren Sie den MTCS (1D), jedoch zunächst ohne die Perfusionskammer. Positionieren Sie den Blasenfalle auf den Ständer. Verwenden Sie eine peristaltische Rollenpumpe mit Easy-Load-Pumpenköpfe.
- Mit Silikonschlauch Verbindungen zwischen dem Reservoir (50 ml Röhrchen) und der Pumpe, die Pumpe und der Blasenfalle, die Blasenfalle und Reservoir (siehe Figur 1D). Stellen den Schlauch im Inkubator lang genug, um mittlere bis Gasgleichgewicht mit dem Gas in dem Inkubator über die gasdurchlässige Silikonschlauch (1 m) und die Rohrleitung außerhalb des Inkubators so kurz wie möglich zu erreichen.
- Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit 70% Ethanol, schalten Sie die Pumpe (Fließgeschwindigkeit ca. 1 ml / min, um die ordnungsgemäße Zirkulation zu ermöglichen), und lassen Sie das Ethanol circulate für 30 Minuten, um alle Schläuche zu sterilisieren. Das Ethanol durch Entleeren des Behälters und das Abpumpen des Ethanols aus dem System.
- Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser, schalten Sie die Pumpe und lassen Sie das Wasser zirkulieren für 30 Minuten, um der restlichen Ethanol loszuwerden. Entfernen Sie das Wasser durch das Leeren des Reservoirs und das Abpumpen des Wassers aus dem System.
- Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit 45 ml Medium, setzen Sie den Stand im Inkubator. Schalten Sie die Pumpe (Fließgeschwindigkeit ca. 1 ml / min) und leitet das Medium, um alle Schläuche zu füllen, entfernen Sie alle Luftblasen und damit das Medium, um die Gaszusammensetzung in den Inkubator für mindestens 1 Stunde anzupassen. Pflegen Sie den Brutschrank bei Standardgewebekulturbedingungen (5% CO 2 und 37 ° C). Darauf achten, dass keine Luftblasen in den Schläuchen vorhanden sind.
2. Isolierung von Maus Herz
- Spritzen Sie die Maus mit 500 Einheiten Heparin. Dadurch wird die Verhinderung der Blutgerinnung und ermöglicht das Entfernen von blood aus dem Herzen. Nach 10 min, betäuben die Maus in einer Induktionskammer, die mit 4% Isofluran unter Verwendung eines Präzisions Verdampfer. Die Anästhesie ist ausreichend, wenn sich die Maus nicht mehr reagiert toe Prise.
- Übertragen Sie die Maus auf eine Dissektion Bord und Aufrechterhaltung einer Narkose mittels einer Gesichtsmaske mit einem koaxialen Schaltung verbunden. Desinfizieren Sie das Fell der Maus mit 70% Alkohol. Mit einer Schere öffnen Sie die Bauchhöhle der Hohlvene und Zwerchfell zu entlarven.
- Um das Herz aussetzen, stellen seitliche Einschnitte ausgehend vom letzten zu den ersten Rippen und spiegeln den Brustkorb über Kopf Maus. Stoppen Sie die Anästhesie der Maus wird nicht mehr atmen. Beobachten Sie das Herz schlagen.
- Einfügen der 21G Nadel in eine 5 ml Spritze mit steriler Tyrode-Puffer in die Vena cava inferior von der Bauch in die Brusthöhle (durch die Membran) befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Blut aus der Vena Cava caudal von der Nadeleinführung austreten kann. Perfundieren the Tyrode-Puffer schonend und mit konstantem Druck in die Hohlvene hinein, bis das Herz verliert teilweise seine rote Farbe. Hinweis: Das Herz bleibt Pfosten ermöglicht das Entfernen von Blut aus dem Herzen.
- Ersetzen Sie die Nadel mit der 21G Nadel in eine 5-ml-Spritze mit steriler KCl-Lösung angebracht. Perfundieren vorsichtig die KCl-Lösung in die Hohlvene bis das Herz aufhört zu schlagen, und entfernen Sie die Nadel. Anmerkung: Die KCl-Lösung bewahrt die Herzen in der entspannten diastolischen Phase, die ein leichteres Einsetzen der Perfusion Nadeln und Perfusion der Herzkranzsystem ermöglicht.
- Heben Sie das Herz mit einer gebogenen Pinzette und mit einer Schere zu sezieren das Herz frei von umgebenden Gewebe aber lassen Arterien und Venen proximal des Herzens intakt und mit dem Herzen verbunden. Übertragen Sie die Herzen in ein 15 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS, ergänzt mit Antibiotikum / Antimykotikum (A / A). Lagern Sie das Herz in eiskaltem PBS für bis zu 3 Stunden.
3. Cannulation der Maus Hearts in der Perfusionskammer
- Führen Sie alle in Sterilbank. Übertragen Sie die isolierten Herzen aus dem 15-ml-Röhrchen mit einer 10 cm Petrischale und fügen PBS, ergänzt mit A / A.
- Unter einem Binokular, verwenden Sie die Mikro-Schere und Pinzette, um alle nicht-Herzgewebe zu entfernen, aber die Erhaltung der aufsteigenden Aorta, um zumindest die Bifurkation mit dem Truncus brachiocephalicus und die Lungenvenen, 2 mm proximal des Herzens. Entzieht der Spitze der Spitze des Herzens, um den Zugang zu den linksventrikulären Lumen (typischerweise 2 mm) zu schaffen. Legen Sie die Perfusionskammer in der Flow-Haube unter dem Binokular.
- Bringen Sie ein 5-ml-Spritze mit mittleren bis Einsatzes Nadel mit dem Silikonschlauch. Füllen Sie die Perfusionskammer mit 20 ml Medium, und legte das Herz auf dem Rotationstisch zwischen den 2 abgestumpft Nadeln in der Perfusionskammer (Abbildung 1). Einstellen der Höhe des Rotationsstufe so das Herz vor der positioniertNadeln.
4. Ligation für die Kultivierung der Mitralklappe (siehe Abbildung 1)
- Ligation der Aorta mit Naht (Seide 7.0). Ligation der linken Herzohr mit Naht. Führen Sie die Nadel (Nr. 1 in Abbildung 1) durch die Lungenvenen in den linken Vorhof und Ligation mit Naht proximal zu seinem Eintritt in den linken Vorhof. Sicherzustellen, dass die Nadel nicht zu weit in den linken Vorhof, da dies die Mitralklappe beschädigen.
- Führen Sie die Nadel (Nr.2 in Abbildung 1) mit linearer Bewegung in den linken Ventrikel. Übertragung des Mediums aus der Perfusionskammer in ein 50 ml Röhrchen. Verschließen Sie die Nadel auf den Herzmuskel mit biokompatiblen Klebstoff.
- Nachdem der Leim getrocknet ist, sorgfältig zu injizieren Medium in das Herz durch den Anschluss eines Mediums Spritze zur Nadel nr.1 und prüfen Sie, ob es eine Leckage. Sicherzustellen, dass die Medium tritt aus Nadel nr.2 und die letzte verbleibende Blut aus dem Herzen durchblutet.
5. Ligation zur Kultivierung der Aortenklappe (siehe 1)
- Führen Sie die Nadel (nr.1 in Abbildung 1) in der Aorta und Ligation mit Naht. Sicherzustellen, dass die Nadel nicht zu weit in die Aorta, wie dies die Aortenklappe beschädigen. Führen Sie die Nadel (Nr.2 in Abbildung 1) mit linearer Bewegung in den linken Ventrikel. Übertragung des Mediums aus der Perfusionskammer in ein 50 ml Röhrchen. Verschließen Sie die Nadel auf den Herzmuskel mit biokompatiblen Klebstoff.
- Nachdem der Leim getrocknet ist, sorgfältig zu injizieren Medium in das Herz durch den Anschluss eines Mediums Spritze zur Nadel nr.2 und prüfen Sie, ob es eine Leckage. Sicherzustellen, dass die Medium tritt aus Nadel nr.1 und die letzte verbleibende Blut aus dem Herzen durchblutet.
6. Legen Perfusionskammer auf Stand
- Füllen Sie Perfusionskammer mit den 20 ml-Medium. Zeigen Dichtung und Deckel auf die Kammer und ziehen mit Unterlegscheibe und Schrauben.
- Entfernen Sie die zusammengebauten MTCS vom Incubator. Befestigen Sie die Perfusionskammer auf den Ständer. Den Schlauch (siehe Abbildung 1D). Setzen Sie den Stand im Inkubator (5% CO 2 und 37 ° C). Schließen Sie den Schlauch an der Pumpe. Schalten Sie die Pumpe mit Strömungsgeschwindigkeit um 600 & mgr; l / min.
- Sicherstellen, dass in dem Behälter und / oder die Blasenfalle der Pegel des Mediums ermöglicht die Visualisierungen für das Vorhandensein der Strömung durch das Fallen der eingehenden Mediumstropfen. Nach der Kultivierung wird das Herz aus dem System entfernt, fixiert und für die histologische Untersuchung verarbeitet.
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Representative Results
Die Aortenklappe (Abbildung 2) oder Mitralklappe 11 kann für mindestens 3 Tage kultiviert werden. Durch Kultivierung in der offenen Stellung (die den systolischen Position für die Aortenklappe und der diastolischen Position für die Mitralklappe darstellt), Herzklappen Zellen lebensfähig bleiben. Kein Zelltod beobachtet, wie durch die Abwesenheit von TUNEL-positiven Zellen (2H, I) oder gespalten Caspase-3-Expression bestimmt (nicht gezeigt, und Lieber et al., 2010, 11). Die Kollagenverteilung (wie durch Masson Trichrom-Färbung sichtbar) ist ähnlich zu dem nativen Zustand, wenn in 1% Serum (2D, E) kultiviert. Die Ventile sind auf sich ändernde Kulturbedingungen. Erhöhen der Menge an Serum zu 10% führt zu dickeren Blättchen (Abbildung 2C). Weiterhin wird eine klare Kollagen-freien Bereich an der ventrikulären Seite des Segels in der Nähe der Befestigung an der Aortenwand beobachtet (Pfeil in Figur 2F
Abbildung 1. Die Miniatur-Gewebekultursystem. (A) In der Perfusionskammer das Herz auf dem Rotationstisch und ligiert mit den stumpfen Nadeln mit nr.1 und nr.2 angegeben Verlegung. (B) Perfusionskammer ist auf dem Stativ montiert. (C) Schematische Darstellung des Herzens wenn das Kultivieren der Mitralklappe (links) oder Aortenklappe (rechts). (D) Schematische Darstellung des Aufbaus der Ex-vivo-Flow-System zur Aortenklappe Kultur. Diese Zahl hat sich zum Teil aus früheren Studie 11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen of dieser Figur.
Abbildung 2. Die histologische Analyse von kultivierten Ventile ab 2 Monate alten Mäusen. (AC) heamatoxylin und Eosin (H & E), (DF) Masson Trichrom-Färbung und GI) TUNEL-Färbung eines nicht-kultivierte Aortenklappe (A, D, G), eine Aortenklappe in Gegenwart von 1% Serum (B, E kultiviert , H) bzw. 10% Serum (C, F, I) für 3 Tage in der MTCS. Das Ventil mit 1% Serum kultiviert wird ähnlich dem nicht-kultivierte Ventil, während das Ventil mit 10% Serum kultiviert dicker ist (C) und eine geänderte ECM Muster (F). Keine Apoptose in den Ventilen (GI) beobachtet. Maßstabsleiste ist 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritischen Schritte in Züchten der Herz Maus Ventile gehört es, die Zeit zwischen dem Herausschneiden des Herzens von der Maus und der Ligation in der Perfusionskammer so kurz wie möglich, um die Lebensfähigkeit und die Ligation der Nadeln senkrecht zu den Ventilen zu gewährleisten richtige Richtung der Strömung zu gewährleisten . Zusätzlich Überwachen von Durchfluss nach der Ligation in der Perfusionskammer ohne Medium gewährleistet eine ordnungsgemäße Einsetzen und Unterbindung der Nadeln. Es ist kritisch, einen Sterilkultur erhalten und zu verhindern Luftblasen in dem Schlauch, die potentiell im Herzen Behinderung der Strömung hängen bleiben könnte.
Das Gesamtvolumen des Mediums zur Perfusion eines Herzens verwendete 45 ml (beachten Sie, dass das Medium, das durch das Herz perfundiert wird, nicht in Kontakt mit der 20 ml des Mediums in der Perfusionskammer). Für die Zugabe von beispielsweise Viren ein kleineres Volumen kann bevorzugt sein. Zeitlich das Reservoir (und ein Teil des Schlauchs) von der Schaltung l entfernt werdeneaving 5-7 ml in dem System, um eine Infektion des Ventils zu ermöglichen.
Das Fehlen von Herzschlag könnte als Einschränkung werden. Dennoch erlaubt das Erstellen eines experimentellen Bedingungen, bei denen alle Stimuli arbeitet an der Broschüre konstant gehalten werden kann. Dies gibt die einmalige Gelegenheit, die Wirkung einer einzigen Modifikations studieren. Beim Bewegen Ventile erforderlich sind, kann eine pulsierende Strömung erzeugt werden.
Um das Klappen Biologie und die Rolle der molekularen, zellulären und mechanische Reize auf das Ventil zu studieren, können Modifikationen leicht in dem Kultursystem durchgeführt werden. Molekulare Modifikation kann durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren, chemische Verbindungen und Viren vermitteln Genabgabe 11 zu dem Perfusionsmedium erreicht werden. Einer oder mehreren Zelltypen können zum Perfusionsmedium verabreicht werden, um den Einfluss dieser Zellen auf Klappen Biologie oder deren Beitrag zur Ventil untersuchen. Der Einfluss von oxidativem Stress oder Hypoxie kannuntersucht durch Veränderung der Sauerstoffdruck in dem Kulturmedium. Die hämodynamische Belastungen des Ventils kann durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit, Strömungsrichtung, Strömungs Pulsatilität und die Viskosität variiert werden. Die Gesamtmorphologie von H & E, histochemischen und Immunfluoreszenzfärbung untersucht (Abbildung 2B, C). Zusätzlich die Organisation und Zusammensetzung des ECM, den Phänotyp, Proliferation und Lebensfähigkeit der Klappenzellen und die Aktivierung von Signalwegen, einen Einblick in die Wirkungen verschiedener diese Bedingungen. Genetisch veränderten Mäuse können verwendet werden, um die Endothelzellen zu verfolgen, mit endothelialen Reportermäusen (mit der Tie2-Cre und floxed Reportermäusen), welches das Vorhandensein von Endothelzellen zu mesenchymalen Transformation oder Mäusen mit Dämpfung oder Verstärkung in Abhängigkeit von bestimmten Signalwege. Insgesamt ist die hier vorgestellte System ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Herzklappenfehler Biologie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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