Real-time X-ray Imaging af Lung Fluid Mængder i Neonatal Mouse Lung

Abstract

Ved fødslen lungen undergår en dybtgående fænotypisk skift fra sekretion til absorption, som giver mulighed for tilpasning til vejrtrækning uafhængigt. Fremme og bevarelse af denne fænotype er kritisk vigtigt i normal alveolær vækst og gasudveksling gennem hele livet. Adskillige in vitro-undersøgelser har karakteriseret den rolle, centrale regulatoriske proteiner, signalmolekyler, og steroid hormoner, der kan påvirke hastigheden af lungevæske clearance. Men in vivo prøver skal udføres for at vurdere, om disse regulatoriske faktorer spiller vigtige fysiologiske roller i reguleringen perinatal lunge væskeabsorption. Som sådan kan udnyttelsen af ​​tidstro røntgenbilleder bestemme perinatal lungevæske clearance, eller lungeødem, repræsenterer et teknologisk fremskridt på området. Heri forklarer vi og illustrere en tilgang til at vurdere graden af ​​alveolær lungevæske clearance og alveolær oversvømmelser i C57BL / 6 mus ved postnatal dag 10 osing røntgenafbildning og analyse. En vellykket gennemførelse af denne protokol kræver forudgående godkendelse fra institutionelle dyr pleje og brug udvalg (IACUC), en in vivo små dyr X-ray imaging system, og kompatible molekylær imaging software.

Introduction

Ved fødslen skal den nyfødte lunge overgangen fra et fluid secernerende til en fluid reabsorbing organ til at etablere tilstrækkelig ventilation og iltning af kroppen. De mekanismer, der letter (eller hindrer) effektiv clearance af lunge væske på tidspunktet for fødslen fortsat uklare. Modeling hastigheden af ​​alveolære væske clearance i C57BL / 6 nyfødte museunger vil føre til en bedre forståelse af regulatoriske faktorer, der kan øge eller dæmpe hastigheden af ​​væske absorption. Det kunne også anvendes på andre neonatale modeller af akut lungeskade eller infektion, og kan føre til hidtil ukendte terapeutiske strategier for nyfødte med respiratorisk distress.

Da nyfødte lunger er meget lille i forhold til voksne lunger, kan konventionelle foranstaltninger af alveolær væske clearance der er afhængige af lavage eller gravimetrical målinger ikke være egnet til præcist studere lunge væske clearance i neonatale lunge-modeller. I denne protokol, demonstrerer vi en analyse, der giver mulighed fornøjagtig bestemmelse af alveolære fluid clearance i postnatal dag 10 C57BL / 6 museunger anvendelse af en lille dyr imager. En væsentlig fordel ved at bruge en fluoroskopisk fremgangsmåde er, at dyrene afbildes in vivo. De er frit trække vejret og kan komme fra denne minimalt invasiv assay for fremtidig observation og undersøgelse. Det overordnede mål med denne metode er at modellere lungeødem hos nyfødte lunge, og vurdere hastigheden af ​​alveolær væske clearance i neonatal lunge. Denne teknik blev udviklet, delvis som en strategi reduktion for at reducere antallet af dyr, der er nødvendige, men maksimere eksperimenterende output. Denne teknik giver også mulighed for bedre påvisning af lunge væske volumen ved hjælp af X-ray imaging og kræver færdigheder i grundlæggende dyr tilbageholdenhed og håndtering ^1; lille dyr indgreb og luftrør inddrypning ^2, et lille dyr billeddanner, og grundlæggende billedanalyse-software. Undersøgere, der ønsker at evaluere lunge væskevolumener in vivo (frit breathing bedøvet dyremodeller), kan finde denne procedure er egnet til deres ansøgning. Endelig kunne denne protokol forøge andre eksisterende modeller af neonatal lungeskader anvendt i mekanistisk forsøg af bronkopulmonal dysplasi, herunder hyperoxi-induceret lungeskade, mekanisk ventilation, og modeller af lungebetændelse ^tre.

Protocol

Alle eksperimentelle teknikker skal udføres i overensstemmelse med en institution og brug udvalgets retningslinjer.

1. X-ray Imaging Acquisition

1. Software Oversigt (Se figur 1 for en oversigt over Software Settings).
   1. Vælg knappen Capture direkte under fanen Filer.
   2. I Indstillinger rullemenuen Vælg Aktuel session.
   3. Vælg Standard Eksponering i drop-down boksen placeret under Exposure Time.
   4. Indstil Eksponeringstid til 2,00 min, og nr Engagementer med en. Sæt X Binning og Y Binning til 2 pixels. Se figur 1.
   5. Vælg Final Ophobning fra Eksportindstillinger rullemenuen.
   6. I Illumination indstillinger, select X-Ray fra Illumination Source rullemenuen. Standard KVP er fastsat til 35.
   7. Vælg Autoselect i Anvend reference File rullemenuen til at anvende tilsvarende X-ray henvisning fil. (Se afsnit 2).
   8. I Indstil kamera til indstillingerne skal du indstille f-stop til 2,51.
   9. Indstil FOV (Field of View) til 125,64 for PN10 mus.
   10. Indstil Focal Plane til 13, og i drop-down menuen ved siden af skyderen Focal Plane, vælge X-Ray.
   11. For røntgenstråler, indstille Excitation Filter og Emission Filter til 0 i drop-down menuen.
   12. Spar nuværende session ved at klikke Ny på toppen ved siden af Indstillinger. Indtast navn for New Acquire Indstillinger Filer, fx "Jove enkelt eksponering begivenhed for at gøre en protokol." Se figur 2.
   13. Oprettelse af en X-ray Imaging Protocol
       1. Klik på knappen Opret / Rediger protokoller på højre side af det åbne vindue.
       2. Som ny protokol pop-up vindue vises, skal du klikke på knappen Ny i øverste højre hjørne
       3. Indtast navnet, at protokollen vil spare under, for eksempel "Jove Demo-protokollen", og klik på OK. (Se figur 3).
       4. På bunden af protokollen pop-up vindue i protokol, at trin 1 er fremhævet med rød tekst, Capture Nye billeder er valgt, og ikke gør noget er valgt i Før Billedoverførsel drop down menu.
       5. I Capture Setting Vælg den nyligt genererede enkelt eksponering begivenhed fra trin 1.1.12.
       6. Vælg Vent (sek) fra Efter Billedoverførsel rullemenuen.
       7. Klik på knappen Rediger, type 180 i pop-up box, og klik på OK for at tilføje en 3 min ventetid efter hver 2 min erhvervelse.
       8. Duplicate trin 1 ved at højreklikke på fanen Trin 1 og vælge Duplicate Step. Opret 23 dubletter for en 2 timers observationsperiode. (Se figur 4).
       9. På det sidste trin (trin 24), ændrer Efter Billedoverførsel indstilling til at gøre noget fra Wait (sek).
       10. Klik på knappen Gem og afslut protokollen Editor.

   2. Belysning reference filer

   Bemærk: Anvend X-ray belysning referencefiler til en X-ray billede for automatisk korrigere for variationer i detektor ensartethed røntgenbilleder opnået gennem hele forsøget. Procedurerne beskrevet nedenfor er specifikke for Bruker In vivo Animal Imaging Systems; andre in vivo billeddannende systemer kananvendes.

   1. Generer en belysning henvisning fil ved at åbne molekylær billeddannelse softwaren og klikke på knappen Capture.
   2. Brug af pop-up-menuen, etablere capture indstillinger X-ray i Illumination Source (se foreslåede indstillinger i afsnit 1 ovenfor), og vælg derefter Belysning reference i den type eksponering. Dette kan findes under Standard Engagementer drop down boks. (Se figur 5).
   3. Fjern alle prøver fra billedet station. Sæt X og Y binning til 4 x 4 binning. Se Tabel 1: Belysning referencefil eksponeringstider for at bestemme den præcise eksponeringstid.
   4. Tryk Expose.
   5. Påfør henvisningen fil ved at vælge Automatisk valg fra drop-menuen down under Anvend reference fil. (Se figur 6). Belysningen henvisning fil vil nu blive automatisk på alle røntgen imaldre taget med de samme kameraindstillinger. Trin 2,1-2,4 behøver ikke at blive gentaget, hvis samme kameraindstillinger udnyttes i efterfølgende eksperimenter.
      Bemærk: En belysning henvisning fil kan anvendes efter erhvervelsen billede, eller hvis der vises en fejlmeddelelse, efter automatisk valg af referencefiler. Påfør belysning henvisning filer post-billedoptagelse ved hjælp af følgende række kommandoer i navigationspanelet i molekylær billeddannelse software: Billede> Billede Math> Type: Opgave> Beregn: Belysning korrektion. Vælg input billedet (X), som du ønsker at anvende belysningen henvisning fil (Y) til. Omdøb den korrigerede fil (Z). (Se figur 7).

   3. Animalske Håndtering

   1. Erhvervelse Dyr
      1. Køb gravide dæmninger fra kommercielle opdrættere eller avle hunmus i hus på 12 uger (eller ældre) i overensstemmelse med den institutionelle retningslinjes.
      2. House nyfødte mus med ammende mødre op til postnatal dag (PN) 10.
   2. Animal Anæstesi (PN 10)
      1. Forbered en ketamin / xylazin cocktail at bedøve PN 10 mus i længere bedøvende virkninger varer op til 40 min. Der tilsættes 500 pi ketamin (100 mg / ml) til 75 pi Xylazin (100 mg / ml). Fortynd 1:10 i en 0,9% saltvandsopløsning til at gøre en ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) anæstesi cocktail.
      2. Afveje nyfødte mus.
      3. Ved hjælp af en 3/10 sprøjte med en 31 G 5/16 inch (8 mm) nål, administrere 10 pl / g legemsvægt af anæstesi med en intraperitoneal injektion.
      4. Hold dyr tørt og isoleret for at forhindre overdreven tab af kropsvarme.

   4. Trakeal instillationer

   1. Der laves en intratracheal saltopløsning bestående af 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM _CaCl2 og 10 mM HEPES; pH = 7,4. Osmolalitet denne opløsning bør være319 mosmol / kg H ₂ O.
   2. Mount bedøvede dyr ventrale side op på en skrånende kirurgisk bord ved hjælp kirurgisk tape. Ensurethat dyrenes hoveder er på toppen af ​​skråplanet.
   3. Udfør en tå knivspids for at sikre, at dyrene er bedøvede og klar til operation. Desinficer alle kirurgiske områder, instrumenter, og thorax region af dyret.
   4. Lave en lille (3 mm) incision i anterior-mediale ventrale aspekt af halsen (hals område) ved anvendelse af en kirurgisk skalpel, størrelse 11. Tryk ophæves platysma og forreste tracheale muskler ved hjælp stumpe pincet for at visualisere og få adgang til luftrøret.
   5. Indgyde 3 pl / g vægt (ca. 10 - 30 pi endelige volumen) saltopløsning via den eksponerede luftrøret under anvendelse af en 31 G 5/16 inch (8 mm) nål. Den mindre snit er åben under dyr billedbehandling og normalt helbreder sig selv godt. Rådfør med lokale afdeling af Animal Resource at afgøre, om snittet ligeledes kan stå åben. Ellers kan suturervære påkrævet.

   5. Animal Imaging

   1. Placer hvalpene ventralt på en klar bund, aftagelig, dyr imaging bakke. Centrere dyrene således at røntgenstrålen vil være direkte over thorax område.
   2. For ulige dyr kohorter, placere den første hvalp direkte i midten af ​​bakken, og for endnu nummererede kohorter placere den første hvalp lige til venstre for midten, så når de andre dyr er placeret på bakken alle dyrene er centreret.
   3. Returnere den billeddannende bakken til X-ray imaging kabinet og lukke lågen.
   4. Tænd dyret termisk styreenhed at opretholde de bedøvede dyr 'kropstemperatur. Brug høje indstilling for at opnå et kammer temperatur på ca. 35 - 37 ° C. Slå dyr anæstesi enhed (fordampet isofluran leveret via oxygen) for at sikre dyrene bedøves og immobiliseres under hele varigheden af ​​2 timer imaging procedure.
   5. Udfører X-ray imaging-protokol
      1. Klik på Capture og vælg den relevante protokol, fx "Jove Demo-protokollen," fra protokollen rullemenuen. (Se figur 8).
      2. Klik på Udfør valgte protokol knappen på molekylær billeddannelse software.
         Bemærk: En pop op-vindue vises for at spore status for erhvervelse billedet, når protokollen er færdig vinduet forsvinder. X-ray dosis er lav, <end 0,3 mrem eller cirka 10 gange mindre end en dental røntgen. Som med andre X-Ray procedurer, er der ingen tilbageværende stråling.
      3. Når 2 hr erhvervelse session er afsluttet, fjernes dyrene fra imaging bakken og returnere dem til deres bur. Overvåg dyr til fuld helbredelse før han vendte tilbage til stativer.

   6. Data Analysis

   Bemærk: Molekylær billeddannelse software giver mulighed for kvantificering og oversættelse af Xray pixel intensitet i hastigheden af ​​lungevæske clearance. Nedenstående trin skitsere procedurer er nødvendige for at normalisere røntgenbilleder og kvantificere intensiteter i definerede områder af interesse (ROI).

   1. Design en ROI skabelon
      Bemærk: En region af interesse skabelon skal skabes specifik for de tilfangetagne røntgenbilleder under 2 hr studiet, og skal bruges til at sammenligne X-ray intensiteter blandt eksperimentelle grupper. Eftersom små volumener saltvand udfordringer typisk akkumuleres i venstre øvre lap af lungen ^4-6 bør ROI (er) fokusere på denne del af lungen.
      1. Åbne den første og sidste røntgenbillede i 2 timer sæt. Vælg vinduet i den første røntgenbillede.
      2. I værktøjslinjen Navigation, vælge Manuel-ROI'er> Ny ROI Set.
      3. Klik ROI Ellipse og skabe en ROI der i tilstrækkelig grad dækker musens venstre lung.An ROI er ikke defineret, indtil den røde, skitserede ROI er dragged til en anden position. En defineret ROI vil blive skitseret i blå med et nummer.
      4. Hvis flere hvalpe er afbildet, skal du klikke på den røde, skitserede ROI og træk til venstre lunger de andre mus til at skabe mere individuel ROIs i det samme sæt. Træk den røde, skitserede ROI til et område med en klar baggrund for at skabe en baggrund ROI.
         1. Vælg Pointer Valg at placere ROI'er at ligge over hver musens venstre lunge, direkte under den anden ribben.
      5. I den øverste værktøjslinje, skal du klikke på displayet.
      6. Check overlay i dialogboksen displayet at overlejre det sidste røntgenbillede samtidig med at de indstillede ROI steder. Vælg om nødvendigt Pointer Valg i værktøjslinjen Navigation til at justere holdninger ROI'er og sikre tilstrækkelig lunge dækning i begge billeder.
      7. I manuel dialogboksen ROI, vælge Skabelon> Gem i skabelon. Navn than skabelon og klik på OK.
      8. Luk begge billeder. Vælg Nej, når du bliver bedt om at gemme ændringerne.
      9. Påfør ROI skabelon til hver røntgenbillede fanget at analysere væske clearance ved at åbne alle billeder taget i løbet af undersøgelsen. Start med at vælge en åben fil, og klik Manuelle ROI'er> Skabelon.
      10. Vælg den tidligere oprettede ROI skabelon fra rullemenuen og klik på Anvend til alle åbne dokumenter.
   2. Eksport Numerisk ROI data fra billeder til et regneark
      1. I øverste venstre hjørne, klikke på Filer> Eksporter data> ROI.
      2. Kontrollér som vist og Auto Åbn i Excel i pop-up dialogboks.
      3. Vælg Eksporter alle åbne dokumenter.
      4. Navngiv filen, og klik på Gem.
      5. Luk molekylær billeddannelse software.

Representative Results

De venstre paneler i figur 9 - 10 er af PN 10 muselunger afbildes ved baseline (pre-indpodet). Disse billeder viser vellykket instillation af saltvand udfordringer i den venstre lap af de neonatale lunger. I figur 9, blev musen lunge trakealt indpodet med saltopløsningen ovenfor definerede (se afsnit 2.1). Den midterste og højre paneler af figur 9 er røntgenbilleder fra samme mus opnået 5 min og 2 timer efter instillation; dette dyr havde held ryddet saltvand udfordring. Specifikt røntgen- intensiteten af ​​dette dyr ROI steg fra 187,67 til 515. Der er således en omvendt korrelation mellem pixeltæthed og volumen lungevæske; dvs., jo større den relative værdi, jo mindre væske der er i lungerne. Det kan være nyttigt at forstå, at flere X-ray energi absorberes (dermed et større rapporterede værdi), når der er mindre flydende attenuating X-ray. I figur 10 blev PN 10 muselunge trakealt indpodet med en forbindelse indeholdende oxideret glutathion (rekonstitueret i saltvand beskrevet i 2.1), der inhiberede alveolær fluid clearance af saltvand udfordring ved at blokere epitel- natriumkanalaktivitet; den numeriske værdi af denne dyrets ROI vil falde fra det præ-Instill og post-indpodet X-ray afbildede filer, indikerer stigende røntgenopaciteten. Konkret nettointensitet af dyret ca. 5 minutter efter instillation var - 64, og faldt til - 182. Igen, bemærk det omvendte forhold mellem ROI pixel intensitet og mængden af ​​væske i lungerne; øget væske i øverste venstre lap af lungen dæmper X-ray absorption.

Evaluering netto intensiteten af ​​ROI muliggør kvantitative evaluering af ændringer i hastigheden af ​​lunge væske clearance, omend erhvervelse software også giver efterforskerne til at udtrykkedata i form af g / ^cm3, hvis det ønskes. Desuden kan efterforskerne bruge hvert dyr som sin egen kontrol og normalisere alle X-ray intensiteter til en indledende tidspunkt (IO), såsom t = 5 min og rapportere nettoændringer i X-ray opacitet (dvs. et mål for forandring i lunge væskevolumener).

Figur 1. Indstillinger Exposure. Dette skærmbillede illustrerer de relevante indstillinger for eksponering brugt i denne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Indstillinger File. Dette skærmbillede illustrerer et vigtigt skridt i at generere en fil indstilling, der vil blive anvendti en protokol. Et pop up vindue (som vist) vil anmode om et nyt navn til indstillingerne erhvervelse filen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Imaging-protokollen. Dette skærmbillede illustrerer et vigtigt skridt i at afgøre, om en ny imaging protokol er blevet oprettet. Et pop up vindue (som vist) vises, og en ny protokol navn vil blive anmodet for den genererede protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Protocol Trappe. Dette skærmbillede illustrerer en genvej til at duplikere en indstillinger erhvervelse fil, indsætte et nyt skridt, eller at slette et skridt i en imaging-protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Belysning Reference. Dette skærmbillede viser belysningen henvisningen kommando og relevante indstillinger i dyrets imaging software passende til at skabe en belysning henvisning fil. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Vælg automatisk Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Belysning Correction. Dette skærmbillede illustrerer den passende anvendelse af en belysning henvisning fil genereret efter dyr billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8. Udfør protokol. Denne skærmbilledeillustrerer, hvordan til at udføre en valgt protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9. røntgenbilleder af ryddet lunger Repræsentant billede af PN 10 lunger før modtagelse en saltvand udfordring. (Pre-indgyde, venstre panel); 5 minutter efter instillation (midterste panel), og 2 timer efter, at saltvand udfordringen havde ryddet fra den ellers raske lunge (højre panel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10. røntgenbilleder af Oversvømmede Lunger. Repræsentativ billede af PN 10 lunger før modtagelse en saltvandsopløsning udfordring (pre-indgyde, venstre panel), der indeholder glutathion disulfid, som hæmmer paracellulære stoftransport; 5 minutter efter instillation af glutathion disulfid (midterste panel), og 2 timer efter at hæmme paracellulære transport, som fører til alveolær oversvømmelse (højre panel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Ingen filter =	eksponering 10 sek
0,1 mm =	eksponering 15 sek
0,2 mm =	eksponering 20 sek
0,4 mm =	eksponering 30 sek
0.8mm =	eksponering 30 sek
Størrelsen af ​​røntgen- filter korrelerer med et bestemt eksponeringstid for crspise en belysning henvisning fil.

Tabel 1. Belysning reference fil. Denne fil rapporterer de passende eksponeringstid til at generere belysning referencefiler baseret på X-ray filtre, der anvendes i billeddiagnostiske undersøgelser.

Discussion

Brug X-ray imaging, kan klare billeder af neonatale lunger analyseres for lunge væske mængder. Vi ^7,3,11, og andre ^10, har med succes anvendt røntgenbilleder for at bestemme dynamiske ændringer i lunge fluidvolumen i frit vejrtrækning bedøvede dyremodeller, og denne teknik lover godt for at fremme studiet af neonatal lungeskade. En stor fordel i at bruge vores tilgang til at vurdere lunge væske volumen (i modsætning til røntgen fase constrast ¹⁰ for eksempel), er, at op til fem PN10 museunger kan samtidigt undersøges ved hjælp af et billeddannende system, der er fælles sted i forskningsfaciliteter og kerner .

Indgyde en passende lunge væske volumen, for ikke at drukne eller skjule lungerne, er afgørende for en vellykket gennemførelse af denne protokol og skal muligvis eksperimentelt udforsket før X-ray imaging protokoller kan anvendes. Følsomheden af ​​denne analyse giver mulighed for påvisning af meget små volumes af indpodet saltvand via røntgen afsløring. Vi har været i stand til at skelne forskelle i røntgenopaciteten af ​​neonatale lunger indpodet med 10 pi volumener af saltvandsopløsning. Forskellen i X-ray opaciteter er endnu mere udtalt, når natriumkanalblokkere inhibitorer indføres i den alveolære luftrum fordi saltvand udfordringer ikke kan absorberes, og lungerne fortsat secernere fluid ind i luftrummet. I tilfælde af at en uhensigtsmæssig høj volumen saltvand indføres, anbringelse dyr ind afbildningskammeret med oxygen strømmer ind i kammeret via bedøvelsen porte kan lette respiration i oversvømmede lunger.

Vores resultater ved hjælp af X-ray imaging er sammenlignelige med alveolære væske frirum målt med mere konventionelle metoder, såsom lunge våd-til-tørvægt nøgletal og Evan Blue til bestemmelse af protein koncentration ^4. Vi demonstrerer nu, at denne fremgangsmåde kan anvendes på den neonatale mus pup. Denne X-ray imaging teknik til bestemmelse lunge fluidvoluminer kan let kombineres med yderligere billeddannende modaliteter. For eksempel kan fluorescerende markører eller bioluminescerende prober samtidigt instilleres i alveolerne og vurderes. (Påvisning af fluorescerende og luminescerende prober er beskrevet ^8, og ligger uden for rammerne af denne rapport). Evnen til at co-registrere volumenet af lungevæske (ved hjælp af X-ray imaging) sideløbende evnen til at detektere fluorescerende biomarkører er en af ​​flere fordele ved at bruge denne dynamiske assay og det kommercielle system til måling lungevæske clearance. Andre fordele ved at udnytte denne fremgangsmåde til bestemmelse af clearance og relativ lungevæske omfatter evnen til at føre langsgående undersøgelser (således formindsker antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå statistisk signifikante observationer), og evnen til at detektere små ændringer i lunge fluidvolumen i frit vejrtrækning , bedøvede, neonatale mus hvalpe. En begrænsning ved anvendelse af etin vivo-billeddannelse tilgang, er imidlertid, at bedøvelsen kan ændre fordelingen af gas og blodgennemstrømningen i lungerne. Fejlparringer i ventilation og perfusion (V / Q) og rangering er blevet vist at forøge under anæstesi hos raske voksne frivillige ^12, hvilket reducerer iltning af kroppen. Denne negative virkning kan imidlertid kompenseres for ved at forøge indåndede oxygenkoncentration. Fra et teknisk synspunkt, kan variation mellem billeddannende systemer i X-ray flux energi kræver optimering af før udførelse billeddiagnostiske undersøgelser hvert system. For eksempel på et system med en X-ray kilde med mere flux og / eller en detektor med overlegen kvante effektivitet, højere f / stop og lavere binning tilstand kan give bedre billedkvalitet ved vurderingen lille ændring i X-ray impedans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)	Bruker; Billerica, MA
Ketamine	Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA	26637-411-01
Xylazine	Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA	4821
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)	Lonza; Walkersville, MD	17-513F
Sodium chloride	Amresco; Solon, OH	241
Potassuim chloride	Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ	P217-3
Calcium chloride	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	C5080
HEPES	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	H3375
0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle	BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ	328438