Abstract
בלידה, הריאה עוברת מתג פנוטיפי עמוק מן ההפרשה לבליעה, המאפשר הסתגלות נושמת באופן עצמאי. קידום ושמירה על הפנוטיפ הזו חשובה באופן קריטי בתמורת צמיחה המכתשית נורמלית וגז לאורך כל חיים. מספר מחקרים במבחנה אפיינו את התפקיד של חלבונים רגולטוריים מפתח, מולקולות איתות, והורמונים סטרואידים שיכולים להשפיע על שער של פינוי נוזל הריאות. עם זאת, בבדיקות vivo חייבת להתבצע כדי להעריך אם גורמים רגולטוריים אלה ממלאים תפקידים פיסיולוגיים חשובים בויסות קליטה נוזלת ריאות סביב לידה. ככזה, ניצול של הדמיית רנטגן בזמן אמת כדי לקבוע סיקול נוזל הריאות סביב הלידה, או בצקת ריאות, מייצג התקדמות טכנולוגית בתחום. בזאת, אנו להסביר ולהמחיש גישה להעריך את שיעור סיקול נוזל הריאות המכתשית והצפות המכתשית ב C57BL / 6 עכברים בבית ביום שלאחר הלידה 10 אותנוing הדמיה וניתוח רנטגן. יישום מוצלח של פרוטוקול זה טעון אישור מראש של ועדה לטיפול ולשימוש חיה מוסדית (IACUC), מערכת הדמיית רנטגן in vivo הקטנים בעלי חיים, ותוכנות הדמיה מולקולריות תואמות.
Introduction
בלידה, ריאת היילוד חייבת המעבר והסתרתו נוזל לאיבר reabsorbing נוזל להקים אוורור חמצון נאות של הגוף. המנגנונים המאפשרים (או המעכבת) האישור יעיל של נוזל ריאות בזמן הלידה עדיין אינם ברורים. דוגמנות שיעור סיקול נוזל המכתשית C57BL / 6 גורים עכבר היילוד יוביל להבנה טובה יותר של הגורמים הרגולטוריים שיכולות לשפר או להחליש את קצב ספיגת הנוזלים. זה יכול לחול גם על מודלים בילוד אחרים של פגיעת ריאות חריפה או זיהום, ויכול להוביל אסטרטגיות טיפוליות חדשניות תינוקות עם מצוקה נשימתית.
מאז ריאות ילודות זעומות לעומת ריאות מבוגרות, מדידות רגילות של פינוי נוזל המכתשית המסתמכות על מדידות שטיפה או gravimetrical ואינן מתאימות ללמוד במדויק אישור נוזל ריאה במודלי ריאות בילוד. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים assay המאפשרהקביעה המדויקת של שיעורי פינוי נוזל המכתשית גורי היום לאחר לידת 10 C57BL / 6 עכבר באמצעות תרמי חיה קטן. אחד היתרונות הגדולים של שימוש בגישה fluoroscopic הוא כי בעלי החיים הם צילמו in vivo. הם נושמים בחופשיות ועשויים להתאושש assay פולשנית הזה וצופה פני עתיד ולימוד. המטרה הכללית של שיטה זו היא מודל בצק ריאות הבריאות הילוד, ולהעריך את שיעור סיקול נוזל המכתשית בריא ילוד. טכניקה זו פותחה, בין השאר, כאסטרטגיה להפחתת כדי להקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים, עדיין למקסם את תפוקת ניסיוני. טכניקה זו מאפשרת גם זיהוי מעולה של כרכי נוזל ריאות באמצעות הדמיית רנטגן ודורשת מיומנות באיפוק חייתי בסיסי וטיפול 1; ניתוחי קנו נשימת חיה קטנה החדרה 2, תרמי חיה קטן, תוכנת ניתוח תמונה בסיסית. חוקרים המבקשים להעריך כרכי נוזל ריאות in vivo (BRE בחופשיותathing מורדם במודלים של בעלי חיים) עלול למצוא הליך זה מתאים ליישום שלהם. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להגדיל מודלים קיימים אחרים של פגיעה ריאות בילוד השתמשו במחקר מכניסטית של דיספלזיה bronchopulmonary, כולל פציעה ריאות הנגרמת hyperoxia, הנשמה מלאכותית, ומודלים של ריאות דלקת 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסיוני בטכניקות חייבות להתנהל בהתאם לטיפול המוסדי והנחיות ועדת השימוש.
1. רנטגן הדמיה רכישה
- סקירת תוכנה (ראה איור 1 לסקירה כללית של הגדרות תוכנה).
- בחר בלחצן הלכידה ישירות מתחת הכרטיסייה הקובצת.
- בתפריט הנפתח ההגדרות, בחר הפעלה נוכחית.
- בחר חשיפה רגילה בתיבה הנפתחת הממוקם תחת זמן חשיפה.
- קבע את זמן החשיפה עד 2.00 דקות, ולאחר מס ' חשיפה לסיכוני 1. הגדר את X ו- Y כלי קיבול כלי קיבול עד 2 פיקסלים. ראה איור 1.
- בחר הצטברות סופית מהתפריט הנפתח אפשרויות יצוא.
- בהגדרות תאורה, Sele גודלct X-Ray מהתפריט הנפתחת מקור תאורה. ברירת המחדל KVP מוגדר 35.
- בחר Autoselect בקובץ הפניה החל התפריט הנפתח כדי להחיל את קובץ עזר רנטגן המקביל. (ראה סעיף 2).
- במצלמה נקבעו הגדרות, להגדיר את f-stop 2.51.
- הגדר את FOV (שדה של נוף) כדי 125.64 לעכברים PN10.
- הגדר את מישור המיקוד ל -13, ובתפריט הנפתח ליד מחוון מישור המיקוד, בחר X-Ray.
- עבור צילומי רנטגן, להגדיר את מסנן עירור ואת מסנן פליטה ל -0 התפריט הנפתח.
- שמור הפעלה נוכחית על ידי לחיצה על חדש על העליונה ליד הגדרות. הזן שם עבור ניו רוכשת קובץ הגדרות, למשל, "אירוע חשיפה יופיטר יחיד לביצוע פרוטוקול." ראה איור 2.
- יצירת פרוטוקול הדמית רנטגן
- לחץ על הכפתור הפרוטוקולים צור / ערוך בצד ימין של החלון הפתוח.
- כחלון קופץ חדש פרוטוקול מופיע, לחץ על הכפתור החדש בפינה הימנית העליונה
- הזן את שם הפרוטוקול יחסוך תחת, למשל "יופיטר הדגמת פרוטוקול", ולוחץ על אישור. (ראה איור 3).
- בתחתית החלון הקופץ פרוטוקול צעדי פרוטוקול, להבטיח 1 כי השלב מודגש טקסט אדום, לכידת תמונות חדשות נבחרה, ולא לעשות כלום נבחר לכיד התמונה לפני התפריט נפתח.
- בקביעת לכידה, בחר את אירוע החשיפה היחיד לאחרונה המופק שלב 1.1.12.
- בחר מתן (sec) מן הלכידה לאחר תמונה בתפריט הנפתח.
- לחץ על כפתור העריכה, typדואר 180 לתוך תיבת המוקפץ, ולחץ על אישור כדי להוסיף את זמן המתנה 3 דקות לאחר כל רכישת 2 דקות.
- שכפל שלב 1 על ידי לחיצה ימנית על כרטיסיית שלב 1 ובחירת שלב כפול. צור 23 כפילויות לתקופת תצפית 2 hr. (ראה איור 4).
- על השלב האחרון (שלב 24), לשנות את לאחר לכידת תמונת הגדרה לעשות שום דבר מן המתן (sec).
- לחץ על הלחצן שמור וצא עורך הפרוטוקול.
2. קובצי עזר תאורה
הערה: החל קבצי התייחסות תאורה רנטגן לתמונה רנטגן על מנת לתקן באופן אוטומטי עבור וריאציות אחידות גלאי של תמונות רנטגן שהושגו לאורך הניסוי. הנהלים המפורטים להלן הם ספציפיים Bruker במערכות ראיית Animal Vivo; רשאי מערכות הדמיה in vivo אחריםלשמש.
- יצירת קובץ התייחסות תאורה ידי פתיחת תוכנת ההדמיה המולקולרית ולחיצה על הכפתור הלכיד.
- שימוש בתפריט המוקפץ, להקים את הגדרות הלכידות רנטגן מקור תאורה (ראה הגדרות הציעו בסעיף 1 לעיל) ולאחר מכן בחר הפנית תאורה בסוג החשיפה. זה ניתן למצוא תחת כיווני תקן תיבה נפתחים. (ראה איור 5).
- הסר את כל הדגימות מתחנת התמונה. הגדר את binning X ו- Y עד 4 x 4 binning. עיין בטבלה 1: זמני חשיפה קובץ התייחסות תאורה כדי לקבוע את זמן החשיפה מדויק.
- לחץ Expose.
- החל את קובץ ההפניה על ידי בחירת מאפיין Auto Select מן התפריט הנפתח בקטע החל קובץ הפניה. (ראה איור 6). קובץ עזר התאורה כעת יחול באופן אוטומטי לכל im רנטגןגילים שנתפסו עם הגדרות המצלמה זהות. צעדים 2.1 - 2.4 לא צורך לחזור אם גדרות מצלמה זהות מנוצלות בניסויים הבאים.
הערה: קובץ עזר תאורה ניתן ליישם לאחר רכישת תמונה, או אם מופיעה הודעת שגיאה לאחר קבצי בחירה אוטומטית של התייחסות. החל תאורה קובצי עזר ללכוד שלאחר התמונה באמצעות סדרת הפקודות הבאות בחלונית הניווט של תוכנת הדמיה מולקולרית: תמונה> מתמטיקה תמונה> סוג: המשימות> חישוב: תיקון תאורה. בחר תמונת הקלט (X) כי אתה רוצה להחיל את קובץ התייחסות תאורה (Y) כדי. שנה את שם הקובץ המתוקן (Z). (ראה איור 7).
טיפול בבעלי חיים 3.
- רכישת בעלי חיים
- לרכוש סכרים בהריון מגדלים מסחריים או להתרבות עכברות בבית ב 12 שבועות של גיל (ומעלה) בהתאם להנחיה מוסדיתים.
- עכברים ילודים בית עם אמהות מניקות עד יום הלידה (PN) 10.
- הרדמת בעלי החיים (PN 10)
- הכן קוקטייל קטמין / Xylazine להרדים PN 10 עכברים עבור אפקטים הרדמה ממושך שארך עד 40 דקות. הוסף 500 μl של קטמין (100 מ"ג / מ"ל) עד 75 μl של Xylazine (100 מ"ג / מ"ל). לדלל 1:10 ב תמיסת מלח 0.9% לעשות קטמין (100 מ"ג / ק"ג) / Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) קוקטייל ההרדמה.
- לשקול את עכברי היילוד.
- באמצעות מזרק 3/10 עם מחט 31 G 5/16 אינץ '(8 מ"מ), לנהל 10 μl / גרם של משקל הגוף של הרדמה עם זריקה intraperitoneal.
- לשמור על חיות יבשה מבודדים כדי למנוע איבוד יתר של חום הגוף.
4. קנה הנשימה Instillations
- הכן תמיסת מלח intratracheal מורכבת 140 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ"מ CaCl 2, ו -10 מ"מ HEPES; pH = 7.4. Osmolality של פתרון זה צריך להיות319 mosmol / ק"ג H 2 O.
- הר מורדם חיות הגחון כלפי מעלה על לוח כירורגית משופע באמצעות פלסטר. Ensurethat הראשי של החיות יהיו בחלק העליון של המדרון.
- בצע קמצוץ בוהן על מנת להבטיח כי בעלי החיים מורדמים ומוכנים לניתוח. לחטא את כל תחומי הכירורגים, המכשירים, ובאזור החזה של החיה.
- לעשות חתך קטן (3 מ"מ) בהיבט הגחון הקדמי-המדיאלי של הצוואר (אזור הגרון) באמצעות אזמל כירורגי, גודל 11. לדחוק את platysma ו קדמי שרירי קנה נשימה באמצעות מלקחיים קהים כדי להמחיש ולגשת קנה הנשימה.
- להנחיל 3 μl / גרם של משקל (כ 10 - 30 μl נפח סופי) של תמיסת מלח דרך קנה הנשימה החשופה באמצעות מחט 31 G 5/16 אינץ '(8 מ"מ). חתך הקטין נשאר פתוח במהלך הדמיה בעלי חיים בדרך כלל מרפא את עצמו היטב. התייעץ עם החטיבה המקומית של משאבים בעלי חיים כדי לקבוע אם החתך יכול גם להשאיר פתוח. אחר, תפרים רשאייםתצטרך.
5. הדמיה חיים
- מקם את גורי ventrally על מגש הדמיה ברורה תחתון, נשלף, בעלי חיים. מרכז את החיות כך קרן רנטגן תהיה ישירות על אזור החזה.
- עבור קבוצות חית אי-זוגיות, למקם את הגור הראשון ישירות באמצע המגש, ועבור קבוצות זוגיות למקם את הגור הראשון רק משמאל למרכז, כך שכאשר החיות האחרות מונחות על המגש את כל החיות מרוכזות.
- החזר את מגש ההדמיה לקבינט הדמית רנטגן ולסגור את דלת הארון.
- הפעל את יחידת בקרת תרמית חיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים הרדימו. השתמש בהגדרה הגבוהה כדי להשיג טמפרטורה קאמרית של כ -35 - 37 ° C. הפעל יחידת הרדמה חייה (isoflurane מתאדה שתישלח באמצעות חמצן) כדי להבטיח חיות מורדמות וחסרות תנועה ברחבי משך הליך הדמיה 2 hr.
- פרוטוקול הדמית רנטגן ביצוע
- לחץ על לכידה ובחר את הפרוטוקול המתאים, למשל, "פרוטוקול הדגמת יופיטר," מהתפריט הנפתח Protocol. (ראה איור 8).
- לחץ על כפתור הפרוטוקול הנבחר הפעל על תוכנת הדמיה המולקולרית.
הערה: חלון מוקפץ יופיע כדי לעקוב אחר המצב של רכישת התמונה, כאשר הפרוטוקול הוא להשלים את החלון ייעלם. מינון רנטגן הוא נמוך, <מ -0.3 mRem או על פי 10 פחות מאשר רנטגן שיניים. כפי לנהלי X-Ray אחרים, אין קרינה שיורית. - כאשר פגישת רכישת 2 hr תושלם, להסיר את החיות ממגש ההדמיה ולהחזיר אותם בכלוב שלהם. צג חיות מועד להחלמה מלאה לפני שחזרתי מתל.
6. ניתוח נתונים
הערה: תוכנת הדמיה מולקולרית מאפשרת כימות ובתרגום XRאי עוצמת פיקסל לתוך קצב פינוי נוזל ריאות. השלבים שלהלן מתאר את ההליכים הדרושים כדי לנרמל תמונות רנטגן ולכמת עוצמות באזורים מוגדרים של עניין (ROI).
- עיצוב תבנית ROI
הערה: אזור של תבנית עניין חייב להיווצר ספציפית תמונות רנטגן שנתפסו במהלך המחקר hr 2, ויש להשתמש בהם כדי להשוות עוצמות רנטגן בקרב קבוצות הניסוי. מאז כמויות קטנות של אתגרים מלוחים בדרך כלל לצבור באונה השמאלית העליונה של הריאה 4-6, ההחזר על ההשקעה (ים) צריכה להתמקד בחלק זה של הריאה.- פתח את התמונה רנטגן הראשונה והאחרונה במערכה 2 hr. בחר את החלון של התמונה x-ray הראשון.
- בסרגל הכלים ניווט, בחר ידני-ROIs> ניו ROI סט.
- לחץ אליפסה ROI וליצור ROI כי כראוי מכסה את ההחזר על ההשקעה lung.An השמאלי של העכבר אינו מוגדר עד אדום, התווה ROI הוא dragged למיקום אחר. החזר על השקעה מוגדרת תפורט כחול עם מספר.
- אם גורים מרובים הם צלמו, לחצו על ROI האדום, התווה וגרור כדי לריאות השמאליות של עכברים האחרים כדי ליצור ROIs הבודד יותר באותה הקבוצה. גרור את ההחזר על ההשקעה האדומה, התווה לאזור עם רקע ברור ליצור ROI רקע.
- בחר פוינטר בחירה למקם את ROIs לשכב על כל הריאה השמאלית של עכבר, ישירות תחת הצלעות השניות.
- בסרגל הכלים העליון, לחץ על תצוגה מקדימה.
- בדוק כיסוי בתיבת הדו-שיח הצגת תמונה כדי כיסוי תמונת רנטגן האחרונה תוך שמירה על מקומות ROI הסט. במידת הצורך, בחר פוינטר בחירה בסרגל הכלים הניווט כדי לכוונן את העמדות של ROIs ולהבטיח כיסוי ריאות נאותה בשתי התמונות.
- בתיבת הדו-שיח ROI הידני, בחר תבנית> שמור תבנית. שם tהוא התבנית ולחץ על אישור.
- סגור את שתי התמונות. בחר לא כאשר תתבקש לעשות זאת כדי לשמור את השינויים.
- להחיל את תבנית ROI לכל תמונת רנטגן שנתפסה לנתח אישור נוזל ידי פתיחת כל התמונות שצולמו במהלך המחקר. התחל על ידי בחירת קובץ פתוח ולחץ ROIs ידני> תבנית.
- בחר את תבנית ROI שנוצר בעבר מן התפריט הנפתח ולחץ חל על כל המסמכים להרחיב.
- נתוני ROI נומרית יצוא מהתמונות אל גיליון אלקטרוני
- בפינה השמאלית העליונה, לחץ על קובץ> יצוא נתונים> ROI.
- בדוק כמובא ו- Open Auto ב- Excel בתיבת הדו-שיח המוקפץ.
- בחר פתח את 'מסמכים כל ייצוא.
- שם לקובץ ולחץ על שמור.
- תוכנת הדמיה מולקולרית סגורה.
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8, The National Academies Press. (2011).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).
- Goodson, P., et al. Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).
- McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract. J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).
- Starcher, B., Williams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8. J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).
- Gammon, S. T., et al. Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).
- Takemura, Y., et al. Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).
- Lewis, R. A., et al. Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast. Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).
- Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects. Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפנלים עזבו איורים 9 - 10 הם של ריאות עכבר 10 PN צלמו בתחילת המחקר (טרום החדיר). תמונות אלו מראות החדרה מוצלחת של אתגרים מלוחים לתוך האונה השמאלית של הריאות בילוד. באיור 9, ריאת העכבר הייתה החדירה tracheally עם תמיסת המלח שהוגדרה לעיל (ראה סעיף 2.1). הפאנלים באמצע ומימין איור 9 הם תמונות רנטגן מאותו עכבר השיג 5 דקות ו -2 hr החדרה פוסט; החיה הזאת פינתה את האתגר המלוח בהצלחה. באופן ספציפי, את עוצמת רנטגן של ROI חיות זה עלה מ 187.67 ל 515. לפיכך, קיים מתאם הפוך בין צפיפות פיקסלים ונפח נוזל הריאה; כלומר, את הערך היחסי הגדול יותר, פחות נוזלים יש בתוך הריאות. זה עשוי להיות מועיל כדי להבין יותר אנרגית רנטגן נספגה (ומכאן סכומים מדווחים גדולים) כאשר יש פחות נוזל attenuating תצלום הרנטגן. באיור 10, ריאת העכבר 10 PN הוחדרה tracheally עם תרכובת המכילה גלוטתיון מחומצן (מחדש מלוח המתואר 2.1) כי עכבות אישור נוזל המכתשית של האתגר המלוח ידי חסימת פעילות ערוץ נתרן אפיתל; הערך המספרי של ROI של חיה זו יפחת מן להנחיל טרום-החדיר פוסט קבצי רנטגן צלמו, מעיד על הגדלת אטימות רנטגן. באופן ספציפי, את עוצמת נטו של החיה כ 5 דקות לאחר החדרה הייתה - 64, וירד ל - 182. שוב, שים לב היחס ההפוך בין עוצמת פיקסל ROI וכמות נוזלי הבריאות; נוזלים מוגברים באונה השמאלית העליונה של הריאה פוחתת קליטת רנטגן.
עוצמת נטו הערכה של ROI מאפשרת הערכה כמותית של שינויים בשער של פינוי נוזל ריאות, אם כי רכישת תוכנה גם מאפשר לחוקרים להביעהנתונים במונחים של גרם / ס"מ 3 אם תרצה בכך. יתר על כן, החוקרים יכולים להשתמש כל חית כשליטה משלה לנרמל את כל עוצמות רנטגן לנקודת זמן ראשונית (איו), כגון t = 5 דקות ולדווח שינויים נטו אטימות רנטגן (כלומר, מידה של שינוי בכמויות נוזל ריאות).
איור 1. הגדרות חשיפה. צילום מסך זה ממחיש את גדרות החשיפה המתאימות מנוצלות בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. קובץ הגדרות. צילום מסך זה ממחיש צעד מפתח ביצירת הגדרת קובץ אשר ישמשב פרוטוקול. חלון pop up (כמוצג) יבקש שם חדש לקובץ הגדרות רכישה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הדמיה פרוטוקול. צילום מסך זה ממחיש צעד מפתח בקביעת פרוטוקול הדמיה חדש נוצר בהצלחה. חלון pop up (כמוצג) יופיע שם פרוטוקול חדש יידרש עבור הפרוטוקול שנוצר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Protצעדי ocol. צילום מסך זה ממחיש קיצור לשכפל קובץ הגדרות רכישה, הכנס צעד חדש, או למחוק צעד בתוך פרוטוקול הדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הפניה תאורה. צילום מסך זה מציג את פקודת תאורת התייחסות הגדרות מתאימות בתוכנת הדמית החיה המתאימה ליצירת קובץ עזר תאורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. Auto Select אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תיקון איור 7. תאורה. צילום מסך זה ממחיש את היישום המתאים של קובץ עזר תאורה שנוצר לאחר הדמיה חיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. Execute פרוטוקול. צילום מסך זהמדגים כיצד לבצע פרוטוקול שנבחר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות איור 9. רנטגן של ריאות פינת תמונת נציג PN 10 ריאות לפני קבלת אתגר מלוח. (להנחיל-מראש; בחלונית ימנית); 5 דקות-החדרה פוסט (פנל באמצע), ו -2 שעות לאחר האתגר המלוח פינה מן הריאה הבריאה (פנל מימין). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 10. רנטגן תמונות של ריאות מוצפות. Represenתמונת tative של PN 10 ריאות לפני קבלת אתגר מלוח (להנחיל-מראש; בחלונית ימנית) המכיל דיסולפיד גלוטתיון, אשר מעכב תחבורת המומס paracellular; 5 דקות-החדרה פוסט של דיסולפיד גלוטתיון (פאנל באמצע), ו -2 שעות לאחר עיכוב התחבורה paracellular שמוביל הצפה המכתשית (פאנל מימין). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.אין מסנן = חשיפת 10 שניות 0.1mm = חשיפת 15 שניות 0.2mm = חשיפת 20 שניות 0.4mm = חשיפת 30 שניות 0.8mm = חשיפת 30 שניות הגודל של מסנן רנטגן וקושר זמן חשיפה ספציפית crלאכול קובץ עזר תאורה. קובץ טבלת עזר 1. תאורה. קובץ זה מדווח על פי החשיפה המתאימה ליצירת קבצי התייחסות תאורה המבוסס על מסנני רנטגן שימוש במחקרי הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות הדמיית רנטגן, תמונות ברורות של ריאות בילוד ניתן לנתח עבור כרכי נוזל ריאות. 7,3,11 אנחנו, ואחרים 10, ניצלו בהצלחה הדמיה רנטגן כדי לקבוע שינויים דינמיים בכמות הנוזלים ריאות במודלים של בעלי חיים נשימה מורדם בחופשיות, טכניקה זו טומן בחובו הבטחה גדולה לקדם את המחקר של פציעה ריאות בילוד. אחד היתרונות הגדולים של שימוש בגישה שלנו להעריך נפח נוזל ריאות (בניגוד דרך ההנגדה שלב רנטגן 10 למשל) היא כי עד חמישה גורים העכבר PN10 ניתן ללמוד בו זמנית באמצעות מערכת הדמיה כי הוא מקום משותף במתקני מחקר ליבות .
הקניית נפח נוזל ריאה מתאים, כדי לא לטבוע או לכווץ את הריאות, הוא קריטי ליישום המוצלח של פרוטוקול זה ייתכן שיהיה צורך להיחקר באופן ניסיוני לפני פרוטוקולי הדמית רנטגן יכולים להיות מיושמים. הרגישות של assay זה מאפשר זיהוי של volum קטן מאודes של מלוחים החדירו באמצעות זיהוי רנטגן. הצלחנו להבחין בהבדלים אטימות רנטגן של הריאות בילוד החדירו עם 10 כרכים μl של תמיסת מלח. ההבדל ועכירות רנטגן הם בולטים במיוחד מעכבי ערוץ נתרן מוכנסים האווירי המכתשית כי האתגרים המלוחים לא יכולים להיספג והריאות להמשיך להפריש נוזל לתוך המרחב האווירי. במקרה נפח גבוה בצורה בלתי הולם של מלוחים הוא הציג, הצבת חיות לתוך תא ההדמיה עם זורם חמצן לתוך התא דרך נמלי ההרדמה יכול להקל נשימה וריאות מוצפות.
התוצאות שלנו באמצעות הדמיית רנטגן ניתנות להשוואה למכירות חיסול של נוזל המכתשית נמדדה באמצעות גישות קונבנציונליות יותר, כגון ריאות רטובים אל יבש יחסי משקל הכחול של האוון לקביעת חלבון ריכוז 4. כעת אנו מראים כי גישה זו ניתן ליישם את גור עכבר בילוד. רנטגן זה imטכניקת הזדקנות לקביעת כרכי נוזל ריאה ניתן לשלב בקלות עם שיטות הדמיה נוספות. למשל, סמנים ניאון או בדיקות bioluminescent ניתן החדירו בו זמנית לתוך alveoli והעריכו. (איתור של בדיקות ניאון ושקוף למחצה תואר 8, והוא מעבר להיקף של דו"ח זה). היכולת לשתף לרשום את נפח נוזל ריאות (באמצעות הדמיית רנטגן) לצד היכולת לזהות סמני ניאון היא אחד מכמה יתרונות שימוש assay הדינמיקה הזאת ואת המערכת המסחרית למדידת אישור נוזל ריאות. יתרונות נוספים של ניצול גישה זו לקביעת אישור ונפח נוזל ריאות ביחס כוללים את היכולת לנהל מחקרים ארוכים טווח (וכך להקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי להשיג תצפיות מובהקות סטטיסטי), ואת היכולת לזהות שינויים קטנים בכמות נוזלי ריאות נושמות בחופשיות , מורדם, גורי עכבר בילוד. מגבלה אחת של שימושבגישת הדמית vivo, לעומת זאת, הוא כי ההרדמה יכולה לשנות את חלוקת גז זרימת דם בתוך הריאות. חוסר התאמה ב אוורור זלוף (V / Q) ו הסטה הוכחה להגדיל בהרדמה ב מתנדב בוגרים בריאים 12, ובכך להקטין חמצון של הגוף. השפעה שלילית זו, לעומת זאת, יכולה להיות מתוגמלת על ידי הגדלת ריכוז חמצן ההשראה. מנקודת מבט טכני, שונה בין מערכות הדמיה באנרגית שטף רנטגן עשוי לדרוש אופטימיזציה של כל מערכת לפני ביצוע בדיקות הדמיה. לדוגמא, על מערכת עם מקור רנטגן עם יותר שטף ו / או גלאי עם יעילות קוונטית נעלה ממנו, ו גבוה / להפסיק ומדינת binning נמוכה עשויה לספק איכות תמונה טובה יותר כאשר מעריך שינוי קטן עכבת רנטגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מאמר זה הוא חלק של גיליון מיוחד בנושא מולטימודליות טרום קליני הדמיה, בחסות Bruker Biospin.
Materials
Name Company Catalog Number Comments Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO) Bruker; Billerica, MA Ketamine Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA 26637-411-01 Xylazine Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA 4821 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium) Lonza; Walkersville, MD 17-513F Sodium chloride Amresco; Solon, OH 241 Potassuim chloride Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ P217-3 Calcium chloride Sigma-Aldrich; St. Loius, MO C5080 HEPES Sigma-Aldrich; St. Loius, MO H3375 0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ 328438 References
Tags
רפואה גיליון 113 ריאות ילודים,
